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Aquí, describimos un protocolo para obtener extracto de veneno crudo de la anémona de mar y detectar su actividad hemolítica y fosfolipasa.
La composición del veneno de anémona de mar incluye moléculas polipeptídicas y no proteicas. Los componentes citolíticos tienen un alto potencial biotecnológico y biomédico para diseñar nuevas herramientas moleculares. El veneno de anémona de mar se localiza en las células glandulares del ectodermo y las estructuras subcelulares llamadas nematocistos, las cuales se distribuyen por todo el cuerpo de la anémona de mar. Esta característica implica desafíos porque las células y el nematocisto deben ser lisados para liberar los componentes del veneno con otras moléculas no tóxicas. Por lo tanto, primero, el veneno se deriva de un extracto crudo (mezcla de moléculas diferentes y diversas y restos de tejido). El siguiente paso es detectar polipéptidos con bioactividades específicas. Aquí, describimos una estrategia eficiente para obtener el extracto crudo de anémona de mar y bioensayo para identificar la presencia de citolisinas. El primer paso implica técnicas económicas y sencillas (ciclo agitado y de congelación-descongelación) para liberar citolisinas. Obtuvimos la mayor actividad citolítica y proteína (~500 mg de proteína de 20 g de peso seco). A continuación, se analizó la complejidad polipeptídica del extracto mediante el gel SDS-PAGE detectando proteínas con pesos moleculares entre 10 kDa y 250 kDa. En el ensayo hemolítico, utilizamos glóbulos rojos de oveja y determinamos HU50 (11,1 ± 0,3 μg/mL). Por el contrario, la presencia de fosfolipasas en el extracto crudo se determinó utilizando yema de huevo como sustrato en un medio sólido con agarosa. En general, este estudio utiliza un protocolo eficiente y económico para preparar el extracto crudo y aplica bioensayos replicables para identificar citolisinas, moléculas con intereses biotecnológicos y biomédicos.
Los animales marinos son una rica fuente de compuestos biológicamente activos. En las últimas décadas, la composición del veneno de anémona de mar ha atraído la atención científica ya que comprende una diversidad de polipéptidos con actividad hemolítica, citotóxica, enzimática (fosfolipasa, proteasa, quitinasa) y neurotóxica y efectos inhibitorios sobre la actividad proteolítica1. Además, estos polipéptidos son fuentes potenciales para el desarrollo de herramientas moleculares en uso biotecnológico y terapéutico 2,3.
Hay pocos informes sobre el veneno de aném....
Las anémonas de mar fueron recolectadas de acuerdo a lineamientos de la Comisión Nacional de Acuacultura, Pesca y Alimentación del Gobierno Federal de México (número de permiso PPF / DGOPTA 07332.250810.4060). El Comité de Bioética del Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional Autónoma de México aprobó todos los experimentos con anémonas de mar. La muestra de sangre ovina fue adquirida en el Centro de Enseñanza Práctica e Investigación en Producción y Sanidad Animal (CEPIPSA, Universidad Nacional Autónoma de México).
1. Colección de organismos
Los resultados representativos del protocolo utilizado para obtener el extracto crudo de anémona de mar mostraron que la combinación de dos técnicas (agitación y ciclos de congelación y descongelación) produjo una descarga eficiente de nematocistos, y la cantidad total de proteína fue de 500 mg (8 mg/ml) (Figura 3).
La complejidad proteica del extracto crudo se pudo observar a partir de 10 kDa y superior a 250 kDa a través de la electroforesis SDS-PAGE. Ad.......
La alta demanda de nuevos compuestos con aplicaciones en diferentes campos de la ciencia y la industria ha llevado al estudio del veneno. El veneno representa una rica fuente de moléculas que sirve como plantilla para generar nuevas herramientas moleculares. Sin embargo, la complejidad de estos venenos requiere la implementación y combinación de varios métodos para obtenerlos y estudiarlos.
Aquí, mostramos un método para obtener y analizar el veneno de la anémona de mar Anthopleura .......
Los autores declaran que no tienen ningún interés en competencia en relación con la publicación de este artículo.
Este trabajo fue apoyado por el Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT), con número de subvención IT200819. Los autores agradecen a Tom Musselman, Rock Paper Editing, LLC, por revisar la gramática inglesa de este manuscrito; y la asistencia técnica de Samanta Jiménez (CICESE, Ensenada), y Juan Manuel Barbosa Castillo (Instituto de Fisiología Celular, UNAM). También agradecemos al Dr. Augusto César Lizarazo Chaparro (CEPIPSA) por obtener sangre de oveja. Agradecemos especialmente al Dr. José Saniger Blesa, ICAT-UNAM, por las instalaciones de su laboratorio para la grabación de video.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
15 mL conical centrifuge tube | Corning | 430766 | |
2-Bromophenol blue | Sigma | B75808 | |
2-mercaptoetanol | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | |
50 mL conical centrifuge tubes | Corning | 430828 | |
Acetic Acid Glacial | J.T. Baker | 9515-03 | |
Acrylamide | Promega | V3115 | |
Agarose | Promega | V3125 | |
Bisacrylamide | Promega | V3143 | |
Bovine Serum Albumin Fraction V | Sigma | A3059-100G | |
Bradford Protein Assays | Bio-Rad | 5000006 | |
Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C3306 | |
Cell culture plates 96 well, V-bottom | Corning | 3894 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
Centrifuge tubes | Corning | CLS430829 | |
ChemiDoc MP system | Bio-Rad | 1708280 | |
Citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | |
Clear flat.bottom 96-Well Plates | Thermo Scientific | 3855 | |
Coomassie Brilliant Blue G-250 | Bio-Rad | #1610406 | |
Coomassie brilliant blue R-250 | Bio-Rad | 1610400 | |
Dextrose | J.T. Baker | 1916-01 | |
Ductless Enclosure | Labconco | Vertical | https://imagej.nih.gov/ij ImageJ 1.53c |
Gel Doc EZ | Bio Rad. | Gel Documentation System | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-4L | |
Hemocytometer | Marienfeld | 650030 | |
ImageJ (Software) | NIH, USA | Version 1.53c | |
Incubator 211 | Labnet | I5211 DS | |
Methanol | J.T. Baker | 9049-03 | |
Mini-PROTEAN tetra cell | Bio-Rad | 1658000EDU | |
Na2HPO4 | J.T. Baker | 3824-01 | |
NaCl | J.T. Baker | 3624-01 | |
NaH2PO4.H2O | J.T. Baker | 3818-05 | |
Origin software | version 9 | To design the plot with sigmoidal adjustments | |
Petridish | Falcon | 351007 | |
Pipetman kit | Gilson | F167380 | |
Precast mini gel | BioRad | 1658004 | |
Prestained Protein Ladder | Thermo Scientific | 26620 | |
Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
Protein Assay Dye Reagent Concentrate | Bio-Rad | 5000006 | |
Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich | 252433 | |
SDS | Sigma-Aldrich | L4509 | |
Sodium citrate dihydrate | JT Baker | 3646-01 | |
Spectrophotometer | THERMO SCIENTIFIC | G10S UV-VIS | |
Tris Base | Sigma-Aldrich | 77-86-1 | |
Volt Power Supply | Hoefer | PS300B |
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