Identificazione dell'attività emolitica e fosfolipasi in estratti grezzi di anemoni di mare mediante saggi biologici semplici

Riepilogo

Qui, descriviamo un protocollo per ottenere l'estratto di veleno grezzo dall'anemone di mare e rilevare la sua attività emolitica e fosfolipasi.

Abstract

La composizione del veleno di anemone di mare comprende molecole polipeptidiche e non proteiche. I componenti citolitici hanno un elevato potenziale biotecnologico e biomedico per la progettazione di nuovi strumenti molecolari. Il veleno di anemoni di mare si trova nelle cellule ghiandolari dell'ectoderma e delle strutture subcellulari chiamate nematocisti, entrambe distribuite in tutto il corpo dell'anemone marino. Questa caratteristica implica sfide perché le cellule e la nematocisti devono essere lisate per rilasciare i componenti del veleno con altre molecole non tossiche. Pertanto, in primo luogo, il veleno è derivato da un estratto grezzo (miscela di molecole diverse e diverse e detriti tissutali). Il prossimo passo è rilevare polipeptidi con bioattività specifiche. Qui, descriviamo una strategia efficiente per ottenere l'estratto grezzo di anemone di mare e il biotest per identificare la presenza di citolisine. Il primo passo prevede tecniche economiche e semplici (ciclo agitato e congelamento-disgelo) per rilasciare citolisine. Abbiamo ottenuto la più alta attività citolitica e proteina (~ 500 mg di proteine da 20 g di peso secco). Successivamente, la complessità polipeptidica dell'estratto è stata analizzata dal gel SDS-PAGE rilevando proteine con pesi molecolari compresi tra 10 kDa e 250 kDa. Nel test emolitico, abbiamo utilizzato globuli rossi di pecora e determinato HU₅₀ (11,1 ± 0,3 μg / mL). Al contrario, la presenza di fosfolipasi nell'estratto grezzo è stata determinata utilizzando il tuorlo d'uovo come substrato in un mezzo solido con agarosio. Nel complesso, questo studio utilizza un protocollo efficiente ed economico per preparare l'estratto grezzo e applica biotest replicabili per identificare citolisine, molecole con interessi biotecnologici e biomedici.

Introduzione

Gli animali marini sono una ricca fonte di composti biologicamente attivi. Negli ultimi decenni, la composizione del veleno di anemone di mare ha attirato l'attenzione scientifica poiché comprende una varietà di polipeptidi con attività emolitica, citotossica, enzimatica (fosfolipasi, proteasi, chitinasi) e neurotossica ed effetti inibitori sull'attività proteolitica¹. Inoltre, questi polipeptidi sono potenziali fonti per lo sviluppo di strumenti molecolari nell'uso biotecnologico e terapeutico ^2,3.

Ci sono poche segnalazioni sul veleno di anemone di mare e sui suoi componenti molecolari a causa della complessità di ottenere il veleno, persino l'isolamento e la caratterizzazione delle tossine. I metodi di estrazione utilizzati nei rapporti prevedevano la lisi e lo svuotamento del contenuto delle cellule che sono correlate e non correlate alla produzione di veleno¹.

Una caratteristica particolare in tutti gli cnidari è l'assenza di un sistema per la produzione e il rilascio del veleno centralizzato in un'unica regione anatomica. Invece, le nematocisti sono strutture che mantengono il veleno ^4,5. Altri tipi di cellule, chiamate cellule della ghiandola epidermica, secernono anche tossine e sono anche distribuite in tutto il corpo degli anemoni di mare⁶.

La prima e più cruciale sfida nell'ottenere il veleno è la generazione di un estratto con sufficiente manipolazione nei processi successivi, senza l'inattivazione o la degradazione delle proteine labili. Successivamente, le cellule devono essere lisate e i componenti, in questo caso, i polipeptidi devono essere estratti in modo efficiente e rapido, evitando la proteolisi e l'idrolisi mentre si eliminano altri componenti cellulari⁷.

