L'estrazione di molecole di glicogeno epatico per la determinazione della struttura del glicogeno

Riepilogo

È stata determinata una concentrazione ottimale di saccarosio per l'estrazione del glicogeno epatico utilizzando la centrifugazione a gradiente di densità del saccarosio. L'aggiunta di una fase di ebollizione di 10 minuti per inibire gli enzimi che degradano il glicogeno si è rivelata utile.

Abstract

Il glicogeno epatico è un polimero di glucosio iperramificato coinvolto nel mantenimento dei livelli di zucchero nel sangue negli animali. Le proprietà del glicogeno sono influenzate dalla sua struttura. Quindi, un metodo di estrazione adatto che isoli campioni rappresentativi di glicogeno è fondamentale per lo studio di questa macromolecola. Rispetto ad altri metodi di estrazione, un metodo che impiega una fase di centrifugazione a gradiente di densità del saccarosio può ridurre al minimo il danno molecolare. Sulla base di questo metodo, una recente pubblicazione descrive come la densità della soluzione di saccarosio utilizzata durante la centrifugazione sia stata variata (30%, 50%, 72,5%) per trovare la concentrazione più adatta per estrarre particelle di glicogeno di un'ampia varietà di dimensioni, limitando la perdita di particelle più piccole. È stata introdotta una fase di ebollizione di 10 minuti per testare la sua capacità di denaturare gli enzimi che degradano il glicogeno, preservando così il glicogeno. La più bassa concentrazione di saccarosio (30%) e l'aggiunta della fase di ebollizione hanno dimostrato di estrarre i campioni più rappresentativi di glicogeno.

Introduzione

Il glicogeno è un polimero complesso e iperramificato del glucosio che si trova negli animali, nei funghi e nei batteri¹. Nei mammiferi, il glicogeno epatico funziona come un tampone glicemico, preservando l'omeostasi, mentre il glicogeno muscolare agisce come un serbatoio di glucosio a breve termine per fornire energia direttamente². La struttura del glicogeno è spesso descritta da tre livelli (mostrati nella Figura 1): 1. Le catene lineari sono formate da monomeri di glucosio tramite legami glicosidici (1→4)-α, con punti di diramazione collegati tramite legami glicosidici (1→6)-α; 2. particelle β altamente ramificate (~20 nm di diametro) che, soprattutto in tessuti come il muscolo scheletrico, agiscono come molecole indipendenti di glicogeno ^3,4; 3. particelle di glicogeno α più grandi (fino a 300 nm di diametro) costituite da unità di glicogeno β più piccole, che si trovano nel fegato⁵, nel cuore⁶ e in alcune specie non mammiferi⁷. Le particelle di α epatica dei topi diabetici sono molecolarmente fragili, con una propensione a degradarsi in particelle β quando vengono disciolte in dimetilsolfossido (DMSO), mentre α particelle dei controlli non diabetici rimangono generalmente invariate. Un'ipotesi è che questa fragilità possa esacerbare lo scarso equilibrio glicemico osservato nel diabete, con le fragili particelle α che potrebbero comportare percentuali più elevate della particella^β 8,9,10,11 degradata più rapidamente.

I metodi tradizionali di estrazione del glicogeno utilizzano le condizioni relativamente difficili di esposizione del tessuto epatico a una soluzione alcalina calda¹² o a soluzioni acide come l'acido tricloroacetico (TCA)¹³ o l'acido perclorico (PCA)¹⁴. Sebbene siano efficaci nel separare il glicogeno da altri componenti del tessuto epatico, questi metodi degradano inevitabilmente la struttura del glicogeno in una certa misura^15,16. Sebbene questi metodi siano adatti per la misurazione quantitativa del contenuto di glicogeno, non sono ideali per gli studi incentrati sull'ottenimento di informazioni strutturali sul glicogeno a causa di questo danno strutturale. Dallo sviluppo di questi metodi, è stata sviluppata una procedura di estrazione più blanda che utilizza il tampone Tris a freddo (che ha dimostrato di inibire la degradazione della glucosidasi) con ultracentrifugazione a gradiente di densità^del saccarosio 17,18,19. Con il pH controllato a ~8, questo metodo non sottopone il glicogeno all'idrolisi acida o alcalina osservata nelle procedure precedenti.

