L’extraction des molécules de glycogène hépatique pour la détermination de la structure du glycogène

Résumé

Une concentration optimale de saccharose a été déterminée pour l’extraction du glycogène hépatique à l’aide d’une centrifugation à gradient de densité de saccharose. L’ajout d’une étape d’ébullition de 10 minutes pour inhiber les enzymes dégradant le glycogène s’est avéré bénéfique.

Résumé

Le glycogène hépatique est un polymère de glucose hyperramifié qui est impliqué dans le maintien du taux de sucre dans le sang chez les animaux. Les propriétés du glycogène sont influencées par sa structure. Par conséquent, une méthode d’extraction appropriée qui isole des échantillons représentatifs de glycogène est cruciale pour l’étude de cette macromolécule. Par rapport à d’autres méthodes d’extraction, une méthode qui utilise une étape de centrifugation à gradient de densité de saccharose peut minimiser les dommages moléculaires. Sur la base de cette méthode, une publication récente décrit comment la densité de la solution de saccharose utilisée lors de la centrifugation a été modifiée (30%, 50%, 72,5%) pour trouver la concentration la plus appropriée pour extraire des particules de glycogène de tailles très variées, limitant ainsi la perte de particules plus petites. Une étape d’ébullition de 10 minutes a été introduite pour tester sa capacité à dénaturer les enzymes dégradant le glycogène, préservant ainsi le glycogène. Il a été démontré que la concentration de saccharose la plus faible (30 %) et l’ajout de l’étape d’ébullition permettent d’extraire les échantillons de glycogène les plus représentatifs.

Introduction

Le glycogène est un polymère complexe et hyperramifié de glucose présent chez les animaux, les champignons et les bactéries¹. Chez les mammifères, le glycogène hépatique fonctionne comme un tampon de glucose sanguin, préservant l’homéostasie, tandis que le glycogène musculaire agit comme un réservoir de glucose à court terme pour fournir directement de l’énergie². La structure du glycogène est souvent décrite par trois niveaux (illustrés à la figure 1) : 1. Les chaînes linéaires sont formées par des monomères de glucose via des liaisons glycosidiques (1→4)-α, les points de ramification étant connectés via des liaisons glycosidiques (1→6)-α ; 2. particules de β hautement ramifiées (~20 nm de diamètre) qui, en particulier dans les tissus tels que le muscle squelettique, agissent comme des molécules de glycogène indépendantes ^3,4 ; 3. Particules de glycogène α plus grosses (jusqu’à 300 nm de diamètre) constituées d’unités de glycogène β plus petites, que l’on trouve dans le foie⁵, le cœur⁶ et chez certaines espèces non mammifères⁷. Les particules de α hépatique des souris diabétiques sont moléculairement fragiles, avec une propension à se dégrader en β-particules lorsqu’elles sont dissoutes dans le diméthylsulfoxyde (DMSO), tandis que les particules de α des témoins non diabétiques restent généralement inchangées. L’une des hypothèses est que cette fragilité peut exacerber le mauvais équilibre glycémique observé dans le diabète, les particules de α fragiles pouvant entraîner des proportions plus élevées de particules de β^plus rapidement dégradées 8,9,10,11.

Les méthodes traditionnelles d’extraction du glycogène utilisent les conditions relativement difficiles d’exposition du tissu hépatique à une solution alcaline chaude¹² ou à des solutions acides telles que l’acide trichloracétique (TCA)¹³ ou l’acide perchlorique (PCA)¹⁴. Bien qu’efficaces pour séparer le glycogène des autres composants du tissu hépatique, ces méthodes dégradent inévitablement la structure du glycogène dans une certaine mesure^15,16. Bien que ces méthodes soient adaptées à la mesure quantitative de la teneur en glycogène, elles ne sont pas idéales pour les études axées sur l’obtention d’informations structurelles sur le glycogène en raison de ces dommages structurels. Depuis la mise au point de ces méthodes, une procédure d’extraction plus douce a été mise au point qui utilise un tampon Tris froid (dont il a été démontré qu’il inhibe la dégradation de la glucosidase) avec une ultracentrifugation à gradient de densité de saccharose 17,18,19. Avec un pH contrôlé à ~8, cette méthode ne soumet pas le glycogène à l’hydrolyse acide ou alcaline observée dans les procédures précédentes.