Diversi metodi sono utilizzati per ottenere l'estratto grezzo di un anemone di mare; alcuni implicano il sacrificio dell'organismo mentre altri permettono che sia mantenuto in vita. I metodi che implicano l'uso di tutto il corpo dell'organismo consentono il rilascio della maggior parte delle tossine dal veleno⁸, rispetto ai metodi che mantengono in vita gli organismi, che estraggono solo alcuni componenti del veleno⁹. La preparazione di un estratto richiede la valutazione della presenza e della potenza di una sostanza di interesse attraverso uno specifico biodosaggio, che include strategie per osservare gli effetti farmacologici con metodi in vivo o in vitro ¹⁰.

Il veleno di anemoni di mare contiene polipeptidi citolitici, tossine che formano pori (PFT)¹¹ e fosfolipasi¹²; queste molecole sono modelli nello studio dell'interazione proteina-lipidi, strumenti molecolari nella terapia del cancro e biosensori basati su nanopori³. La classificazione dei PFT di anemoni di mare viene effettuata in base alle loro dimensioni o peso molecolare, da 5 kDa a 80 kDa. Il PFT da 20 kDa, il più studiato e conosciuto come actinoporine¹¹, è di particolare interesse per il suo potenziale biomedico nello sviluppo di strumenti molecolari per possibili applicazioni come biosensori antitumorali, antimicrobici e basati su nanopori. Un'altra citolisina, comprese le fosfolipasi, in particolare la fosfolipasi A2 (PLA2)¹³, rilascia un acido grasso dovuto e idrolizza i fosfolipidi, destabilizzando la membrana cellulare. Grazie a questo meccanismo d'azione, PLA2 promette di essere un modello essenziale per lo studio e le applicazioni nelle malattie infiammatorie. Potrebbe servire come modello per gli studi sul comportamento lipidico nella membrana cellulare¹⁴.

Qui, descriviamo un protocollo efficiente per ottenere l'estratto grezzo dall'anemone di mare Anthopleura dowii Verrill, 1869, e rilevare emolisine e fosfolipasi. Entrambe sono tossine rilevanti che potrebbero essere utilizzate come modello per progettare nuovi strumenti molecolari.

Protocollo

Gli anemoni di mare sono stati raccolti secondo le linee guida della Commissione nazionale per l'acquacoltura, la pesca e l'alimentazione del governo federale del Messico (numero di permesso PPF / DGOPTA 07332.250810.4060). Il Comitato di Bioetica dell'Istituto di Biotecnologia, Università Nazionale Autonoma del Messico ha approvato tutti gli esperimenti con gli anemoni di mare. Il campione di sangue di pecora è stato acquistato presso il Centro per l'insegnamento pratico e la ricerca nella produzione e la salute animale (CEPIPSA, Università Nazionale Autonoma del Messico).

1. Raccolta di organismi

1. Raccogli l'anemone di mare A. dowii.
   NOTA: Qui, gli organismi sono stati raccolti durante i periodi di bassa marea nella zona intertidale al largo della costa di Ensenada Baja, California, Messico (Figura 1A, B).
2. Trasportare gli organismi al laboratorio in contenitori con acqua di mare (Figura 1C).
3. In laboratorio, pulire gli organismi con acqua distillata a mano per rimuovere le grandi particelle di substrato che aderiscono al corpo.
4. Congelare immediatamente gli organismi a -80 °C in un ultra-congelatore per 72 ore.
5. Posizionare gli organismi in vetri speciali per la liofilizzazione, con condizioni di liofilizzazione di -20 °C, 0,015 psi, per 48 ore.
6. Conservare gli organismi liofilizzati a -20 °C fino all'uso.

2. Idratazione dei tessuti

1. Ricostituire 20 g di peso secco di organismi liofilizzati con 60 mL (1/3 p/v) di tampone fosfato di sodio 50 mM, pH 7,5 e 1 compressa cocktail inibitore (Tabella dei materiali).
2. In un agitatore magnetico, mescolare continuamente il campione a ~ 800 rpm, 4 °C, per 12 h.

