Un modelo para el tratamiento de la encefalomiosinangiosis después del accidente cerebrovascular inducido por la oclusión de la arteria cerebral media en ratones

Resumen

El protocolo tiene como objetivo proporcionar métodos para la encefalomiosinangiosis (injerto de un colgajo de músculo vascular temporal en la superficie pial del tejido cerebral isquémico) para el tratamiento del accidente cerebrovascular isquémico agudo no moyamoya. La eficacia del enfoque en el aumento de la angiogénesis se evalúa utilizando un modelo transitorio de oclusión de la arteria cerebral media en ratones.

Resumen

No existe un tratamiento efectivo disponible para la mayoría de los pacientes que sufren de accidente cerebrovascular isquémico, lo que hace que el desarrollo de nuevas terapias sea imperativo. La capacidad del cerebro para autocurarse después de un accidente cerebrovascular isquémico está limitada por el suministro inadecuado de sangre en el área afectada. La encefalomiosinangiosis (EMS) es un procedimiento neuroquirúrgico que logra la angiogénesis en pacientes con enfermedad de moyamoya. Implica craneotomía con la colocación de un injerto de músculo vascular temporal en la superficie isquémica del cerebro. EMS nunca se ha estudiado en el contexto de accidente cerebrovascular isquémico agudo en ratones. La hipótesis que impulsa este estudio es que la EMS mejora la angiogénesis cerebral en la superficie cortical que rodea el injerto muscular. El protocolo que se muestra aquí describe el procedimiento y proporciona datos iniciales que respaldan la viabilidad y eficacia del enfoque EMS. En este protocolo, después de 60 minutos de oclusión transitoria de la arteria cerebral media (MCAo), los ratones fueron aleatorizados a MCAo o MCAo + EMS. El EMS se realizó 3-4 h después de la oclusión. Los ratones fueron sacrificados 7 o 21 días después del tratamiento MCAo o MCAo + EMS. La viabilidad del injerto temporalis se midió mediante el ensayo de nicotinamida adenina dinucleótido reducido en tetrazolio reductasa. Una matriz de angiogénesis de ratón cuantificó la expresión de proteínas angiogénicas y neuromoduladoras. La inmunohistoquímica se utilizó para visualizar la unión del injerto con la corteza cerebral y el cambio en la densidad de los vasos. Los datos preliminares aquí sugieren que el músculo injertado permaneció viable 21 días después de EMS. La inmunotinción mostró una implantación exitosa del injerto y un aumento en la densidad de los vasos cerca del injerto muscular, lo que indica un aumento de la angiogénesis. Los datos muestran que EMS aumenta el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) y disminuye los niveles de osteopontina después del accidente cerebrovascular. Además, la EMS después del accidente cerebrovascular no aumentó la mortalidad, lo que sugiere que el protocolo es seguro y confiable. Este nuevo procedimiento es efectivo y bien tolerado y tiene el potencial de proporcionar información de nuevas intervenciones para mejorar la angiogénesis después del accidente cerebrovascular isquémico agudo.

Introducción

El accidente cerebrovascular isquémico es una lesión neurovascular aguda con secuelas crónicas devastadoras. La mayoría de los sobrevivientes de accidentes cerebrovasculares, 650,000 por año, en los Estados Unidos sufren de discapacidad funcional permanente¹. Ninguno de los tratamientos disponibles confiere neuroprotección y recuperación funcional tras la fase aguda del ictus isquémico. Después de un accidente cerebrovascular isquémico agudo, los suministros de sangre directos y colaterales disminuyen, lo que conduce a la disfunción de las células y redes cerebrales, lo que resulta en déficits neurológicos repentinos ^2,3. La restauración del suministro de sangre a la región isquémica sigue siendo el objetivo principal de la terapia del accidente cerebrovascular. Por lo tanto, mejorar la angiogénesis para promover el suministro de sangre en el territorio isquémico es un enfoque terapéutico prometedor; Sin embargo, los métodos previamente estudiados para promover la angiogénesis posterior al accidente cerebrovascular, incluyendo eritropoyetina, estatinas y factores de crecimiento, han sido limitados por niveles inaceptables de toxicidad o traducibilidad⁴.

