Die Extraktion von Leberglykogenmolekülen zur Glykogenstrukturbestimmung

Zusammenfassung

Für die Extraktion von Leberglykogen wurde mittels Saccharosedichtegradientenzentrifugation eine optimale Saccharosekonzentration bestimmt. Die Zugabe eines 10-minütigen Siedeschritts zur Hemmung von Glykogen-abbauenden Enzymen erwies sich als vorteilhaft.

Zusammenfassung

Leberglykogen ist ein hyperverzweigtes Glukosepolymer, das an der Aufrechterhaltung des Blutzuckerspiegels bei Tieren beteiligt ist. Die Eigenschaften von Glykogen werden durch seine Struktur beeinflusst. Daher ist eine geeignete Extraktionsmethode, die repräsentative Glykogenproben isoliert, für die Untersuchung dieses Makromoleküls von entscheidender Bedeutung. Im Vergleich zu anderen Extraktionsmethoden kann eine Methode, die einen Saccharose-Dichtegradienten-Zentrifugationsschritt verwendet, molekulare Schäden minimieren. Basierend auf dieser Methode wird in einer kürzlich erschienenen Veröffentlichung beschrieben, wie die Dichte der während der Zentrifugation verwendeten Saccharoselösung variiert wurde (30 %, 50 %, 72,5 %), um die am besten geeignete Konzentration zur Extraktion von Glykogenpartikeln einer Vielzahl von Größen zu finden und den Verlust kleinerer Partikel zu begrenzen. Ein 10-minütiger Siedeschritt wurde eingeführt, um seine Fähigkeit zu testen, Glykogen abbauende Enzyme zu denaturieren und so Glykogen zu erhalten. Es wurde gezeigt, dass die niedrigste Saccharosekonzentration (30 %) und die Zugabe des Siedeschritts die repräsentativsten Glykogenproben extrahieren.

Einleitung

Glykogen ist ein komplexes, hyperverzweigtes Glukosepolymer, das in Tieren, Pilzen und Bakterien vorkommt¹. Bei Säugetieren fungiert das Glykogen der Leber als Blutzuckerpuffer und erhält die Homöostase, während das Muskelglykogen als kurzfristiges Glukosereservoir fungiert, um Energie direkt bereitzustellen². Die Struktur von Glykogen wird häufig durch drei Ebenen beschrieben (siehe Abbildung 1): 1. Lineare Ketten werden von Glukosemonomeren über (1→4)-α glykosidische Bindungen gebildet, wobei Verzweigungspunkte über (1→6)-α glykosidische Bindungen verbunden sind; 2. stark verzweigte β Partikel (~20 nm Durchmesser), die, insbesondere in Geweben wie der Skelettmuskulatur, als unabhängige Glykogenmoleküle wirken ^3,4; 3. Größere α Glykogenpartikel (bis zu 300 nm Durchmesser), die aus kleineren β Glykogeneinheiten bestehen, die in der Leber⁵, im Herzen⁶ und in einigen Nicht-Säugetierarten⁷ vorkommen. Leber-α-Partikel von diabetischen Mäusen sind molekular zerbrechlich und neigen dazu, zu β-Partikeln abgebaut zu werden, wenn sie in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst werden, während α Partikel von nicht-diabetischen Kontrollen im Allgemeinen unverändert bleiben. Eine Hypothese ist, dass diese Fragilität den schlechten Blutzuckerhaushalt bei Diabetes verschlimmern kann, wobei die empfindlichen α Partikel möglicherweise zu höheren Anteilen der schneller abbaubaren β Partikel 8,9,10,11 führen.

Herkömmliche Glykogenextraktionsmethoden nutzen die relativ rauen Bedingungen, bei denen das Lebergewebe heißer alkalischer Lösung¹² oder sauren Lösungen wie Trichloressigsäure (TCA)¹³ oder Perchlorsäure (PCA)¹⁴ ausgesetzt wird. Diese Methoden sind zwar wirksam bei der Trennung des Glykogens von anderen Bestandteilen des Lebergewebes, bauen aber unweigerlich die Glykogenstruktur bis zu einem gewissen Grad ab^15,16. Obwohl diese Methoden für die quantitative Messung des Glykogengehalts geeignet sind, sind sie aufgrund dieser strukturellen Schädigung nicht ideal für Studien, die sich auf die Gewinnung struktureller Informationen über das Glykogen konzentrieren. Seit der Entwicklung dieser Methoden wurde ein milderes Extraktionsverfahren entwickelt, bei dem kalter Tris-Puffer (der nachweislich den Glucosidaseabbau hemmt) mit Saccharose-Dichtegradienten-Ultrazentrifugation verwendet^wird 17,18,19. Da der pH-Wert auf ~8 eingestellt ist, wird das Glykogen bei dieser Methode nicht der sauren oder alkalischen Hydrolyse ausgesetzt, die bei früheren Verfahren beobachtet wurde.