3. Rilascio di tossine

1. Per indurre la lisi cellulare e lo scarico di nematocisti, congelare il campione a -20 °C per 12 ore, quindi posizionare il contenitore in acqua a temperatura ambiente (RT) fino a scongelamento fino al 90%. Ripetere questa procedura tre volte.
   NOTA: Il campione non si scongela al 100%; è fondamentale mantenere il campione a ~4 °C per prevenire la degradazione delle proteine.
2. Osservare la nematocisti scaricata al microscopio confocale. Prelevare 10 μL del campione su un vetrino e posizionare sopra un coperchio. Osservare al microscopio confocale con ingrandimento 100x e 60x. Qui non era necessario un colorante.
3. Elaborare le immagini catturate al microscopio confocale nel software ImageJ (versione 1.53c, Wayne Rasband, National Institutes of Health, USA, https://imagej.nih.gov/ij).
4. Se il tubulo all'interno della nematocisti si srotola ed è all'esterno, le nematocisti vengono scaricate; quindi, continua con il passaggio successivo. Altrimenti, condurre solo un altro ciclo di congelamento-disgelo.
5. Per chiarire l'estratto, centrifugare il campione a 25.400 x g per 40 min, 4 °C, recuperare il surnatante e centrifugarlo di nuovo. Ripetere questo passaggio 3-4 volte.
6. Recuperare il surnatante e scartare il pellet. Il surnatante o estratto grezzo contiene i componenti del veleno (tossine) e altre molecole cellulari, come lipidi, carboidrati e acidi nucleici.

4. Quantificazione della proteina totale

1. Determinare la concentrazione proteica dell'estratto grezzo utilizzando un kit commerciale bradford colorimetrico¹⁵ (Table of Materials).
2. Diluire il reagente colorante (una parte del colorante con quattro parti di acqua distillata).
3. Preparare la soluzione di albumina sierica bovina (BSA) Frazione V (Tabella dei materiali) a 1 mg/mL di concentrazione in tampone fosfato (50 mM fosfato di sodio, pH 7,5).
4. Preparare le soluzioni elencate nella Tabella 1 in triplice copia.
5. Mescolare vigorosamente ogni soluzione in uno shaker per 4 s.
6. Incubare i campioni per 5 minuti a RT, senza agitare.
7. Misurare l'assorbanza (AU) a 595 nm.
8. Tracciare le medie delle assorbanze BSA del campione (AU vs. concentrazione proteica) e determinare l'equazione del grafico (Equazione 1).
        Equazione 1
   dove y è l'assorbanza, m è la pendenza della linea, x è la concentrazione proteica e b è l'intercetta y. Per calcolare la concentrazione di estratto grezzo, risolvere per x come segue:
        Equazione 2

5. Determinare la complessità del veleno polipeptidico

1. Assemblare il contenitore di vetro per l'elettroforesi verticale su gel secondo il manuale.
2. Preparare la miscela di acrilammide (30%): 29,2 g di acrilammide, 0,8 g di bis-acrilammide, il volume finale di 100 ml. Filtrare la soluzione utilizzando una membrana da 0,45 μm. Conservare la soluzione in un flacone scuro a 4 °C. Quindi, preparare la miscela per il gel risolutivo (Tabella 2).
3. Il gel SDS-PAGE è costituito da un gel risolutivo e da un gel impilabile. Preparare i gel secondo i volumi di soluzione definiti nella Tabella 2. Durante la preparazione, assicurarsi di mantenere ogni miscela a 4 °C per ridurre i tempi di polimerizzazione.
   NOTA: Il volume di ogni miscela varia a seconda della marca di attrezzatura utilizzata; per questo protocollo, i volumi corrispondono alla preparazione del gel di acrilammide al 15%, spessore 0,75 mm, per una camera di elettroforesi verticale (Tabella dei materiali).
4. Dopo che l'acrilammide ha polimerizzato, ~ 10 min, aggiungere la miscela di gel impilabile.
5. Preparare la miscela per il gel impilabile, aggiungerlo immediatamente alle lastre di vetro e posizionare un pettine per formare i pozzetti per il caricamento dei campioni.
6. Una volta che il gel impilabile ha polimerizzato (~ 15 min), rimuovere il pettine e posizionare il contenitore di vetro in una camera per l'elettroforesi verticale.
7. Posizionare 200 mL di tampone elettrodo (0,25 M Tris, 0,192 M glicina, 0,1% SDS) nella camera di elettroforesi.
8. Analizzare l'estratto grezzo: Mescolare 30 μg di estratto grezzo con 5 μL di tampone di carico proteico (25% glicerolo, 15% sodio dodecil solfato, 25% 2-mercaptoetanolo, 0,125 mM Tris pH 7, bromofenolo blu 0,1 mg/mL) per denaturare le proteine. Il volume finale deve essere <50 μL.
9. Riscaldare a 90 °C per 5 min, raffreddare e centrifugare per 3 s a 1.400 x g.
10. Caricare i campioni nei pozzetti del gel impilabile. Caricare una scala a peso molecolare standard.
11. Eseguire elettroforesi a 25 mA costanti per 1 h 30 min.
12. Rimuovere i contenitori di vetro dalla camera di elettroforesi per procedere con la colorazione delle proteine del gel.