L’ultracentrifugation par gradient de densité de saccharose du tissu hépatique homogénéisé peut séparer les particules de glycogène de la majorité du matériel cellulaire. Si nécessaire, une purification supplémentaire peut être effectuée par chromatographie préparative d’exclusion de taille, ce qui permet de collecter du glycogène purifié avec des protéines associées au glycogène²⁰. Bien que cette méthode, dans des conditions plus douces, soit plus susceptible de préserver la structure du glycogène, il est difficile d’empêcher la perte d’une partie du glycogène dans le surnageant, en particulier les particules de glycogène plus petites qui sont moins denses¹⁵. Une autre cause potentielle de perte de glycogène est que les conditions plus douces permettent une certaine dégradation enzymatique, ce qui entraîne des rendements en glycogène inférieurs à ceux des méthodes d’extraction plus dures. Des recherches récentes ont fait état d’une optimisation de la méthode d’extraction du glycogène hépatique pour préserver la structure du glycogène²¹. Ici, diverses concentrations de saccharose (30 %, 50 %, 72,5 %) ont été testées pour déterminer si des concentrations plus faibles de saccharose minimisaient la perte de particules de glycogène plus petites. La raison en était que la densité plus faible permettrait à des particules plus petites et moins denses de pénétrer dans la couche de saccharose et de s’agréger dans la pastille avec le reste du glycogène.

Dans cette étude, les méthodes d’extraction avec et sans étape d’ébullition de 10 minutes ont été comparées pour tester si les enzymes de dégradation du glycogène pouvaient être dénaturées, ce qui a permis d’extraire plus de glycogène qui était également exempt de dégradation partielle. Les distributions de taille de la molécule entière et les distributions de longueur de la chaîne de glycogène ont été utilisées pour déterminer la structure du glycogène extrait, similaire à une optimisation de l’extraction de l’amidon publiée précédemment²². La chromatographie d’exclusion de taille (SEC) avec détection de l’indice de réfraction différentielle (DRI) a été utilisée pour obtenir les distributions granulométriques du glycogène, qui décrivent le poids moléculaire total en fonction de la taille moléculaire. L’électrophorèse glucidique assistée par fluorophore (FACE) a été utilisée pour analyser les distributions de longueur de chaîne, qui décrivent le nombre relatif de chaînes glucosides de chaque taille donnée (ou degré de polymérisation). Cet article décrit la méthodologie d’extraction du glycogène des tissus hépatiques basée sur l’étude d’optimisation précédente²¹. Les données suggèrent que la méthode la plus adaptée pour préserver la structure du glycogène est une concentration de saccharose de 30% avec un pas d’ébullition de 10 minutes.

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Protocole

Les foies de souris utilisés pour optimiser cette procédure²¹ provenaient de 12 souris mâles de fond BKS-DB/Nju (âgées de 7,2 semaines, voir le tableau des matériaux). L’utilisation d’animaux a été approuvée par le Comité d’éthique et de protection des animaux de l’hôpital Renmin de l’Université de Wuhan, IACUC Issue No. WDRM 20181113.

1 Mouchoirs en papier

1. Peser le foie de souris (1 à 1,8 g de foie entier de chaque souris).
2. Congelez rapidement le foie de souris dans de l’azote liquide et conservez-le à -80 °C.

