肝糖原分子的提取用于糖原结构测定

摘要

使用蔗糖密度梯度离心法确定提取肝糖原的最佳蔗糖浓度。加入 10 分钟的煮沸步骤以抑制糖原降解酶被证明是有益的。

摘要

肝糖原是一种超支化葡萄糖聚合物，参与维持动物的血糖水平。糖原的性质受其结构的影响。因此，分离代表性糖原样品的合适提取方法对于研究这种大分子至关重要。与其他萃取方法相比，采用蔗糖密度梯度离心步骤的方法可以最大限度地减少分子损伤。基于这种方法，最近的一篇出版物描述了离心过程中使用的蔗糖溶液的密度如何变化（30%、50%、72.5%），以找到最合适的浓度来提取各种尺寸的糖原颗粒，从而限制较小颗粒的损失。引入 10 分钟的煮沸步骤以测试其使糖原降解酶变性的能力，从而保留糖原。最低的蔗糖浓度（30%）和煮沸步骤的加入被证明可以提取最具代表性的糖原样品。

引言

糖原是一种复杂的超支化葡萄糖聚合物，存在于动物、真菌和细菌^{中 1}。在哺乳动物中，肝糖原充当血糖缓冲器，保持体内平衡，而肌糖原充当短期葡萄糖储存器，直接提供能量²。糖原的结构通常用三个层次来描述（如图1所示）:1.线性链由葡萄糖单体通过（1→4）-α糖苷键形成，分支点通过（1→6）-α糖苷键连接;2. 高度支化的β颗粒（直径~20 nm），特别是在骨骼肌等组织中，充当独立的糖原分子^3,4;3. 较大的α糖原颗粒（直径可达 300 nm），由较小的β糖原单元组成，存在于肝脏⁵、心脏⁶ 和一些非哺乳动物^{物种 7} 中。来自糖尿病小鼠的肝α颗粒在分子上是脆弱的，当溶解在二甲基亚砜（DMSO）中时，倾向于降解为β颗粒，而来自非糖尿病对照的α颗粒通常保持不变。一种假设是，这种脆弱性可能会加剧糖尿病中糟糕的血糖平衡，脆弱的α颗粒可能导致更高比例的降解速度更快的β颗粒8,9,10,11。

传统的糖原提取方法利用相对恶劣的条件，将肝组织暴露于热碱性溶液¹²或酸性溶液，如三氯乙酸（TCA）¹³或高氯酸（PCA）¹⁴。虽然这些方法可有效地将糖原与肝组织的其他成分分离，但这些方法不可避免地在一定程度上降解了糖原结构^15,16。尽管这些方法适用于糖原含量的定量测量，但由于这种结构损伤，它们并不适用于专注于获取糖原结构信息的研究。自这些方法开发以来，已经开发了一种更温和的提取程序，该程序利用冷Tris缓冲液（显示可抑制葡萄糖苷酶降解）和蔗糖密度梯度超速离心17,18,19。当pH值控制在~8时，该方法不会使糖原受到先前程序中看到的酸或碱性水解。

蔗糖密度梯度超速离心匀浆肝组织的匀浆肝组织可以从大多数细胞材料中分离糖原颗粒。如有必要，可以通过制备尺寸排阻色谱法进行额外的纯化，从而收集纯化的糖原与附着的糖原^{结合蛋白20}。尽管这种方法在较温和的条件下更有可能保留糖原的结构，但很难防止某些部分糖原在上清液中丢失，尤其是密度较小的糖原^颗粒15。糖原损失的另一个潜在原因是，较温和的条件允许一些酶降解，与更苛刻的提取方法相比，导致糖原产量较低。最近的研究报道了肝糖原提取方法的优化，以保留糖原^的结构21。在这里，测试了各种蔗糖浓度（30%，50%，72.5%），以确定较低的蔗糖浓度是否最大限度地减少了较小糖原颗粒的损失。其基本原理是，较低的密度将允许更小、密度更低的颗粒穿透蔗糖层并与其余的糖原一起聚集在沉淀中。

在这项研究中，比较了有和没有10分钟煮沸步骤的提取方法，以测试糖原降解酶是否可以变性，从而提取出更多没有部分降解的糖原。全分子大小分布和糖原链长分布用于确定提取的糖原的结构，类似于之前发表的淀粉提取优化²²。采用尺寸排阻色谱（SEC）和差示折射率（DRI）检测获得糖原的尺寸分布，将总分子量描述为分子大小的函数。荧光团辅助碳水化合物电泳（FACE）用于分析链长分布，描述了每个给定尺寸（或聚合度）的葡萄糖苷链的相对数量。本文描述了基于先前优化研究²¹从肝组织中提取糖原的方法。数据表明，最适合保存糖原结构的方法是蔗糖浓度为30%，煮沸10分钟。

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研究方案

用于优化该程序^{的小鼠肝脏 21} 来自 12 只雄性 BKS-DB/Nju 背景小鼠（7.2 周龄，参见 材料表）。动物使用经武汉大学人民医院动物护理伦理委员会批准，IACUC号。WDRM 20181113。