6. Colorazione delle proteine

1. Risciacquare il gel in 50 ml di acqua distillata per rimuovere i detriti dall'elettrodo tampone.
2. Scartare l'acqua.
3. Per evitare la diffusione delle proteine del gel, aggiungere la soluzione di fissazione (60 ml di etanolo, 20 ml di acido acetico e 20 ml di acqua distillata, volume finale 100 ml). Incubare a RT per 40 minuti con agitazione a 80 giri / min. Decantare la soluzione.
4. Aggiungere la soluzione reticolante proteica (15 mL di etanolo, 0,25 mL di glutaraldeide, 50 ml di acqua distillata, volume finale 65,25 ml) e incubare per 30 minuti a RT con agitazione a 80 giri/min. Rimuovere la soluzione.
5. Lavare il gel con 100 ml di acqua distillata per 5 minuti e rimuovere l'acqua. Ripetere questa procedura quattro volte.
6. Effettuare la colorazione proteica con 50 mL di soluzione filtrata Coomassie blu brillante R-250 (40% metanolo, 10% acido acetico, 50% acqua distillata, 0,1% colorante, volume finale 100 ml), mescolando a 60 giri / min in un oscillatore rotativo da laboratorio a RT per 15 min.
7. Recuperare la soluzione, che può essere utilizzata per macchiare altri gel.
8. Per eliminare il colorante in eccesso, aggiungere una soluzione di destaining (40 ml di metanolo, 10 ml di acido acetico, 50 ml di acqua distillata). Continuare a mescolare (80 rpm) a RT fino a quando le bande (proteine colorate) non vengono visualizzate.
9. Conservare il gel in 50 ml di acqua distillata e scansionare l'immagine in un sistema di documentazione Gel.

7. Preparare la soluzione di globuli rossi

1. Estrarre 1 mL di sangue dalla vena giugulare di una pecora.
2. Rimuovere l'ago dalla siringa e drenare immediatamente il sangue in un tubo con 50 mL di soluzione di Alsever (0,002 M di acido citrico, 0,07 M di NaCl, 0,1 M di destrosio e 0,027 M di citrato di sodio come anticoagulante, pH 7,4).
3. Invertire lentamente la soluzione tre volte.
4. Conservare a 4 °C per il trasferimento in laboratorio.
5. Centrifugare a 804 x g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante.
6. Risospendare il pellet in 30 ml di soluzione Alsever. Aggiungere la soluzione facendola scorrere lungo le pareti interne del tubo e, utilizzando una pipetta di plastica Pasteur, risospese lentamente le celle. Centrifugare nuovamente a 804 x g per 5 min, 4 °C. Ripetere questa procedura fino a quando il surnatante non è chiarito.
7. Aggiungere 15 mL di soluzione Alsever; risospese il pellet lentamente con una pipetta di plastica Pasteur.
8. Mantenere il volume finale della soluzione di Alsever per raggiungere una concentrazione di 2 x 10⁶ celle/ml, approssimativamente. Quindi, utilizzare una camera Neubauer o un emocitometro per contare le cellule.
   NOTA: Contare gli eritrociti nel vetrino dell'emacitometro (Neubauer migliorato). La slitta è una slitta da 30 mm x 70 mm x 4 mm. Il centro ha due pedane argentate (Figura 2A) (una griglia superiore e una inferiore), ciascuna di 3 mm x 3 mm, e due canali ai lati della griglia. Il conteggio delle celle si trova nei quadrati angolari e centrali (quadrati rossi nella Figura 2B). La concentrazione ottimale di cellule per il conteggio dovrebbe essere nell'ordine di 10⁶ cellule. La scatola centrale ha una superficie di 0,1 cm², che equivale a 0,0001 ml.
9. Posizionare una copertina sopra la diapositiva.
10. Posizionare 10 μL del campione tra il vetrino e il coperchio e attendere l'erogazione del campione.
11. In un microscopio ottico (ingrandimento 60x), eseguire il conteggio nella prima casella quadrata. Contare solo le celle nella griglia centrale e quelle che toccano il margine superiore o sinistro della casella.
12. Determinare la concentrazione cellulare utilizzando la seguente equazione:
    Equazione 3
    Se il campione è molto concentrato ed è necessaria la diluizione, utilizzare la seguente equazione:
    Equazione 4
    NOTA: Quando si prende la soluzione di eritrociti per il test di emolisi, omogeneizzare lentamente la soluzione con una pipetta pasteur di plastica.
13. Eseguire i passaggi in triplice copia per ridurre gli errori.