L'ultracentrifugazione a gradiente di densità del saccarosio del tessuto epatico omogeneizzato può separare le particelle di glicogeno dalla maggior parte del materiale cellulare. Se necessario, un'ulteriore purificazione può essere eseguita mediante cromatografia preparativa ad esclusione dimensionale, con conseguente raccolta di glicogeno purificato con proteine associate al glicogeno²⁰. Sebbene questo metodo, in condizioni più miti, abbia maggiori probabilità di preservare la struttura del glicogeno, è difficile evitare che una parte del glicogeno venga persa nel surnatante, in particolare le particelle di glicogeno più piccole che sono meno dense¹⁵. Un'altra potenziale causa di perdita di glicogeno è che le condizioni più miti consentono una certa degradazione enzimatica, con conseguente minore resa di glicogeno rispetto ai metodi di estrazione più difficili. Recenti ricerche hanno riportato l'ottimizzazione del metodo di estrazione del glicogeno epatico per preservare la struttura del glicogeno²¹. Qui, sono state testate varie concentrazioni di saccarosio (30%, 50%, 72,5%) per determinare se concentrazioni di saccarosio più basse riducessero al minimo la perdita di particelle di glicogeno più piccole. La logica era che la densità inferiore avrebbe permesso alle particelle più piccole e meno dense di penetrare nello strato di saccarosio e aggregarsi nel pellet con il resto del glicogeno.

In questo studio, i metodi di estrazione con e senza una fase di ebollizione di 10 minuti sono stati confrontati per verificare se gli enzimi di degradazione del glicogeno potessero essere denaturati, con conseguente estrazione di più glicogeno che era anche esente da degradazione parziale. Per determinare la struttura del glicogeno estratto sono state utilizzate le distribuzioni delle dimensioni molecolari intere e le distribuzioni della lunghezza della catena di glicogeno, in modo simile a un'ottimizzazione dell'estrazione dell'amido pubblicata in precedenza²². La cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC) con rilevazione dell'indice di rifrazione differenziale (DRI) è stata utilizzata per ottenere le distribuzioni dimensionali del glicogeno, che descrivono il peso molecolare totale in funzione delle dimensioni molecolari. L'elettroforesi dei carboidrati assistita da fluorofori (FACE) è stata utilizzata per analizzare le distribuzioni della lunghezza della catena, che descrivono il numero relativo di catene glucosidiche di ciascuna dimensione (o grado di polimerizzazione). Questo documento descrive la metodologia di estrazione del glicogeno dai tessuti epatici sulla base del precedente studio di ottimizzazione²¹. I dati suggeriscono che il metodo più adatto per preservare la struttura del glicogeno è una concentrazione di saccarosio del 30% con una fase di ebollizione di 10 minuti.

Protocollo

Fegati di topo utilizzati per ottimizzare questa procedura,²¹ provenivano da 12 topi maschi BKS-DB/Nju (7,2 settimane di età, vedere la tabella dei materiali). L'uso degli animali è stato approvato dal Comitato Etico e per la Cura degli Animali dell'Università di Wuhan, IACUC Issue No. WDRM 20181113.

1 Tessuti animali

1. Pesare il fegato di topo (1-1,8 g di fegato intero di ciascun topo).
2. Congelare rapidamente il fegato di topo in azoto liquido e conservarlo a -80 °C.

