A extração de moléculas de glicogênio hepático para determinação da estrutura do glicogênio

Resumo

Uma concentração ótima de sacarose foi determinada para a extração de glicogênio hepático usando centrifugação por gradiente de densidade de sacarose. A adição de uma etapa de ebulição de 10 min para inibir enzimas degradadoras de glicogênio mostrou-se benéfica.

Resumo

O glicogênio hepático é um polímero de glicose hiperramificado que está envolvido na manutenção dos níveis de açúcar no sangue em animais. As propriedades do glicogênio são influenciadas por sua estrutura. Assim, um método de extração adequado que isole amostras representativas de glicogênio é crucial para o estudo dessa macromolécula. Comparado a outros métodos de extração, um método que emprega uma etapa de centrifugação por gradiente de densidade de sacarose pode minimizar o dano molecular. Com base nesse método, uma publicação recente descreve como a densidade da solução de sacarose utilizada durante a centrifugação foi variada (30%, 50%, 72,5%) para encontrar a concentração mais adequada para extrair partículas de glicogênio de uma ampla variedade de tamanhos, limitando a perda de partículas menores. Uma etapa de ebulição de 10 minutos foi introduzida para testar sua capacidade de desnaturar enzimas degradadoras de glicogênio, preservando assim o glicogênio. A menor concentração de sacarose (30%) e a adição da etapa de ebulição foram mostradas para extrair as amostras mais representativas de glicogênio.

Introdução

O glicogênio é um polímero complexo e hiperramificado de glicose encontrado em animais, fungos e bactérias¹. Em mamíferos, o glicogênio hepático funciona como um tampão glicêmico, preservando a homeostase, enquanto o glicogênio muscular atua como um reservatório de glicose de curto prazo para fornecer energia diretamente². A estrutura do glicogênio é frequentemente descrita por três níveis (mostrados na Figura 1): 1. As cadeias lineares são formadas por monômeros de glicose via ligações glicosídicas (1→4)-α, com pontos de ramificação conectados via ligações glicosídicas (1→6)-α; 2. partículas de β altamente ramificadas (~20 nm de diâmetro) que, especialmente em tecidos como o músculo esquelético, atuam como moléculas independentes de glicogênio ^3,4; 3. partículas de glicogênio α maiores (até 300 nm de diâmetro) que consistem em unidades menores de β glicogênio, que são encontradas no fígado⁵, coração⁶ e em algumas espécies não mamíferos⁷. As partículas de α hepáticas de camundongos diabéticos são molecularmente frágeis, com propensão a degradar-se em partículas de β quando dissolvidas em dimetilsulfóxido (DMSO), enquanto as partículas de α de controles não-diabéticos geralmente permanecem inalteradas. Uma hipótese é que essa fragilidade possa exacerbar o pobre balanço glicêmico observado no diabetes, sendo que as partículas frágeis de α potencialmente resultam em maiores proporções da partícula β mais rapidamente degradada 8,9,10,11.

Os métodos tradicionais de extração de glicogênio utilizam as condições relativamente adversas de exposição do tecido hepático a solução alcalina^quente12 ou soluções ácidas como o ácido tricloroacético (TCA)¹³ ou o ácido perclórico (PCA)¹⁴. Embora eficazes em separar o glicogênio de outros componentes do tecido hepático, esses métodos inevitavelmente degradam a estrutura do glicogênio até certo^ponto15,16. Embora esses métodos sejam adequados para a mensuração quantitativa do conteúdo de glicogênio, eles não são ideais para estudos focados na obtenção de informações estruturais sobre o glicogênio devido a esse dano estrutural. Desde o desenvolvimento desses métodos, um procedimento de extração mais suave tem sido desenvolvido que utiliza tampão Tris frio (que inibe a degradação de glucosidase) com ultracentrifugação com gradiente de densidade de sacarose 17,18,19. Com o pH controlado em ~8, este método não submete o glicogênio à hidrólise ácida ou alcalina observada em procedimentos anteriores.

A ultracentrifugação do gradiente de densidade de sacarose do tecido hepático homogeneizado pode separar as partículas de glicogênio da maioria do material celular. Se necessário, purificação adicional pode ser realizada por cromatografia de exclusão de tamanho preparativo, resultando na coleta de glicogênio purificado com proteínas associadas ao glicogênio anexadas²⁰. Embora esse método, com condições mais brandas, tenha maior probabilidade de preservar a estrutura do glicogênio, é difícil evitar que alguma porção do glicogênio seja perdida no sobrenadante, especialmente partículas menores de glicogênio e menos densas¹⁵. Outra causa potencial de perda de glicogênio é que as condições mais brandas permitem alguma degradação enzimática, resultando em rendimentos de glicogênio mais baixos em comparação com métodos de extração mais severos. Pesquisas recentes relataram otimização do método de extração de glicogênio hepático para preservar a estrutura do glicogênio²¹. Aqui, várias concentrações de sacarose (30%, 50%, 72,5%) foram testadas para determinar se concentrações mais baixas de sacarose minimizavam a perda de partículas menores de glicogênio. A justificativa era que a menor densidade permitiria que partículas menores e menos densas penetrassem na camada de sacarose e se agregassem no pellet com o restante do glicogênio.