La encefalomiosinangiosis (EMS) es un procedimiento quirúrgico que mejora la angiogénesis cerebral en humanos con enfermedad de moyamoya, una afección de arterias craneales estrechadas que a menudo conduce a un accidente cerebrovascular. EMS implica el desprendimiento parcial de una sección vascular del músculo temporal del paciente del cráneo, seguido de craneotomía e injerto del músculo en la corteza afectada. Este procedimiento es bien tolerado e induce angiogénesis cerebral, reduciendo el riesgo de accidente cerebrovascular isquémico en pacientes con enfermedad de moyamoya ^5,6. Por lo tanto, el procedimiento cumple en gran medida un papel preventivo en estos pacientes. La angiogénesis provocada por este procedimiento también puede tener un papel en la promoción de la protección neurovascular y la recuperación en el contexto del accidente cerebrovascular isquémico. Este informe apoya la hipótesis de que la angiogénesis provocada por EMS tiene el potencial de ampliar la comprensión y las opciones terapéuticas para la isquemia cerebral.

Además de EMS, existen varios enfoques farmacológicos y quirúrgicos para mejorar la angiogénesis, pero tienen varias limitaciones. Se ha encontrado que los enfoques farmacológicos, como la administración del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), son insuficientes o incluso perjudiciales debido a varias limitaciones, incluida la formación de plexos vasculares caóticos, desorganizados, permeables y primitivos, que se asemejan a los encontrados en los tejidos tumorales ^7,8 y no tienen efectos beneficiosos en los ensayos clínicos⁹.

Los abordajes quirúrgicos incluyen anastomosis directa como anastomosis superficial de arteria temporal temporal-arteria cerebral media, anastomosis indirecta como arterio-sinangiosis encefalo-duro (EDAS), encefalomiosinangiosis (EMS) y combinaciones de anastomosis directa e indirecta¹⁰. Todos estos procedimientos son muy desafiantes técnicamente y exigentes en animales pequeños, excepto en EMS. Mientras que los otros procedimientos requieren anastomosis vascular compleja, EMS requiere un injerto muscular relativamente simple. Además, la proximidad del músculo temporal a la corteza lo convierte en una opción natural para el injerto, ya que no necesita ser completamente extirpado o desconectado de su suministro de sangre, como sería necesario si se usara un músculo más distante para el injerto.

EMS ha sido estudiado en modelos de hipoperfusión cerebral crónica en ratas ^7,11. Sin embargo, la EMS que utiliza un injerto de músculo temporal nunca se ha estudiado en el accidente cerebrovascular isquémico agudo en roedores. Aquí, describimos un nuevo protocolo de EMS en ratones después de un accidente cerebrovascular isquémico a través del modelo de oclusión de la arteria cerebral media (MCAo). Este manuscrito sirve como una descripción de los métodos y datos tempranos para este nuevo enfoque de EMS en ratones después de MCAo.

Protocolo

Todos los experimentos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de UConn Health y se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas de los Estados Unidos. El siguiente protocolo debe funcionar en cualquier especie o cepa de roedor. Aquí, se utilizaron ratones machos de tipo salvaje C57BL / 6 de 8 a 12 semanas de edad, de la misma edad y peso. Los ratones fueron alimentados con dieta estándar de comida y agua ad libitum. Las condiciones estándar de la vivienda se mantuvieron a 72.3 ° F y 30% -70% de humedad relativa con un ciclo de luz / oscuridad de 12 h.