Die Saccharose-Dichtegradienten-Ultrazentrifugation von homogenisiertem Lebergewebe kann Glykogenpartikel vom Großteil des Zellmaterials trennen. Falls erforderlich, kann eine zusätzliche Reinigung durch präparative Größenausschlusschromatographie durchgeführt werden, was zur Sammlung von gereinigtem Glykogen mit angehängten Glykogen-assoziierten Proteinen^{führt 20}. Obwohl diese Methode unter milderen Bedingungen die Struktur des Glykogens eher bewahrt, ist es schwierig zu verhindern, dass ein Teil des Glykogens im Überstand verloren geht, insbesondere bei kleineren Glykogenpartikeln, die weniger dicht sind¹⁵. Eine weitere mögliche Ursache für den Glykogenverlust ist, dass die milderen Bedingungen einen gewissen enzymatischen Abbau ermöglichen, was im Vergleich zu härteren Extraktionsmethoden zu niedrigeren Glykogenausbeuten führt. Neuere Forschungen berichteten über die Optimierung der Leber-Glykogen-Extraktionsmethode, um die Struktur von Glykogen²¹ zu erhalten. Hier wurden verschiedene Saccharosekonzentrationen (30 %, 50 %, 72,5 %) getestet, um festzustellen, ob niedrigere Saccharosekonzentrationen den Verlust kleinerer Glykogenpartikel minimieren. Der Grundgedanke war, dass die geringere Dichte es kleineren, weniger dichten Partikeln ermöglichen würde, die Saccharoseschicht zu durchdringen und sich mit dem Rest des Glykogens im Pellet zu aggregieren.

In dieser Studie wurden die Extraktionsmethoden mit und ohne einen 10-minütigen Siedeschritt verglichen, um zu testen, ob Glykogenabbauenzyme denaturiert werden können, was zur Extraktion von mehr Glykogen führt, das auch frei von teilweisem Abbau ist. Zur Bestimmung der Struktur des extrahierten Glykogens wurden ganze Molekülgrößenverteilungen und die Längenverteilungen der Glykogenkette verwendet, ähnlich einer zuvor veröffentlichten Optimierung der Stärkeextraktion²². Die Größenausschlusschromatographie (SEC) mit differentiellem Brechungsindex (DRI) wurde verwendet, um die Größenverteilungen von Glykogen zu erhalten, die das Gesamtmolekulargewicht als Funktion der Molekülgröße beschreiben. Die Fluorophor-gestützte Kohlenhydratelektrophorese (FACE) wurde verwendet, um die Kettenlängenverteilungen zu analysieren, die die relative Anzahl der Glucosidketten jeder bestimmten Größe (oder jedes Polymerisationsgrades) beschreiben. In diesem Artikel wird die Methodik zur Extraktion von Glykogen aus Lebergewebe beschrieben, die auf der vorherigen Optimierungsstudie²¹ basiert. Die Daten deuten darauf hin, dass die Methode, die am besten geeignet ist, um die Glykogenstruktur zu erhalten, eine Saccharosekonzentration von 30 % mit einem 10-minütigen Siedeschritt ist.

Protokoll

Die zur Optimierung dieses Verfahrens verwendeten Mäuseleber²¹ stammten von 12 männlichen BKS-DB/Nju-Hintergrundmäusen (7,2 Wochen alt, siehe Materialtabelle). Die Verwendung von Tieren wurde vom Renmin Hospital of Wuhan University Animal Care and Ethics Committee, IACUC Issue No. WDRM 20181113.

1 Tierische Gewebe

1. Mäuseleber wiegen (1-1,8 g ganze Leber von jeder Maus).
2. Die Mäuseleber schnell in flüssigem Stickstoff einfrieren und bei -80 °C lagern.