2. Préparation du tampon et des réactifs

1. Préparez un tampon d’isolement du glycogène contenant 5 mM de Tris, 150 mM de NaCl, 2 mM d’EDTA, 50 mM de NaF et 5 mM de pyrophosphate de sodium avec de l’eau déminéralisée et ajustez le pH à 8.
2. Préparer une solution de saccharose à 30 % (p/p) (qui s’est avérée la plus optimale pour le glycogène²¹ hépatique).
3. Préparer un tampon d’acétate de sodium (1 M, pH 4,5), un tampon d’acide acétique (0,1 M, pH 3,5), une solution d’hydroxyde de sodium (0,1 M) et du cyanoborohydrure de sodium (1 M).
4. Préparer une solution de 8-aminopyrène-1,3,6-trisulfonate (APTS) en ajoutant 5 mg d’APTS à 50 μL d’acide acétique glacial à 15 %.
5. Préparer une solution de nitrate d’ammonium contenant 50 mM de nitrate d’ammonium avec 0,02 % d’azoture de sodium.

3. Extraction du glycogène (Figure 2)

1. Transférez le tissu hépatique congelé (~1 g) dans un tube de 15 mL contenant 6 mL de tampon d’isolement du glycogène.
2. En le gardant sur la glace, homogénéisez le tissu hépatique à l’aide d’un homogénéisateur de tissus.
3. Transférer la moitié de la suspension (3 mL) dans un nouveau tube et faire bouillir pendant 10 min (ce qui s’est avéré optimal pour les études structurales du glycogène²¹). Conservez l’autre moitié de la suspension (3 ml) sur de la glace pour en extraire le glycogène contenant les protéines associées qui ne sont pas dénaturées.
   REMARQUE : Les échantillons non bouillis doivent toujours être conservés sur de la glace pendant les étapes d’extraction du glycogène. Si les protéines de glycogène ne sont pas importantes pour l’étude, l’échantillon entier peut subir l’étape d’ébullition de 10 minutes.
4. Retirez une aliquote de 8 μL de chaque tube, conservez-la sur de la glace et utilisez-la pour déterminer la teneur en glycogène (voir rubrique 4).
5. Centrifuger la suspension restante à 6 000 × g pendant 10 min à 4 °C.
6. Transvaser les surnageants dans des tubes à ultracentrifuger et les centrifuger à 3,6 × 10⁵ g pendant 90 min à 4 °C.
7. Jeter les surnageants restants et remettre les pastilles en suspension dans 1,5 mL de tampon d’isolement du glycogène.
8. Étalez les échantillons sur 1,5 mL de solution de saccharose à 30 % dans des tubes à ultracentrifuger de 4 mL et centrifugez à 3,6 ×^{10 5} g pendant 2 h à 4 °C.
9. Jeter les surnageants restants et remettre les pastilles en suspension dans 200 μL d’eau déminéralisée.
10. Ajouter 800 μL d’éthanol absolu aux suspensions et bien mélanger pour précipiter le glycogène^23,24. Conserver les mélanges à -20 °C pendant au moins 1 h pour permettre les précipitations.
11. Centrifuger les échantillons à 6 000 × g pendant 10 min à 4 °C. Jeter les surnageants et remettre les pastilles en suspension dans 200 μL d’eau déminéralisée.
12. Répétez ce processus de précipitation de l’éthanol 3 fois et remettez en suspension la pastille de glycogène finale dans 200 μL d’eau déminéralisée.
13. Prélever une aliquote de 8 μL de chaque tube pour déterminer la teneur en glycogène (voir rubrique 4).
14. Congeler les surnageants restants dans de l’azote liquide et lyophiliser (lyophiliser) pendant la nuit. Conservez les échantillons de glycogène sec au congélateur à -20 °C.
    REMARQUE : Les échantillons de glycogène sec doivent être stables à -20 °C ; Cependant, il n’y a pas de données pour indiquer combien de temps ils durent sans aucun changement structurel.

