Identificación de la actividad hemolítica y fosfolipasa en extractos crudos de anémonas de mar mediante bioensayos sencillos

Resumen

Aquí, describimos un protocolo para obtener extracto de veneno crudo de la anémona de mar y detectar su actividad hemolítica y fosfolipasa.

Resumen

La composición del veneno de anémona de mar incluye moléculas polipeptídicas y no proteicas. Los componentes citolíticos tienen un alto potencial biotecnológico y biomédico para diseñar nuevas herramientas moleculares. El veneno de anémona de mar se localiza en las células glandulares del ectodermo y las estructuras subcelulares llamadas nematocistos, las cuales se distribuyen por todo el cuerpo de la anémona de mar. Esta característica implica desafíos porque las células y el nematocisto deben ser lisados para liberar los componentes del veneno con otras moléculas no tóxicas. Por lo tanto, primero, el veneno se deriva de un extracto crudo (mezcla de moléculas diferentes y diversas y restos de tejido). El siguiente paso es detectar polipéptidos con bioactividades específicas. Aquí, describimos una estrategia eficiente para obtener el extracto crudo de anémona de mar y bioensayo para identificar la presencia de citolisinas. El primer paso implica técnicas económicas y sencillas (ciclo agitado y de congelación-descongelación) para liberar citolisinas. Obtuvimos la mayor actividad citolítica y proteína (~500 mg de proteína de 20 g de peso seco). A continuación, se analizó la complejidad polipeptídica del extracto mediante el gel SDS-PAGE detectando proteínas con pesos moleculares entre 10 kDa y 250 kDa. En el ensayo hemolítico, utilizamos glóbulos rojos de oveja y determinamos HU₅₀ (11,1 ± 0,3 μg/mL). Por el contrario, la presencia de fosfolipasas en el extracto crudo se determinó utilizando yema de huevo como sustrato en un medio sólido con agarosa. En general, este estudio utiliza un protocolo eficiente y económico para preparar el extracto crudo y aplica bioensayos replicables para identificar citolisinas, moléculas con intereses biotecnológicos y biomédicos.

Introducción

Los animales marinos son una rica fuente de compuestos biológicamente activos. En las últimas décadas, la composición del veneno de anémona de mar ha atraído la atención científica ya que comprende una diversidad de polipéptidos con actividad hemolítica, citotóxica, enzimática (fosfolipasa, proteasa, quitinasa) y neurotóxica y efectos inhibitorios sobre la actividad proteolítica¹. Además, estos polipéptidos son fuentes potenciales para el desarrollo de herramientas moleculares en uso biotecnológico y terapéutico ^2,3.

Hay pocos informes sobre el veneno de aném....

Protocolo

Las anémonas de mar fueron recolectadas de acuerdo a lineamientos de la Comisión Nacional de Acuacultura, Pesca y Alimentación del Gobierno Federal de México (número de permiso PPF / DGOPTA 07332.250810.4060). El Comité de Bioética del Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional Autónoma de México aprobó todos los experimentos con anémonas de mar. La muestra de sangre ovina fue adquirida en el Centro de Enseñanza Práctica e Investigación en Producción y Sanidad Animal (CEPIPSA, Universidad Nacional Autónoma de México).

1. Colección de organismos

1. Recoger anémona de mar A. dowii.
   NOTA: Aquí, lo....

Resultados

Los resultados representativos del protocolo utilizado para obtener el extracto crudo de anémona de mar mostraron que la combinación de dos técnicas (agitación y ciclos de congelación y descongelación) produjo una descarga eficiente de nematocistos, y la cantidad total de proteína fue de 500 mg (8 mg/ml) (Figura 3).

La complejidad proteica del extracto crudo se pudo observar a partir de 10 kDa y superior a 250 kDa a través de la electroforesis SDS-PAGE. Ad.......

Discusión

La alta demanda de nuevos compuestos con aplicaciones en diferentes campos de la ciencia y la industria ha llevado al estudio del veneno. El veneno representa una rica fuente de moléculas que sirve como plantilla para generar nuevas herramientas moleculares. Sin embargo, la complejidad de estos venenos requiere la implementación y combinación de varios métodos para obtenerlos y estudiarlos.

Aquí, mostramos un método para obtener y analizar el veneno de la anémona de mar Anthopleura .......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL conical centrifuge tube	Corning	430766
2-Bromophenol blue	Sigma	B75808
2-mercaptoetanol	Sigma-Aldrich	M6250-100ML
50 mL conical centrifuge tubes	Corning	430828
Acetic Acid Glacial	J.T. Baker	9515-03
Acrylamide	Promega	V3115
Agarose	Promega	V3125
Bisacrylamide	Promega	V3143
Bovine Serum Albumin Fraction V	Sigma	A3059-100G
Bradford Protein Assays	Bio-Rad	5000006
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C3306
Cell culture plates 96 well, V-bottom	Corning	3894
Centrifuge	Eppendorf	5804R
Centrifuge tubes	Corning	CLS430829
ChemiDoc MP system	Bio-Rad	1708280
Citric acid	Sigma-Aldrich	251275
Clear flat.bottom 96-Well Plates	Thermo Scientific	3855
Coomassie Brilliant Blue G-250	Bio-Rad	#1610406
Coomassie brilliant blue R-250	Bio-Rad	1610400
Dextrose	J.T. Baker	1916-01
Ductless Enclosure	Labconco	Vertical	https://imagej.nih.gov/ij ImageJ 1.53c
Gel Doc EZ	Bio Rad.		Gel Documentation System
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516-4L
Hemocytometer	Marienfeld	650030
ImageJ (Software)	NIH, USA	Version 1.53c
Incubator 211	Labnet	I5211 DS
Methanol	J.T. Baker	9049-03
Mini-PROTEAN tetra cell	Bio-Rad	1658000EDU
Na2HPO4	J.T. Baker	3824-01
NaCl	J.T. Baker	3624-01
NaH2PO4.H2O	J.T. Baker	3818-05
Origin software		version 9	To design the plot with sigmoidal adjustments
Petridish	Falcon	351007
Pipetman kit	Gilson	F167380
Precast mini gel	BioRad	1658004
Prestained Protein Ladder	Thermo Scientific	26620
Protease Inhibitor Cocktail	Roche	11836153001
Protein Assay Dye Reagent Concentrate	Bio-Rad	5000006
Rhodamine 6G	Sigma-Aldrich	252433
SDS	Sigma-Aldrich	L4509
Sodium citrate dihydrate	JT Baker	3646-01
Spectrophotometer	THERMO SCIENTIFIC	G10S UV-VIS
Tris Base	Sigma-Aldrich	77-86-1
Volt Power Supply	Hoefer	PS300B