Neste estudo, os métodos de extração com e sem uma etapa de ebulição de 10 min foram comparados para testar se as enzimas de degradação de glicogênio poderiam ser desnaturadas, resultando na extração de mais glicogênio que também estava livre de degradação parcial. Distribuições de tamanho molecular total e de comprimento da cadeia glicogênica foram usadas para determinar a estrutura do glicogênio extraído, semelhante a uma otimização de extração de amido publicada anteriormente²². Cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) com detecção de índice de refração diferencial (DRI) foi utilizada para obter as distribuições de tamanho do glicogênio, que descrevem o peso molecular total em função do tamanho molecular. A eletroforese de carboidratos assistida por fluoróforos (FACE) foi utilizada para analisar as distribuições de comprimento de cadeia, que descrevem o número relativo de cadeias glicosídicas de cada tamanho (ou grau de polimerização). Este trabalho descreve a metodologia de extração de glicogênio de tecidos hepáticos baseada em estudo prévio de^{otimização21}. Os dados sugerem que o método mais adequado para preservar a estrutura do glicogênio é uma concentração de sacarose de 30% com uma etapa de ebulição de 10 min.

Protocolo

Fígados de camundongos usados para otimizar este procedimento²¹ eram de 12 camundongos machos BKS-DB/Nju (7,2 semanas de idade, ver Tabela de Materiais). O uso de animais foi aprovado pelo Renmin Hospital da Universidade de Wuhan Animal Care and Ethics Committee, IACUC Issue No. WDRM 20181113.

1 Tecidos animais

1. Pesar fígado de camundongo (1-1,8 g de fígado inteiro de cada camundongo).
2. Congelar rapidamente o fígado do rato em azoto líquido e armazená-lo a -80 °C.

2. Preparação do tampão e dos reagentes

1. Preparar tampão de isolamento de glicogênio contendo 5 mM Tris, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM NaF e 5 mM pirofosfato de sódio com água deionizada e ajustar o pH para 8.
2. Preparar solução de sacarose a 30% (p/p) (considerada a mais ideal para o glicogénio hepático²¹).
3. Preparar tampão acetato de sódio (1 M, pH 4,5), tampão ácido acético (0,1 M, pH 3,5), solução de hidróxido de sódio (0,1 M) e cianoborohidreto de sódio (1 M).
4. Preparar a solução de 8-aminopireno-1,3,6-trissulfonato (APTS) adicionando 5 mg de APTS a 50 μL de ácido acético glacial a 15%.
5. Preparar solução de nitrato de amónio contendo 50 mM de nitrato de amónio com azida sódica a 0,02%.

3. Extração de glicogênio (Figura 2)

1. Transferir o tecido hepático congelado (~1 g) para um tubo de 15 mL contendo 6 mL de tampão de isolamento de glicogênio.
2. Mantendo no gelo, homogeneizar o tecido hepático usando um homogeneizador de tecido.
3. Transferir metade da suspensão (3 mL) para um novo tubo e ferver por 10 min (mostrando-se ideal para estudos estruturais de glicogênio²¹). Manter a outra metade da suspensão (3 mL) em gelo para extrair glicogênio contendo proteínas associadas que não estejam desnaturadas.
   NOTA: As amostras não fervidas devem ser sempre mantidas em gelo durante as etapas de extração de glicogênio. Se as proteínas de glicogênio não forem importantes para o estudo, toda a amostra pode passar pela etapa de ebulição de 10 min.
4. Retire uma alíquota de 8 μL de cada tubo, mantenha as alíquotas no gelo e utilize-as para a determinação do teor de glicogénio (ver secção 4).
5. Centrifugar a suspensão restante a 6.000 × g durante 10 min a 4 °C.
6. Transfira os sobrenadantes para tubos de ultracentrífuga e centrifugue-os a 3,6 × 10⁵ g por 90 min a 4 °C.
7. Eliminar os sobrenadantes restantes e ressuspender os pellets em 1,5 mL de tampão de isolamento de glicogênio.
8. Colocar as amostras sobre 1,5 ml de solução de sacarose a 30% em tubos de ultracentrífuga de 4 ml e centrifugar a 3,6 × 10⁵ g durante 2 h a 4 °C.
9. Descarte os sobrenadantes restantes e ressuspenda os pellets em 200 μL de água deionizada.
10. Adicionar 800 μL de etanol absoluto às suspensões e misturar bem para precipitar glicogênio^23,24. Conservar as misturas a -20 °C durante, pelo menos, 1 h para permitir a precipitação.
11. Centrifugar as amostras a 6.000 × g durante 10 min a 4 °C. Descarte os sobrenadantes e ressuspenda os pellets em 200 μL de água deionizada.
12. Repetir este processo de precipitação de etanol 3x e ressuspender a pelota final de glicogênio em 200 μL de água deionizada.
13. Remova uma alíquota de 8 μL de cada tubo para determinação do teor de glicogénio (ver secção 4).
14. Congelar os sobrenadantes restantes em nitrogênio líquido e liofilizar (liofilizar) durante a noite. Conservar as amostras de glicogénio seco no congelador a -20 °C.
    NOTA: As amostras de glicogénio seco devem ser estáveis a -20 °C; no entanto, não há dados que indiquem quanto tempo duram sem mudanças estruturais.