2. Herstellung von Puffer und Reagenzien

1. Bereiten Sie einen Glykogenisolationspuffer mit 5 mM Tris, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM NaF und 5 mM Natriumpyrophosphat mit deionisiertem Wasser vor und stellen Sie den pH-Wert auf 8 ein.
2. Bereiten Sie 30%ige (w/w) Saccharoselösung vor (die sich als am optimalsten für Leberglykogen²¹ erwiesen hat).
3. Natriumacetatpuffer (1 M, pH 4,5), Essigsäurepuffer (0,1 M, pH 3,5), Natronlauge (0,1 M) und Natriumcyanoborhydrid (1 M) herstellen.
4. Bereiten Sie 8-Aminopyren-1,3,6-trisulfonat (APTS)-Lösung vor, indem Sie 5 mg APTS zu 50 μl 15%iger Eisessigsäure hinzufügen.
5. Ammoniumnitratlösung mit 50 mM Ammoniumnitrat mit 0,02 % Natriumazid herstellen.

3. Glykogenextraktion (Abbildung 2)

1. Das gefrorene Lebergewebe (~1 g) wird in ein 15-ml-Röhrchen mit 6 ml Glykogenisolationspuffer überführt.
2. Halten Sie es auf Eis und homogenisieren Sie das Lebergewebe mit einem Gewebehomogenisator.
3. Die Hälfte der Suspension (3 ml) wird in ein neues Röhrchen überführt und 10 Minuten lang gekocht (was sich als optimal für Glykogenstrukturstudien erwiesen hat²¹). Bewahren Sie die andere Hälfte der Suspension (3 ml) auf Eis auf, um Glykogen zu extrahieren, das assoziierte Proteine enthält, die nicht denaturiert sind.
   HINWEIS: Ungekochte Proben sollten während der Glykogenextraktion immer auf Eis gelegt werden. Wenn Glykogenproteine für die Untersuchung nicht wichtig sind, kann die gesamte Probe dem 10-minütigen Kochschritt unterzogen werden.
4. Entnehmen Sie ein 8-μl-Aliquot aus jedem Röhrchen, bewahren Sie die Aliquoten auf Eis auf und verwenden Sie sie für die Bestimmung des Glykogengehalts (siehe Abschnitt 4).
5. Die restliche Suspension wird bei 6.000 × g 10 min bei 4 °C zentrifugiert.
6. Die Überstände werden in Ultrazentrifugenröhrchen überführt und bei 3,6 × 10,5g 90 min bei 4 °C zentrifugiert. 
7. Verwerfen Sie die verbleibenden Überstände und resuspendieren Sie die Pellets in 1,5 ml Glykogenisolationspuffer.
8. Die Proben werden über 1,5 ml 30%ige Saccharoselösung in 4-ml-Ultrazentrifugenröhrchen geschichtet und bei 3,6 × 10⁵ g für 2 h bei 4 °C zentrifugiert.
9. Die verbleibenden Überstände werden verworfen und die Pellets in 200 μl deionisiertem Wasser resuspendiert.
10. Den Suspensionen werden 800 μl absolutes Ethanol zugegeben und gut vermischt, um Glykogen^23,24 auszufällen. Lagern Sie die Mischungen mindestens 1 h bei -20 °C, damit sie ausfällen können.
11. Die Proben werden bei 6.000 × g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert. Verwerfen Sie die Überstände und resuspendieren Sie die Pellets in 200 μl deionisiertem Wasser.
12. Wiederholen Sie diesen Ethanolfällungsprozess 3x und resuspendieren Sie das endgültige Glykogenpellet in 200 μl deionisiertem Wasser.
13. Entnehmen Sie ein Aliquot von 8 μl aus jedem Röhrchen, um den Glykogengehalt zu bestimmen (siehe Abschnitt 4).
14. Die restlichen Überstände in flüssigem Stickstoff einfrieren und über Nacht gefriertrocknen (gefriergetrocknet). Lagern Sie die trockenen Glykogenproben im Gefrierschrank bei -20 °C.
    HINWEIS: Die trockenen Glykogenproben sollten bei -20 °C stabil sein. Es gibt jedoch keine Daten darüber, wie lange sie ohne strukturelle Veränderungen andauern.