1 动物组织

1. 称量小鼠肝脏（每只小鼠1-1.8克整个肝脏）。
2. 将小鼠肝脏迅速冷冻在液氮中，并将其储存在-80°C。

2.缓冲液和试剂的制备

1. 用去离子水制备含有 5 mM Tris、150 mM NaCl、2 mM EDTA、50 mM NaF 和 5 mM 焦磷酸钠的糖原分离缓冲液，并将 pH 调节至 8。
2. 制备30%（w / w）蔗糖溶液（发现最适合肝糖原²¹）。
3. 制备乙酸钠缓冲液（1M，pH 4.5），乙酸缓冲液（0.1M，pH 3.5），氢氧化钠溶液（0.1M）和氰基硼氢化钠（1M）。
4. 通过将 5 mg APTS 加入 50 μL 15% 冰醋酸中来制备 8-氨基芘-1,3,6-三磺酸 （APTS） 溶液。
5. 制备含有50mM硝酸铵和0.02%叠氮化钠的硝酸铵溶液。

3.糖原提取（图2）

1. 将冷冻肝组织（~1 g）转移到含有 6 mL 糖原分离缓冲液的 15 mL 管中。
2. 将其保持在冰上，使用组织均质器使肝组织均质化。
3. 将一半的悬浮液（3mL）转移到新管中并煮沸10分钟（显示最适合糖原结构研究²¹）。将悬浮液的另一半（3mL）放在冰上，以提取含有未变性的相关蛋白质的糖原。
   注意:在糖原提取步骤中，未煮沸的样品应始终保存在冰上。如果糖原蛋白对研究不重要，则整个样品可以进行10分钟的煮沸步骤。
4. 从每个试管中取出 8 μL 等分试样，将等分试样放在冰上，然后用于测定糖原含量（参见第 4 节）。
5. 将剩余的悬浮液在6,000× g 下在4°C下离心10分钟。
6. 将上清液转移到超速离心管中，并在4°C下以3.6×105g离心90分钟。 
7. 弃去剩余的上清液，并将沉淀重悬于1.5mL糖原分离缓冲液中。
8. 将样品分层在4mL超速离心管中的1.5mL30%蔗糖溶液中，并在4°C下以3.6×10^5g离心2小时。 
9. 弃去剩余的上清液，并将沉淀重悬于200μL去离子水中。
10. 向悬浮液中加入 800 μL 无水乙醇并充分混合以沉淀糖原^23,24。将混合物储存在-20°C至少1小时以允许沉淀。
11. 将样品在4°C下以6,000× g 离心10分钟。 弃去上清液并将沉淀重悬于200μL去离子水中。
12. 重复此乙醇沉淀过程 3 次，并将最终糖原沉淀重悬于 200 μL 去离子水中。
13. 从每个试管中取出 8 μL 等分试样用于测定糖原含量（参见第 4 节）。
14. 将剩余的上清液冷冻在液氮中并冷冻干燥（冻干）过夜。将干燥的糖原样品储存在-20°C的冰箱中。
    注意:干燥的糖原样品应稳定在-20°C;然而，没有数据表明它们在没有任何结构变化的情况下持续了多长时间。

4.糖原含量测定（图3）

1. 向微量离心管中加入 8 μL 糖原上清液（参见第 3.13 和 3.4 节）、5 μL 淀粉葡糖苷酶 （3269 U/mL） 和 100 μL 乙酸钠缓冲液（1 M，pH 4.5），并用去离子水填充管至 500 μL 标记。
2. 准备使用去离子水代替淀粉葡糖苷酶的对照。
3. 将样品在50°C孵育30分钟，同时将对照保持在冰上。
4. 在4°C下以6,000× g 离心10分钟，并将300μL每种所得上清液与1mL葡萄糖苷酶氧化酶/过氧化物酶（GOPOD）试剂混合。
5. 通过将含有 0、10、20、30、40 和 50 μg D-葡萄糖的 300 μL 去离子水与 1 mL GOPOD 试剂混合来构建校准曲线。
6. 将混合物在50°C下再孵育30分钟。
7. 使用紫外-可见分光光度计使用 96 孔板（每孔 150 μL）读取每个样品的吸光度 （510 nm）。
8. 从实验样品的吸光度中减去对照样品（无淀粉葡糖苷酶）的吸光度，然后根据D-葡萄糖标准曲线计算糖原含量。

5. 粗产率、糖原产率和纯度测定

1. 对于粗产量，称量冻干糖原样品并计算产量占湿肝组织的百分比。
   注意:应调整该产量以校正每个糖原含量步骤中取出的等分试样。
2. 对于糖原纯度，确定最终沉淀中的糖原含量，如第 4 节所述。计算纯度为测定的糖原含量相对于粗产量的百分比（参见步骤5.1）。
3. 对于糖原产量，如第 4 节所述，在不煮沸的情况下和任何离心之前测定匀浆样品的糖原含量。计算糖原产率为最终沉淀中糖原含量的百分比（参见步骤5.2）与初始匀浆中测定的糖原含量的百分比。