4. Determinação do teor de glicogênio (Figura 3)

1. Adicionar 8 μL dos sobrenadantes de glicogénio (ver secções 3.13 e 3.4), 5 μL de amiloglucosidase (3269 U/ml) e 100 μL de tampão acetato de sódio (1 M, pH 4,5) a um tubo de microcentrífuga e encher o tubo até à marca de 500 μL com água deionizada.
2. Preparar controles que usem água deionizada em vez de amiloglucosidase.
3. Incubar as amostras a 50 °C durante 30 minutos, mantendo os controlos no gelo.
4. Centrifugar a 6.000 × g a 4 °C por 10 min e misturar 300 μL de cada sobrenadante resultante com 1 mL de reagente glucosidase oxidase/peroxidase (GOPOD).
5. Construa uma curva de calibração misturando 300 μL de água denionizada contendo 0, 10, 20, 30, 40 e 50 μg de D-glicose com 1 mL de reagente GOPOD.
6. Incubar as misturas a 50 °C durante mais 30 minutos.
7. Leia a absorbância (510 nm) de cada amostra usando placas de 96 poços (150 μL por poço) usando um espectrofotômetro UV-vis.
8. Subtrair as absorbâncias das amostras controle (sem amiloglucosidase) das absorbâncias das amostras experimentais e, em seguida, calcular o conteúdo de glicogênio com base na curva padrão D-glicose.

5. Rendimento bruto, rendimento de glicogênio e determinação da pureza

1. Para o rendimento bruto, pesar a amostra de glicogénio liofilizado e calcular o rendimento em percentagem do tecido hepático húmido.
   NOTA: Este rendimento deve ser ajustado para corrigir as alíquotas tomadas em cada etapa do teor de glicogénio.
2. Para a pureza do glicogénio, determinar o teor de glicogénio nos pellets finais, tal como descrito na secção 4. Calcular a pureza em percentagem do teor de glicogénio determinado em relação ao rendimento bruto (ver passo 5.1).
3. Para o rendimento de glicogénio, determinar o teor de glicogénio das amostras homogeneizadas sem fervura e antes de qualquer centrifugação, tal como descrito no ponto 4. Calcular o rendimento de glicogénio em percentagem do teor de glicogénio nos pellets finais (ver passo 5.2) em relação ao teor de glicogénio determinado no homogeneizado inicial.

6. Análise das distribuições de comprimento de cadeia (Figura 4)

1. Pesar 0,5 mg de glicogénio liofilizado em tubos de 1,5 ml.
2. Adicionar 90 μL de água deionizada e 1,5 μL de azida sódica (0,04 g/mL) aos tubos.
3. Adicionar 5 μL de tampão ácido acético (0,1 M, pH 3,5) e 2 μL de solução de isoamilase (180 U/mg) aos tubos para desramificar o glicogênio.
4. Incubar as amostras a 37 °C durante 3 h.
5. Adicionar 5 μL de solução de hidróxido de sódio (0,1 M) às amostras para aumentar o pH para 7,0.
6. Congelar as amostras em nitrogênio líquido e liofilizar (liofilizar) durante a noite.
7. Adicionar 2 μL de solução de APTS (5 mg de APTS em 50 μL de ácido acético glacial a 15%) e 2 μL de cianoborohidreto de sódio (1 M) ao glicogénio desramificado liofilizado.
8. Centrifugar as amostras a 4.000 × g por 2 min.
9. Incubar as amostras a 60 °C durante 3 h no escuro.
   NOTA: O tubo pode ser coberto com papel alumínio para proteger o conteúdo da luz.
10. Adicionar 200 μL de água deionizada às amostras e agitá-las até que todo o precipitado esteja dissolvido.
11. Centrifugar as amostras a 4.000 × g por 2 min.
12. Alíquotas de transferência de 50 μL para microfrascos de eletroforese de carboidratos assistidos por fluoróforo (FACE) para análise.
    NOTA: Os dados são mostrados como a abundância relativa de cadeias (desramificadas) (N_de(X)) para cada grau de polimerização (DP, símbolo X).