4. Bestimmung des Glykogengehalts (Abbildung 3)

1. 8 μl der Glykogenüberstände (siehe Abschnitte 3.13 und 3.4), 5 μl Amyloglucosidase (3269 U/ml) und 100 μl Natriumacetatpuffer (1 m, pH 4,5) werden in ein Mikrozentrifugenröhrchen gegeben und das Röhrchen bis zur 500-μl-Markierung mit deionisiertem Wasser gefüllt.
2. Bereiten Sie Kontrollen vor, die deionisiertes Wasser anstelle von Amyloglucosidase verwenden.
3. Die Proben werden 30 Minuten lang bei 50 °C inkubiert, während die Kontrollen auf Eis bleiben.
4. Bei 6.000 × g bei 4 °C 10 min zentrifugieren und 300 μl jedes resultierenden Überstandes mit 1 ml Glucosidase-Oxidase/Peroxidase-Reagenz (GOPOD) mischen.
5. Erstellen Sie eine Kalibrierungskurve, indem Sie 300 μl denionisiertes Wasser mit 0, 10, 20, 30, 40 und 50 μg D-Glucose mit 1 ml GOPOD-Reagenz mischen.
6. Die Mischungen bei 50 °C weitere 30 min inkubieren.
7. Lesen Sie die Absorption (510 nm) jeder Probe mit 96-Well-Platten (150 μl pro Well) mit einem UV-Vis-Spektralphotometer ab.
8. Subtrahieren Sie die Absorptionen von Kontrollproben (ohne Amyloglucosidase) von den Absorptionen der experimentellen Proben und berechnen Sie dann den Glykogengehalt auf der Grundlage der D-Glukose-Standardkurve.

5. Rohölausbeute, Glykogenausbeute und Reinheitsbestimmung

1. Für die Rohausbeute wird die gefriergetrocknete Glykogenprobe gewogen und die Ausbeute als Prozentsatz des feuchten Lebergewebes berechnet.
   HINWEIS: Diese Ausbeute sollte angepasst werden, um die Aliquoten zu korrigieren, die in jedem Glykogengehaltsschritt eingenommen werden.
2. Für die Glykogenreinheit ist der Glykogengehalt in den fertigen Pellets zu bestimmen, wie in Abschnitt 4 beschrieben. Berechnen Sie die Reinheit als Prozentsatz des ermittelten Glykogengehalts im Verhältnis zur Rohausbeute (siehe Schritt 5.1).
3. Für die Glykogenausbeute ist der Glykogengehalt der homogenisierten Proben ohne Kochen und vor jeder Zentrifugation zu bestimmen, wie in Abschnitt 4 beschrieben. Die Glykogenausbeute wird als Prozentsatz des Glykogengehalts in den fertigen Pellets (siehe Schritt 5.2) zu dem im Ausgangshomogenat ermittelten Glykogengehalt berechnet.

6. Analyse der Kettenlängenverteilungen (Abbildung 4)

1. Wiegen Sie 0,5 mg gefriergetrocknetes Glykogen in 1,5-ml-Röhrchen.
2. 90 μl deionisiertes Wasser und 1,5 μl Natriumazid (0,04 g/ml) in die Röhrchen geben.
3. Geben Sie 5 μl Essigsäurepuffer (0,1 m, pH 3,5) und 2 μl Isoamylase-Lösung (180 U/mg) in die Röhrchen, um das Glykogen zu entzweigen.
4. Die Proben werden bei 37 °C für 3 h inkubiert.
5. Geben Sie 5 μl Natronlauge (0,1 m) zu den Proben, um den pH-Wert auf 7,0 zu erhöhen.
6. Die Proben werden in flüssigem Stickstoff eingefroren und über Nacht gefriergetrocknet (lyophilisiert).
7. 2 μl APTS-Lösung (5 mg APTS in 50 μl 15%iger Eisessig) und 2 μl Natriumcyanoborhydrid (1 M) werden zum gefriergetrockneten entzweigten Glykogen gegeben.
8. Zentrifugieren Sie die Proben bei 4.000 × g für 2 min.
9. Die Proben werden bei 60 °C für 3 h im Dunkeln inkubiert.
   HINWEIS: Die Tube kann mit Aluminiumfolie abgedeckt werden, um den Inhalt vor Licht zu schützen.
10. Geben Sie 200 μl deionisiertes Wasser zu den Proben und wirbeln Sie sie, bis sich der gesamte Niederschlag aufgelöst hat.
11. Zentrifugieren Sie die Proben bei 4.000 × g für 2 min.
12. Zur Analyse werden Aliquoten von 50 μl in Mikrofläschchen mit fluorophorunterstützter Kohlenhydratelektrophorese (FACE) überführt.
    ANMERKUNG: Die Daten werden als relative Häufigkeit von (entzweigten) Ketten (N_de(X)) für jeden Polymerisationsgrad (DP, Symbol X) angezeigt.