1. Preparación previa a la cirugía

1. Esterilice todos los instrumentos en autoclave antes de la cirugía. Desinfecte la superficie de operación con etanol al 70% y caliente la superficie de operación a 37 °C con una almohadilla térmica eléctrica.
2. Utilice una cámara de inducción para anestesiar al ratón con 4% -5% de isoflurano para la inducción. Administrar isoflurano al 1,5% -2,0% a través del cono nasal para el mantenimiento hasta el final de la cirugía. Asegúrese antes de la cirugía de que el ratón esté adecuadamente anestesiado evaluando la falta de respuesta a un pellizco firme de la pata trasera y la pérdida de la reacción postural y el reflejo de enderezamiento.
3. Coloque el mouse en su lado izquierdo en la superficie operativa y aplique ungüento para los ojos para proteger ambos ojos.
4. Afeitar el vello sobre el campo quirúrgico (es decir, el cráneo lateral derecho entre el ojo y la oreja) con cortapelos eléctricos. Limpie el campo quirúrgico en círculos concéntricos hacia afuera desde el centro del sitio quirúrgico, con etanol al 70% seguido de solución de povidona, y repita estos pasos 2x.
   NOTA: Debido a que el sitio de la cirugía está cerca del ojo, la eliminación del 150% del área que rodea un sitio quirúrgico puede no ser posible para evitar irritación o lesiones accidentales en el ojo.
5. Administrar una dosis única de bupivacaína al 0,25% (hasta 8 mg/kg de peso corporal) mediante inyección subcutánea como analgesia preoperatoria en el lugar de la cirugía.
6. Coloque un microscopio quirúrgico con un aumento de 4x. El microscopio se utiliza para todos los pasos quirúrgicos.

2. Procedimiento quirúrgico

NOTA: Los pasos de la cirugía se presentan en la Figura 1. Para este protocolo, se asignaron tres ratones al grupo simulado, tres ratones para EMS solo, 12 ratones para MCAo y 23 ratones para el grupo MCAo + EMS.

1. Cirugía MCAo
   NOTA: MCAo es un modelo bien caracterizado de accidente cerebrovascular isquémico en roedores, según lo descrito por nosotros y otros^12,13,14. Los pasos de la cirugía se describen brevemente aquí. La isquemia cerebral focal transitoria fue inducida por un MCAo derecho de 60 min bajo anestesia con isoflurano seguido de reperfusión durante 7 o 21 días.
   1. Haga una incisión en el cuello ventral en la línea media seguida de MCAo derecho unilateral avanzando un monofilamento recubierto de caucho de silicona 6.0 de 10-11 mm de largo desde la bifurcación de la arteria carótida interna a través de un muñón de la arteria carótida externa. En ratones simulados, realice cirugías idénticas, excepto por el avance de la sutura en la arteria carótida interna.
   2. Mida la temperatura rectal utilizando un sistema de control de temperatura, manteniendo la temperatura a ~ 37 ° C durante la cirugía con una almohadilla térmica automática.
   3. Utilice la flujometría Doppler láser para medir el flujo sanguíneo cerebral antes de la inserción de la sutura colocando la sonda Doppler contra el cráneo lateral (correspondiente al territorio MCA) y registrando el valor⁸. Para confirmar la reducción de la oclusión al 15% del flujo sanguíneo cerebral basal, use el mismo procedimiento después de avanzar en la sutura. Para confirmar la reperfusión, use el mismo procedimiento después de retirar la sutura.
   4. Alimente a todos los animales con puré húmedo hasta el sacrificio y / o 1 semana después de la cirugía para garantizar una nutrición adecuada para los puntos finales crónicos, ya que los animales tienen déficits de cría después del accidente cerebrovascular.
2. Cirugía EMS
   1. Después de 60 minutos de MCAo, aleatorice a los ratones en grupos MCAo solo o MCAo + EMS. Realice EMS 4 h después de MCAo (grupo MCAo + EMS) o cirugía simulada para experimentos seleccionados (grupo solo EMS). Cámbiese a un nuevo par de guantes quirúrgicos estériles antes de la cirugía.
      NOTA: Los ratones se recuperaron de la anestesia después de 60 minutos de MCAo y fueron reanestesiados antes de la cirugía EMS.
   2. Para los grupos que reciben EMS (MCAo + EMS o grupos solo EMS), haga una incisión cutánea de 10-15 mm con tijeras, que se extiende desde 1-2 mm rostral hasta la oreja derecha hasta 1-2 mm caudal hasta el ojo derecho.
      NOTA: Se utilizaron tijeras estériles para evitar daños accidentales en los músculos temporales debajo.
   3. Retraiga los colgajos de piel con pinzas e identifique visualmente el músculo temporal y el cráneo.
   4. Disecciona sin rodeos el músculo temporal lejos del cráneo usando tijeras con una técnica de extensión. Realizar una miotomía de 2-3 mm dirigida ventralmente a lo largo del borde caudal del músculo para facilitar la reflexión ventral.
   5. Realice una craneotomía de ~ 5 mm de diámetro en el cráneo debajo del músculo temporal reflejado usando un micro taladro.
   6. Retire la duramadre con pinzas para exponer la superficie pial del cerebro. Tenga mucho cuidado para evitar lesiones accidentales en el cerebro.
   7. Suturar el borde dorsal del músculo temporal al tejido subcutáneo del colgajo dorsal de piel con filamentos monocrilos 6-0, haciéndolo al ras de la corteza cerebral expuesta.
   8. Cierre la incisión cutánea con sutura de monofilamento 6-0. Coloque el ratón de nuevo en su jaula y monitoree hasta que se recupere de la anestesia. Devuelva el ratón a sus instalaciones de alojamiento.