4. Détermination de la teneur en glycogène (Figure 3)

1. Ajouter 8 μL de surnageants de glycogène (voir rubriques 3.13 et 3.4), 5 μL d’amyloglucosidase (3269 U/mL) et 100 μL de tampon d’acétate de sodium (1 M, pH 4,5) dans un tube de microcentrifugation et remplir le tube jusqu’à 500 μL d’eau déminéralisée.
2. Préparez des témoins qui utilisent de l’eau déminéralisée au lieu de l’amyloglucosidase.
3. Incuber les échantillons à 50 °C pendant 30 min, tout en gardant les témoins sur glace.
4. Centrifuger à 6 000 × g à 4 °C pendant 10 min et mélanger 300 μL de chaque surnageant obtenu avec 1 mL de réactif glucosidase oxydase/peroxydase (GOPOD).
5. Construisez une courbe d’étalonnage en mélangeant 300 μL d’eau déminéralisée contenant 0, 10, 20, 30, 40 et 50 μg de D-glucose avec 1 mL de réactif GOPOD.
6. Incuber les mélanges à 50 °C pendant 30 min supplémentaires.
7. Lecture de l’absorbance (510 nm) de chaque échantillon à l’aide de plaques à 96 puits (150 μL par puits) à l’aide d’un spectrophotomètre UV-vis.
8. Soustrayez les absorbances des échantillons témoins (sans amyloglucosidase) des absorbances des échantillons expérimentaux, puis calculez la teneur en glycogène en fonction de la courbe standard du D-glucose.

5. Détermination du rendement brut, du rendement en glycogène et de la pureté

1. Pour le rendement brut, peser l’échantillon de glycogène lyophilisé et calculer le rendement en pourcentage du tissu hépatique humide.
   REMARQUE : Ce rendement doit être ajusté pour tenir compte des aliquotes prises à chaque étape de la teneur en glycogène.
2. Pour la pureté du glycogène, déterminer la teneur en glycogène dans les pastilles finales, comme décrit à la section 4. Calculer la pureté en pourcentage de la teneur en glycogène déterminée par rapport au rendement brut (voir l’étape 5.1).
3. Pour le rendement en glycogène, déterminer la teneur en glycogène des échantillons homogénéisés sans ébullition et avant toute centrifugation, comme décrit à la section 4. Calculer le rendement en glycogène en pourcentage de la teneur en glycogène des pastilles finales (voir étape 5.2) par rapport à celui de la teneur en glycogène déterminée dans l’homogénat initial.

6. Analyse des distributions de longueur de chaîne (Figure 4)

1. Peser 0,5 mg de glycogène lyophilisé dans des tubes de 1,5 ml.
2. Ajouter 90 μL d’eau déminéralisée et 1,5 μL d’azoture de sodium (0,04 g/mL) dans les tubes.
3. Ajouter 5 μL de tampon d’acide acétique (0,1 M, pH 3,5) et 2 μL de solution d’isoamylase (180 U/mg) dans les tubes pour débrancher le glycogène.
4. Incuber les échantillons à 37 °C pendant 3 h.
5. Ajouter 5 μL de solution d’hydroxyde de sodium (0,1 M) aux échantillons pour augmenter le pH à 7,0.
6. Congelez les échantillons dans de l’azote liquide et lyophilisez-les pendant la nuit.
7. Ajouter 2 μL de solution d’APTS (5 mg d’APTS dans 50 μL d’acide acétique glacial à 15 %) et 2 μL de cyanoborohydrure de sodium (1 M) au glycogène ramifié lyophilisé.
8. Centrifuger les échantillons à 4 000 × g pendant 2 min.
9. Incuber les échantillons à 60 °C pendant 3 h dans l’obscurité.
   REMARQUE : Le tube peut être recouvert d’une feuille d’aluminium pour protéger le contenu de la lumière.
10. Ajouter 200 μL d’eau déminéralisée aux échantillons et les faire tourbillonner jusqu’à ce que tout précipité soit dissous.
11. Centrifuger les échantillons à 4 000 × g pendant 2 min.
12. Transférez des aliquotes de 50 μL dans des microflacons d’électrophorèse glucidique assistée par fluorophore (FACE) pour analyse.
    NOTE : Les données sont représentées par l’abondance relative des chaînes (déramifiées) (N_de(X)) pour chaque degré de polymérisation (DP, symbole X).