6. 链长分布分析（图4）

1. 在 1.5 mL 管中称取 0.5 mg 冻干糖原。
2. 向试管中加入 90 μL 去离子水和 1.5 μL 叠氮化钠 （0.04 g/mL）。
3. 向试管中加入 5 μL 乙酸缓冲液（0.1 M，pH 3.5）和 2 μL 异淀粉酶溶液 （180 U/mg） 以去除糖原。
4. 将样品在37°C孵育3小时。
5. 向样品中加入 5 μL 氢氧化钠溶液 （0.1 M），使 pH 值升高至 7.0。
6. 将样品冷冻在液氮中并冷冻干燥（冻干）过夜。
7. 向冻干的去支化糖原中加入 2 μL APTS 溶液（50 μL 15% 冰醋酸中的 5 mg APTS）和 2 μL氰基硼氢化钠 （1 M）。
8. 将样品以4,000× g 离心2分钟。
9. 将样品在60°C下在黑暗中孵育3小时。
   注意: 管子可以用铝箔覆盖，以保护内容物免受光线照射。
10. 向样品中加入 200 μL 去离子水并涡旋直至所有沉淀物溶解。
11. 将样品以4,000× g 离心2分钟。
12. 将 50 μL 等分试样转移到荧光基团辅助碳水化合物电泳 （FACE） 微量瓶中进行分析。
    注:数据显示为每个聚合度（DP，符号X）的（去支链）链（N_de（X））的相对丰度。

7. 分子大小分布分析（图5）

1. 将 0.5 mg 冻干糖原溶于 50 mM 硝酸铵和 0.02% 叠氮化钠中，浓度为 1 mg/mL。
2. 将样品在80°C的热混合器中以300rpm孵育3小时。
3. 在80°C下，使用预柱和1000 Å和10,000 Å柱将样品注入SEC系统，流速为0.3 mL / min（参见 材料表）。使用折光率检测器测定每个洗脱体积下分子的相对重量。
4. 使用摩尔质量范围为 342 至 1.22 × 10⁶ 的支链淀粉标准品 （PSS），绘制 SEC 通用校准曲线，将洗脱时间转换为 R_h （流体动力学半径）。将来自微分折光率 （DRI） 检测器的数据表示为 SEC 权重分布 w （log R_h）作为 R_h 的函数。

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结果

虽然上述程序是最佳方法（30%蔗糖加入10min煮沸步骤），但此处提供了通过三种蔗糖浓度（30%、50%、72.5%）提取的糖原的数据，有和没有煮沸步骤，如前所述²¹。根据该方案，表 1给出了不同条件下提取的干糖原的纯度、粗产量和糖原产量，再现自²¹。不同条件下提取的组间粗产量和糖原产量无显著差异。相反，糖原纯度受蔗糖浓度（表

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讨论

先前的研究表明，糖原的结构对其特性很重要;例如，分子大小影响糖原¹⁰的降解速率，链长分布影响其溶解度²⁶。为了正确理解这些关系，重要的是使用尽可能分离代表性和未受损样品的程序提取糖原。传统的提取方法利用热碱性条件或冷酸。虽然这些方法可以有效地将糖原与其他组织成分分离，但这些方法在化学上是苛刻的，并且已被证明会降解糖原的分子?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
8-aminopyrene-1,3,6-trisulfonate (APTS)	SIGMA Aldrich	9341	0.1 M solution
Acetic acid	SIGMA Aldrich	695092	0.1 M, pH 3.5 solution
Agilent 1260 Infinity SEC system	Agilent, Santa Clara, CA, USA		Size-exclusion chromatography (SEC)
BKS-DB/Nju background mice	Nanjing Biomedical Research Institution of Nanjing University
D-Glucose Assay Kit (GOPOD Format)	Megazyme	K-GLUC
Ethylenedinitrilotetraacetic acid (EDTA)	SIGMA Aldrich	431788
Homogenizer	IKA	T 25
Hydrochloric acid	SIGMA Aldrich	2104	0.1 M solution
Hydrochloric acid	SIGMA Aldrich	2104	0.1 M solution
P/ACE MDQ plus system	Ab Sciex, US		Fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis (FACE)
Refractive index detector	Optilab UT-rEX, Wyatt, Santa Barbara, CA, USA)		Size-exclusion chromatography (SEC)
Sodium acetate	SIGMA Aldrich	241245	1 M, pH 4.5 solution
Sodium azide	SIGMA Aldrich	S2002
Sodium chloride	SIGMA Aldrich	S9888
Sodium cyanoborohydride	SIGMA Aldrich	156159	1 M solution
Sodium fluoride	SIGMA Aldrich	201154
Sodium hydroxide	SIGMA Aldrich	43617	0.1 M solution
Sodium nitrate	SIGMA Aldrich	NISTRM8569
Sodium pyrophosphate	SIGMA Aldrich	221368
Sucrose	SIGMA Aldrich	V90016
SUPREMA pre-column, 1,000 and 10,000 columns	Polymer Standards Services, Mainz, Germany		Size-exclusion chromatography (SEC)
Trizma	SIGMA Aldrich	T 1503
Ultracentrifuge tubes	Beckman		4 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 11 x 60 mm