8. Saggio di emolisi

1. Preparare le miscele di soluzioni (in triplicati) indicate nella Tabella 3 in piastre coniche a 96 pozzetti.
   NOTA: Mescolare lentamente gli eritrociti per mantenere una sospensione omogenea.
2. Incubare per 1 ora a 37 °C, senza agitare.
3. Centrifugare la piastra a 804 x g per 5 min a 4 °C.
4. Recuperare il surnatante in un'altra piastra a 96 pozzetti con fondo piatto.
5. Se l'estratto grezzo contiene citolisine, gli eritrociti lisi e rilasciano emoglobina. Leggere l'assorbanza a 415 nm.
6. Calcolare la percentuale di emolisi, utilizzando la seguente equazione:
   % Emolisi = ((Acrude extract-AAlsever buffer) / (AH₂O-AAlsever)) x 100
   NOTA: L'estratto di Acrude, il tampone AAlsever e l'AH₂O corrispondono rispettivamente all'assorbanza degli eritrociti con l'estratto grezzo, all'assorbanza della soluzione di Alsever e all'assorbanza dell'acqua distillata.
7. Eseguire un test di emolisi prima e dopo ogni ciclo di congelamento e scongelamento con 50 μg di proteine totali dall'estratto grezzo.
8. Determinare il numero di cicli di congelamento e scongelamento necessari per raggiungere il 100% di attività emolitica.
9. Calcolare la quantità di estratto che produce emolisi nel 50% degli eritrociti (HU₅₀); seguire lo stesso protocollo descritto nella Tabella 3, aumentare la quantità di estratto grezzo di anemone di mare e progettare la trama con regolazioni sigmoidali utilizzando software appropriati (ad esempio, Origine, Tabella dei materiali).

9. Saggio della fosfolipasi

1. Lavare un uovo di gallina con l'1% di SDS in acqua distillata.
2. Separare il tuorlo d'uovo dall'albume in condizioni sterili.
3. Preparare 50 ml di soluzione di NaCl allo 0,86% e filtrare attraverso un filtro da 0,22 μm. Quindi, preparare la soluzione A: aggiungere 12 ml di tuorlo d'uovo e 36 ml di soluzione di NaCl allo 0,86%.
4. Preparare la soluzione B: mescolare 300 mg di agarosio in 50 mL di tampone (50 mM Tris, pH 7,5), filtrare attraverso un filtro da 0,22 μm. Riscaldare la soluzione in un forno a microonde fino all'ebollizione. Raffreddare in acqua tiepida per raggiungere i 43-45°C.
5. Preparare la soluzione C: preparare 10 mM di CaCl₂ e filtrarlo con un filtro da 0,22 μm.
6. Preparare la soluzione D: 10 mg di rodamina 6G in 1 mL di acqua distillata.
7. In condizioni sterili (cappa a flusso laminare), aggiungere 500 μL di soluzioni A e C alla soluzione B e 100 μL di soluzione D, mescolare e versare 25 mL in ciascuna capsula di Petri (90 x 15 mm).
8. Attendere che la soluzione si solidifichi in condizioni sterili (30 min).
9. Crea pozzetti (~ 2-3 mm di diametro) con un tubo sottile.
10. Aggiungere un totale di 20 μL di tampone fosfato (controllo negativo) in un pozzetto e 20 μL di una determinata fosfolipasi (controllo positivo) in un altro pozzo.
11. Collocare diverse quantità di proteine dell'estratto grezzo, 5, 15, 25, 35, 45 μg, nei pozzetti rimanenti, ciascuno in un volume finale di 20 μL.
12. Attendere che l'agar assorba tutti i campioni (30 min).
13. Incubare a 37 °C per 20 h.
14. Se si forma un alone intorno al pozzo, questo indica l'attività della fosfolipasi. Misurare l'alone formato con una pinza vernier.
    NOTA: eseguire l'esperimento in triplice copia (passaggi da 9.1 a 9.14).