7. Analyse von Molekülgrößenverteilungen (Abbildung 5)

1. 0,5 mg gefriergetrocknetes Glykogen werden in 50 mM Ammoniumnitrat und 0,02 % Natriumazid bei 1 mg/ml gelöst.
2. Die Proben werden in einem Thermomischer bei 80 °C für 3 h bei 300 U/min inkubiert.
3. Injizieren Sie die Proben in ein SEC-System mit einer Vorsäule und 1000 Å und 10.000 Å Säulen bei 80 °C und einer Flussrate von 0,3 ml/min (siehe Materialtabelle). Verwenden Sie einen Brechungsindexdetektor, um das relative Gewicht der Moleküle bei jedem Elutionsvolumen zu bestimmen.
4. Unter Verwendung von Pullulan-Standards (PSS) mit molaren Massen im Bereich von 342 bis 1,22 × 10⁶ wird eine universelle SEC-Kalibrierkurve aufgetragen, um die Elutionszeit in R _h (hydrodynamischer Radius) umzurechnen. Drücken Sie die Daten des DRI-Detektors (Differential Refractive Index) als SEC-Gewichtsverteilung w (log R_h) als Funktion von R_h aus.

Ergebnisse

Während das oben beschriebene Verfahren für die optimalste Methode (30 % Saccharose unter Zugabe eines 10-minütigen Siedeschritts) gilt, werden hier Daten für Glykogen bereitgestellt, das über drei Saccharosekonzentrationen (30 %, 50 %, 72,5 %) mit und ohne Siedeschritt extrahiert wurde, wie zuvor beschrieben²¹. Gemäß dem Protokoll sind die Reinheit, die Rohausbeute und die Glykogenausbeute von trockenem Glykogen, das unter verschiedenen Bedingungen extrahiert wurde, in Tabelle 1

Diskussion

Frühere Studien haben gezeigt, dass die Struktur von Glykogen wichtig für seine Eigenschaften ist; Zum Beispiel beeinflusst die Molekülgröße die Abbaurate von Glykogen¹⁰ und die Verteilung der Kettenlänge seine Löslichkeit²⁶. Um diese Zusammenhänge richtig zu verstehen, ist es wichtig, Glykogen mit einem Verfahren zu extrahieren, das so weit wie möglich eine repräsentative und unbeschädigte Probe isoliert. Traditionelle Extraktionsmethoden verwendeten entweder he...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
8-aminopyrene-1,3,6-trisulfonate (APTS)	SIGMA Aldrich	9341	0.1 M solution
Acetic acid	SIGMA Aldrich	695092	0.1 M, pH 3.5 solution
Agilent 1260 Infinity SEC system	Agilent, Santa Clara, CA, USA		Size-exclusion chromatography (SEC)
BKS-DB/Nju background mice	Nanjing Biomedical Research Institution of Nanjing University
D-Glucose Assay Kit (GOPOD Format)	Megazyme	K-GLUC
Ethylenedinitrilotetraacetic acid (EDTA)	SIGMA Aldrich	431788
Homogenizer	IKA	T 25
Hydrochloric acid	SIGMA Aldrich	2104	0.1 M solution
Hydrochloric acid	SIGMA Aldrich	2104	0.1 M solution
P/ACE MDQ plus system	Ab Sciex, US		Fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis (FACE)
Refractive index detector	Optilab UT-rEX, Wyatt, Santa Barbara, CA, USA)		Size-exclusion chromatography (SEC)
Sodium acetate	SIGMA Aldrich	241245	1 M, pH 4.5 solution
Sodium azide	SIGMA Aldrich	S2002
Sodium chloride	SIGMA Aldrich	S9888
Sodium cyanoborohydride	SIGMA Aldrich	156159	1 M solution
Sodium fluoride	SIGMA Aldrich	201154
Sodium hydroxide	SIGMA Aldrich	43617	0.1 M solution
Sodium nitrate	SIGMA Aldrich	NISTRM8569
Sodium pyrophosphate	SIGMA Aldrich	221368
Sucrose	SIGMA Aldrich	V90016
SUPREMA pre-column, 1,000 and 10,000 columns	Polymer Standards Services, Mainz, Germany		Size-exclusion chromatography (SEC)
Trizma	SIGMA Aldrich	T 1503
Ultracentrifuge tubes	Beckman		4 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 11 x 60 mm