7. Análise das distribuições moleculares de tamanho (Figura 5)

1. Dissolver 0,5 mg de glicogênio liofilizado em nitrato de amônio 50 mM e azida sódica a 0,02% a 1 mg/mL.
2. Incubar as amostras num termomisturador a 80 °C durante 3 h a 300 rpm.
3. Injectar as amostras num sistema SEC utilizando uma pré-coluna e colunas de 1000 Å e 10.000 Å a 80 °C com um caudal de 0,3 ml/min (ver Tabela de Materiais). Use um detector de índice de refração para determinar o peso relativo das moléculas em cada volume de eluição.
4. Usando padrões pullulan (PSS) com massas molares variando de 342 a 1,22 × 10⁶, plote uma curva de calibração universal SEC para converter o tempo de eluição em R_h (raio hidrodinâmico). Expresse os dados do detector de índice de refração diferencial (DRI) como uma distribuição de peso de SEC w (log R_h) em função de R_h.

Resultados

Embora o procedimento descrito acima seja o mais ótimo (sacarose a 30% com a adição de uma etapa de ebulição de 10min), aqui são fornecidos dados para o glicogênio extraído através de três concentrações de sacarose (30%, 50%, 72,5%), com e sem uma etapa de ebulição, como descrito anteriormente²¹. Seguindo o protocolo, a pureza, o rendimento bruto e o rendimento de glicogênio do glicogênio seco extraído por diferentes condições são apresentados na Tabela 1, repr...

Discussão

Estudos anteriores mostraram que a estrutura do glicogênio é importante por suas propriedades; Por exemplo, o tamanho molecular afeta a taxa de degradação do glicogênio¹⁰, e a distribuição do comprimento da cadeia afeta sua solubilidade²⁶. Para entender adequadamente essas relações, é importante extrair glicogênio com um procedimento que isole, tanto quanto possível, uma amostra representativa e intacta. Os métodos tradicionais de extração utilizavam condiç?...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
8-aminopyrene-1,3,6-trisulfonate (APTS)	SIGMA Aldrich	9341	0.1 M solution
Acetic acid	SIGMA Aldrich	695092	0.1 M, pH 3.5 solution
Agilent 1260 Infinity SEC system	Agilent, Santa Clara, CA, USA		Size-exclusion chromatography (SEC)
BKS-DB/Nju background mice	Nanjing Biomedical Research Institution of Nanjing University
D-Glucose Assay Kit (GOPOD Format)	Megazyme	K-GLUC
Ethylenedinitrilotetraacetic acid (EDTA)	SIGMA Aldrich	431788
Homogenizer	IKA	T 25
Hydrochloric acid	SIGMA Aldrich	2104	0.1 M solution
Hydrochloric acid	SIGMA Aldrich	2104	0.1 M solution
P/ACE MDQ plus system	Ab Sciex, US		Fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis (FACE)
Refractive index detector	Optilab UT-rEX, Wyatt, Santa Barbara, CA, USA)		Size-exclusion chromatography (SEC)
Sodium acetate	SIGMA Aldrich	241245	1 M, pH 4.5 solution
Sodium azide	SIGMA Aldrich	S2002
Sodium chloride	SIGMA Aldrich	S9888
Sodium cyanoborohydride	SIGMA Aldrich	156159	1 M solution
Sodium fluoride	SIGMA Aldrich	201154
Sodium hydroxide	SIGMA Aldrich	43617	0.1 M solution
Sodium nitrate	SIGMA Aldrich	NISTRM8569
Sodium pyrophosphate	SIGMA Aldrich	221368
Sucrose	SIGMA Aldrich	V90016
SUPREMA pre-column, 1,000 and 10,000 columns	Polymer Standards Services, Mainz, Germany		Size-exclusion chromatography (SEC)
Trizma	SIGMA Aldrich	T 1503
Ultracentrifuge tubes	Beckman		4 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 11 x 60 mm