Risultati

I risultati rappresentativi del protocollo utilizzato per ottenere l'estratto grezzo di anemone di mare hanno mostrato che la combinazione di due tecniche (agitazione e cicli di congelamento e scongelamento) produceva uno scarico efficiente di nematocisti e la quantità totale di proteine era di 500 mg (8 mg / mL) (Figura 3).

La complessità proteica dell'estratto grezzo potrebbe essere osservata da 10 kDa e superiore a 250 kDa attraverso l'elettroforesi SDS-PAGE....

Discussione

L'elevata domanda di nuovi composti con applicazioni in diversi campi della scienza e dell'industria ha portato allo studio del veleno. Il veleno rappresenta una ricca fonte di molecole che funge da modello per la generazione di nuovi strumenti molecolari. Tuttavia, la complessità di questi veleni richiede l'implementazione e la combinazione di vari metodi per ottenerli e studiarli.

Qui, mostriamo un metodo per ottenere e analizzare il veleno dell'anemone di mare Anthopleura dowii, V...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL conical centrifuge tube	Corning	430766
2-Bromophenol blue	Sigma	B75808
2-mercaptoetanol	Sigma-Aldrich	M6250-100ML
50 mL conical centrifuge tubes	Corning	430828
Acetic Acid Glacial	J.T. Baker	9515-03
Acrylamide	Promega	V3115
Agarose	Promega	V3125
Bisacrylamide	Promega	V3143
Bovine Serum Albumin Fraction V	Sigma	A3059-100G
Bradford Protein Assays	Bio-Rad	5000006
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C3306
Cell culture plates 96 well, V-bottom	Corning	3894
Centrifuge	Eppendorf	5804R
Centrifuge tubes	Corning	CLS430829
ChemiDoc MP system	Bio-Rad	1708280
Citric acid	Sigma-Aldrich	251275
Clear flat.bottom 96-Well Plates	Thermo Scientific	3855
Coomassie Brilliant Blue G-250	Bio-Rad	#1610406
Coomassie brilliant blue R-250	Bio-Rad	1610400
Dextrose	J.T. Baker	1916-01
Ductless Enclosure	Labconco	Vertical	https://imagej.nih.gov/ij ImageJ 1.53c
Gel Doc EZ	Bio Rad.		Gel Documentation System
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516-4L
Hemocytometer	Marienfeld	650030
ImageJ (Software)	NIH, USA	Version 1.53c
Incubator 211	Labnet	I5211 DS
Methanol	J.T. Baker	9049-03
Mini-PROTEAN tetra cell	Bio-Rad	1658000EDU
Na2HPO4	J.T. Baker	3824-01
NaCl	J.T. Baker	3624-01
NaH2PO4.H2O	J.T. Baker	3818-05
Origin software		version 9	To design the plot with sigmoidal adjustments
Petridish	Falcon	351007
Pipetman kit	Gilson	F167380
Precast mini gel	BioRad	1658004
Prestained Protein Ladder	Thermo Scientific	26620
Protease Inhibitor Cocktail	Roche	11836153001
Protein Assay Dye Reagent Concentrate	Bio-Rad	5000006
Rhodamine 6G	Sigma-Aldrich	252433
SDS	Sigma-Aldrich	L4509
Sodium citrate dihydrate	JT Baker	3646-01
Spectrophotometer	THERMO SCIENTIFIC	G10S UV-VIS
Tris Base	Sigma-Aldrich	77-86-1
Volt Power Supply	Hoefer	PS300B