2. Preparazione del tampone e dei reagenti

1. Preparare un tampone di isolamento del glicogeno contenente 5 mM Tris, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM NaF e 5 mM pirofosfato di sodio con acqua deionizzata e regolare il pH a 8.
2. Preparare una soluzione di saccarosio al 30% (p/p) (risultata ottimale per il glicogeno^{epatico 21}).
3. Preparare tampone in acetato di sodio (1 M, pH 4,5), tampone acido acetico (0,1 M, pH 3,5), soluzione di idrossido di sodio (0,1 M) e cianoboroidruro di sodio (1 M).
4. Preparare una soluzione di 8-amminopirene-1,3,6-trisolfonato (APTS) aggiungendo 5 mg di APTS a 50 μL di acido acetico glaciale al 15%.
5. Preparare una soluzione di nitrato di ammonio contenente 50 mM di nitrato di ammonio con lo 0,02% di sodio azide.

3. Estrazione del glicogeno (Figura 2)

1. Trasferire il tessuto epatico congelato (~1 g) in una provetta da 15 mL contenente 6 mL di tampone per l'isolamento del glicogeno.
2. Tenendolo in ghiaccio, omogeneizzare il tessuto epatico usando un omogeneizzatore per tessuti.
3. Trasferire metà della sospensione (3 mL) in una nuova provetta e far bollire per 10 minuti (dimostrata ottimale per gli studi strutturali del glicogeno²¹). Tenere l'altra metà della sospensione (3 ml) su ghiaccio per estrarre il glicogeno contenente le proteine associate che non sono denaturate.
   NOTA: I campioni non bolliti devono essere sempre tenuti in ghiaccio durante le fasi di estrazione del glicogeno. Se le proteine del glicogeno non sono importanti per lo studio, l'intero campione può subire la fase di ebollizione di 10 minuti.
4. Rimuovere un'aliquota di 8 μL da ciascuna provetta, conservare le aliquote su ghiaccio e utilizzarle per la determinazione del contenuto di glicogeno (vedere paragrafo 4).
5. Centrifugare la sospensione rimanente a 6.000 × g per 10 minuti a 4 °C.
6. Trasferire i surnatanti in provette per ultracentrifuga e centrifugarli a 3,6 × 10⁵ g per 90 minuti a 4 °C.
7. Scartare i surnatanti rimanenti e risospendere i pellet in 1,5 mL di tampone di isolamento del glicogeno.
8. Stratificare i campioni su 1,5 mL di soluzione di saccarosio al 30% in provette da ultracentrifuga da 4 mL e centrifugare a 3,6 × 10⁵ g per 2 ore a 4 °C.
9. Scartare i surnatanti rimanenti e risospendere i pellet in 200 μL di acqua deionizzata.
10. Aggiungere 800 μL di etanolo assoluto alle sospensioni e mescolare bene per far precipitare il glicogeno^23,24. Conservare le miscele a -20 °C per almeno 1 ora per consentire la precipitazione.
11. Centrifugare i campioni a 6.000 × g per 10 minuti a 4 °C. Scartare i surnatanti e risospendere i pellet in 200 μL di acqua deionizzata.
12. Ripetere questo processo di precipitazione dell'etanolo 3 volte e risospendere il pellet di glicogeno finale in 200 μL di acqua deionizzata.
13. Rimuovere un'aliquota di 8 μL da ciascuna provetta per la determinazione del contenuto di glicogeno (vedere paragrafo 4).
14. Congelare i surnatanti rimanenti in azoto liquido e liofilizzare (liofilizzare) per una notte. Conservare i campioni di glicogeno secco nel congelatore a -20 °C.
    NOTA: I campioni di glicogeno secco devono essere stabili a -20 °C; Tuttavia, non ci sono dati che indichino quanto durino senza modifiche strutturali.