3. Consideraciones postoperatorias

1. Controle a los ratones para detectar enfermedades y el sitio quirúrgico para detectar infecciones diariamente. Administre solución salina normal subcutánea (1% de volumen por peso corporal) diariamente para apoyar la hidratación.
2. Controle la deshidratación severa (pérdida de peso corporal >20%) hasta 7 días después de la cirugía. Administrar un bolo adicional de solución salina normal subcutánea 1% volumen por peso corporal si >20% pérdida de peso.
3. Proceda con inyecciones, monitoreo fisiológico y otras pruebas sin consideraciones especiales.
   NOTA: En este procedimiento, se evitó el uso de opioides o antiinflamatorios no esteroideos (AINE) para tratar después de la cirugía debido a los efectos conocidos de estos agentes sobre el resultado del accidente cerebrovascular o el tamaño del infarto en consulta con el comité institucional interno de cuidado y uso de animales^15,16,17,18. Sin embargo, el uso de analgesia postoperatoria es muy recomendable para la cirugía EMS con otros modelos. Consulte al Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) para esto.

Resultados

Un total de 41 ratones fueron utilizados para este estudio. Después de tres mortalidades, una en MCAo y dos en MCAo + EMS, se utilizaron un total de 38 ratones para obtener los resultados mostrados.

Estadística
Los datos de cada experimento se presentan como media ± desviación estándar (DE). La significancia se determinó utilizando la prueba t de un estudiante no pareado para comparar dos grupos o ANOVA unidireccional para más de dos grupos, con una prueba post-hoc d...

Discusión

Este protocolo describe un procedimiento EMS exitoso en un modelo de ratón de accidente cerebrovascular inducido por MCAo. Los datos muestran que el tejido injertado sigue siendo viable y puede formar vínculos con la corteza cerebral mucho después de la cirugía EMS. Estos hallazgos apoyan la justificación para usar un injerto muscular cerebral para desarrollar gradualmente un ambiente trófico rico en vascular en el sitio del accidente cerebrovascular. EMS es una terapia prometedora para reparar potencialmente el te...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-0 monocryl suture	Ethilon	697G
70% ethanol to sanitize operating surface	Walgreen
Bupivacaine 0.25% solution	Midwest Vet
Clamps for tissue retraction	Roboz
Doccal suture with Nylon coating	Doccal corporation Sharon MA	602145PK10Re
Electric heating pad for operating surface
Isoflurane anesthesia	Piramal Critical Care Inc
Isoflurane delivery apparatus	--B6Surgivet (Isotech 4)
Micro drill	Harvard Apparatus
Microdissecting tweezers, curved x2	Piramal Critical Care Inc
mouse angiogenesis panel arrat	R& D biotech	ARY015
Needle driver	Ethilon
Ointment for eye protection	walgreen
Operating microscope	Olympus
Operating surface	Olympus
Povidone iodine solution	walgreen
Rectal thermometer	world precison instrument
Saline or 70% ethanol for irrigation	walgreen
Small electric razor to shave operative site	generic
Surgical scissors	Roboz