7. Analyse des distributions granulométriques moléculaires (Figure 5)

1. Dissoudre 0,5 mg de glycogène lyophilisé dans 50 mM de nitrate d’ammonium et 0,02 % d’azoture de sodium à 1 mg/mL.
2. Incuber les échantillons dans un thermomélangeur à 80 °C pendant 3 h à 300 tr/min.
3. Injecter les échantillons dans un système SEC à l’aide d’une pré-colonne et de colonnes de 1000 Å et 10 000 Å à 80 °C avec un débit de 0,3 mL/min (voir le tableau des matériaux). Utilisez un détecteur d’indice de réfraction pour déterminer le poids relatif des molécules à chaque volume d’élution.
4. À l’aide d’étalons pullulans (PSS) avec des masses molaires allant de 342 à 1,22 × 10⁶, tracez une courbe d’étalonnage universelle SEC pour convertir le temps d’élution en R_h (rayon hydrodynamique). Exprimez les données du détecteur d’indice de réfraction différentielle (DRI) sous la forme d’une distribution de poids SEC w (log R_h) en fonction de R_h.

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Résultats

Bien que la procédure décrite ci-dessus soit la méthode la plus optimale (30 % de saccharose avec l’ajout d’une étape d’ébullition de 10 minutes), des données sont fournies ici pour le glycogène extrait par trois concentrations de saccharose (30 %, 50 %, 72,5 %), avec et sans étape d’ébullition, comme décrit précédemment²¹. Conformément au protocole, la pureté, le rendement brut et le rendement en glycogène du glycogène sec extrait par différentes conditions sont donnés d...

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Discussion

Des études antérieures ont montré que la structure du glycogène est importante pour ses propriétés ; Par exemple, la taille moléculaire affecte le taux de dégradation du glycogène¹⁰ et la distribution de la longueur de la chaîne affecte sa solubilité²⁶. Pour bien comprendre ces relations, il est important d’extraire le glycogène avec une procédure qui isole, autant que possible, un échantillon représentatif et non endommagé. Les méthodes traditionnelles ...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
8-aminopyrene-1,3,6-trisulfonate (APTS)	SIGMA Aldrich	9341	0.1 M solution
Acetic acid	SIGMA Aldrich	695092	0.1 M, pH 3.5 solution
Agilent 1260 Infinity SEC system	Agilent, Santa Clara, CA, USA		Size-exclusion chromatography (SEC)
BKS-DB/Nju background mice	Nanjing Biomedical Research Institution of Nanjing University
D-Glucose Assay Kit (GOPOD Format)	Megazyme	K-GLUC
Ethylenedinitrilotetraacetic acid (EDTA)	SIGMA Aldrich	431788
Homogenizer	IKA	T 25
Hydrochloric acid	SIGMA Aldrich	2104	0.1 M solution
Hydrochloric acid	SIGMA Aldrich	2104	0.1 M solution
P/ACE MDQ plus system	Ab Sciex, US		Fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis (FACE)
Refractive index detector	Optilab UT-rEX, Wyatt, Santa Barbara, CA, USA)		Size-exclusion chromatography (SEC)
Sodium acetate	SIGMA Aldrich	241245	1 M, pH 4.5 solution
Sodium azide	SIGMA Aldrich	S2002
Sodium chloride	SIGMA Aldrich	S9888
Sodium cyanoborohydride	SIGMA Aldrich	156159	1 M solution
Sodium fluoride	SIGMA Aldrich	201154
Sodium hydroxide	SIGMA Aldrich	43617	0.1 M solution
Sodium nitrate	SIGMA Aldrich	NISTRM8569
Sodium pyrophosphate	SIGMA Aldrich	221368
Sucrose	SIGMA Aldrich	V90016
SUPREMA pre-column, 1,000 and 10,000 columns	Polymer Standards Services, Mainz, Germany		Size-exclusion chromatography (SEC)
Trizma	SIGMA Aldrich	T 1503
Ultracentrifuge tubes	Beckman		4 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 11 x 60 mm