4. Determinazione del contenuto di glicogeno (Figura 3)

1. Aggiungere 8 μL di surnatanti di glicogeno (vedere paragrafi 3.13 e 3.4), 5 μL di amiloglucosidasi (3269 U/mL) e 100 μL di tampone in acetato di sodio (1 M, pH 4,5) in una provetta per microcentrifuga e riempire la provetta fino a 500 μL con acqua deionizzata.
2. Preparare controlli che utilizzino acqua deionizzata al posto dell'amiloglucosidasi.
3. Incubare i campioni a 50 °C per 30 minuti, mantenendo i controlli sul ghiaccio.
4. Centrifugare a 6.000 × g a 4 °C per 10 minuti e miscelare 300 μL di ciascun surnatante risultante con 1 mL di reagente glucosidasi ossidasi/perossidasi (GOPOD).
5. Costruire una curva di calibrazione mescolando 300 μL di acqua denionizzata contenente 0, 10, 20, 30, 40 e 50 μg di D-glucosio con 1 mL di reagente GOPOD.
6. Incubare le miscele a 50 °C per altri 30 min.
7. Leggere l'assorbanza (510 nm) di ciascun campione utilizzando piastre a 96 pozzetti (150 μL per pozzetto) utilizzando uno spettrofotometro UV-vis.
8. Sottrarre le assorbanze dei campioni di controllo (senza amiloglucosidasi) dalle assorbanze dei campioni sperimentali, quindi calcolare il contenuto di glicogeno in base alla curva standard D-glucosio.

5. Determinazione della resa grezza, della resa di glicogeno e della purezza

1. Per la resa grezza, pesare il campione di glicogeno liofilizzato e calcolare la resa come percentuale del tessuto epatico umido.
   NOTA: Questa resa deve essere regolata per correggere le aliquote prese in ogni fase del contenuto di glicogeno.
2. Per la purezza del glicogeno, determinare il contenuto di glicogeno nei pellet finali, come descritto nella sezione 4. Calcolare la purezza come percentuale del tenore di glicogeno determinato rispetto alla resa grezza (cfr. punto 5.1).
3. Per la resa di glicogeno, determinare il tenore di glicogeno dei campioni omogeneizzati senza ebollizione e prima di qualsiasi centrifugazione, come descritto al paragrafo 4. Calcolare la resa di glicogeno come percentuale del contenuto di glicogeno nei pellet finali (vedere il punto 5.2) rispetto al contenuto di glicogeno determinato nell'omogenato iniziale.

6. Analisi delle distribuzioni della lunghezza della catena (Figura 4)

1. Pesare 0,5 mg di glicogeno liofilizzato in provette da 1,5 ml.
2. Aggiungere 90 μL di acqua deionizzata e 1,5 μL di sodio azide (0,04 g/mL) nelle provette.
3. Aggiungere 5 μL di tampone acido acetico (0,1 M, pH 3,5) e 2 μL di soluzione di isoamilasi (180 U/mg) alle provette per deramificare il glicogeno.
4. Incubare i campioni a 37 °C per 3 ore.
5. Aggiungere 5 μL di soluzione di idrossido di sodio (0,1 M) ai campioni per aumentare il pH a 7,0.
6. Congelare i campioni in azoto liquido e liofilizzare (liofilizzare) per una notte.
7. Aggiungere 2 μL di soluzione di APTS (5 mg di APTS in 50 μL di acido acetico glaciale al 15%) e 2 μL di cianoboroidruro di sodio (1 M) al glicogeno deramificato liofilizzato.
8. Centrifugare i campioni a 4.000 × g per 2 minuti.
9. Incubare i campioni a 60 °C per 3 ore al buio.
   NOTA: Il tubo può essere coperto con un foglio di alluminio per proteggere il contenuto dalla luce.
10. Aggiungere 200 μL di acqua deionizzata ai campioni e vorticarli fino a quando tutto il precipitato non si è sciolto.
11. Centrifugare i campioni a 4.000 × g per 2 minuti.
12. Trasferire aliquote di 50 μL in microfiale per elettroforesi di carboidrati assistite da fluorofori (FACE) per l'analisi.
    NOTA: I dati sono indicati come l'abbondanza relativa di catene (deramificate) (N_de(X)) per ogni grado di polimerizzazione (DP, simbolo X).

7. Analisi delle distribuzioni dimensionali molecolari (Figura 5)

1. Sciogliere 0,5 mg di glicogeno liofilizzato in 50 mM di nitrato di ammonio e 0,02% di sodio azide a 1 mg/mL.
2. Incubare i campioni in un termomiscelatore a 80 °C per 3 ore a 300 giri/min.
3. Iniettare i campioni in un sistema SEC utilizzando una precolonna e colonne da 1000 Å e 10.000 Å a 80 °C con una portata di 0,3 mL/min (vedere la tabella dei materiali). Utilizzare un rivelatore di indice di rifrazione per determinare il peso relativo delle molecole a ciascun volume di eluizione.
4. Utilizzando gli standard pullulani (PSS) con masse molari comprese tra 342 e 1,22 × 10⁶, tracciare una curva di calibrazione universale SEC per convertire il tempo di eluizione in R_h (raggio idrodinamico). Esprimere i dati del rivelatore dell'indice di rifrazione differenziale (DRI) come distribuzione del peso SEC w (log R_h) in funzione di R_h.

Risultati

Mentre la procedura sopra descritta è per il metodo più ottimale (30% di saccarosio con l'aggiunta di una fase di ebollizione di 10 minuti), i dati sono qui forniti per il glicogeno estratto tramite tre concentrazioni di saccarosio (30%, 50%, 72,5%), con e senza una fase di ebollizione, come descritto in precedenza²¹. Seguendo il protocollo, la purezza, la resa grezza e la resa di glicogeno del glicogeno secco estratto in condizioni diverse sono riportate nella Tabella 1, riprod...

Discussione

Studi precedenti hanno dimostrato che la struttura del glicogeno è importante per le sue proprietà; Ad esempio, la dimensione molecolare influisce sulla velocità di degradazione del glicogeno¹⁰ e la distribuzione della lunghezza della catena influisce sulla sua solubilità²⁶. Per comprendere correttamente queste relazioni, è importante estrarre il glicogeno con una procedura che isoli, per quanto possibile, un campione rappresentativo e non danneggiato. I metodi tradizi...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
8-aminopyrene-1,3,6-trisulfonate (APTS)	SIGMA Aldrich	9341	0.1 M solution
Acetic acid	SIGMA Aldrich	695092	0.1 M, pH 3.5 solution
Agilent 1260 Infinity SEC system	Agilent, Santa Clara, CA, USA		Size-exclusion chromatography (SEC)
BKS-DB/Nju background mice	Nanjing Biomedical Research Institution of Nanjing University
D-Glucose Assay Kit (GOPOD Format)	Megazyme	K-GLUC
Ethylenedinitrilotetraacetic acid (EDTA)	SIGMA Aldrich	431788
Homogenizer	IKA	T 25
Hydrochloric acid	SIGMA Aldrich	2104	0.1 M solution
Hydrochloric acid	SIGMA Aldrich	2104	0.1 M solution
P/ACE MDQ plus system	Ab Sciex, US		Fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis (FACE)
Refractive index detector	Optilab UT-rEX, Wyatt, Santa Barbara, CA, USA)		Size-exclusion chromatography (SEC)
Sodium acetate	SIGMA Aldrich	241245	1 M, pH 4.5 solution
Sodium azide	SIGMA Aldrich	S2002
Sodium chloride	SIGMA Aldrich	S9888
Sodium cyanoborohydride	SIGMA Aldrich	156159	1 M solution
Sodium fluoride	SIGMA Aldrich	201154
Sodium hydroxide	SIGMA Aldrich	43617	0.1 M solution
Sodium nitrate	SIGMA Aldrich	NISTRM8569
Sodium pyrophosphate	SIGMA Aldrich	221368
Sucrose	SIGMA Aldrich	V90016
SUPREMA pre-column, 1,000 and 10,000 columns	Polymer Standards Services, Mainz, Germany		Size-exclusion chromatography (SEC)
Trizma	SIGMA Aldrich	T 1503
Ultracentrifuge tubes	Beckman		4 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 11 x 60 mm