마우스에서 중뇌동맥 폐색 유발 뇌졸중 후 뇌근육활막증 치료 모델

요약

상기 프로토콜은 뇌척수증-허혈성 뇌 조직의 피알 표면에 혈관 측두근 피판의 이식-모야모야 급성 허혈성 뇌졸중의 치료를 위한 방법을 제공하는 것을 목표로 한다. 혈관신생 증가에 대한 접근법의 효능은 마우스에서 일시적인 중뇌 동맥 폐색 모델을 사용하여 평가됩니다.

초록

허혈성 뇌졸중으로 고통받는 대부분의 환자에게 효과적인 치료법이 없기 때문에 새로운 치료법 개발이 필수적입니다. 허혈성 뇌졸중 후 뇌의자가 치유 능력은 영향을받는 부위의 부적절한 혈액 공급으로 인해 제한됩니다. 뇌척근유혈관증(EMS)은 모야모야병 환자에서 혈관신생을 달성하는 신경외과 절차입니다. 그것은 허혈성 뇌 표면에 혈관 측두근 이식편을 배치하는 개두술을 포함합니다. EMS는 마우스의 급성 허혈성 뇌졸중 환경에서 연구 된 적이 없습니다. 이 연구를 주도하는 가설은 EMS가 근육 이식편을 둘러싼 피질 표면에서 뇌 혈관 신생을 향상 시킨다는 것입니다. 여기에 표시된 프로토콜은 절차를 설명하고 EMS 접근 방식의 타당성과 효율성을 뒷받침하는 초기 데이터를 제공합니다. 이 프로토콜에서, 60분의 일과성 중뇌 동맥 폐색 (MCAo) 후, 마우스를 MCAo 또는 MCAo+ EMS 치료로 무작위 배정하였다. EMS는 폐색 후 3-4 시간 후에 수행되었습니다. 마우스를 MCAo 또는 MCAo+ EMS 처리 후 7일 또는 21일에 희생시켰다. 측두엽 이식편 생존율은 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 환원-테트라졸륨 환원효소 분석을 사용하여 측정하였다. 마우스 혈관신생 어레이는 혈관신생 및 신경조절 단백질 발현을 정량화하였다. 면역 조직 화학은 뇌 피질과의 이식 결합 및 혈관 밀도의 변화를 시각화하는 데 사용되었습니다. 여기의 예비 데이터는 이식 된 근육이 EMS 후 21 일 동안 생존 할 수 있음을 시사합니다. 면역염색은 성공적인 이식편 이식 및 근육 이식편 근처의 혈관 밀도 증가를 나타내어 혈관신생 증가를 나타냅니다. 데이터에 따르면 EMS는 뇌졸중 후 섬유 아세포 성장 인자 (FGF)를 증가시키고 오스테오폰틴 수치를 감소시킵니다. 또한 뇌졸중 후 EMS는 사망률을 증가시키지 않아 프로토콜이 안전하고 신뢰할 수 있음을 시사합니다. 이 새로운 절차는 효과적이고 내약성이 좋으며 급성 허혈성 뇌졸중 후 향상된 혈관 신생을위한 새로운 중재에 대한 정보를 제공 할 가능성이 있습니다.

서문

허혈성 뇌졸중은 치명적인 만성 후유증을 동반한 급성 신경혈관 손상입니다. 미국에서 연간 650,000명인 뇌졸중 생존자의 대부분은 영구적인 기능 장애로 고통받고^{있습니다1.} 사용 가능한 치료법 중 어느 것도 허혈성 뇌졸중의 급성기 이후에 신경 보호 및 기능 회복을 부여하지 않습니다. 급성 허혈성 뇌졸중 후 직접 및 부수적 혈액 공급이 모두 감소하여 뇌 세포와 네트워크의 기능 장애를 유발하여 갑작스러운 신경 학적 결손을 초래합니다 ^2,3. 허혈성 부위로의 혈액 공급 회복은 뇌졸중 치료의 최우선 목표입니다. 따라서, 허혈성 영역에서의 혈액 공급을 촉진하기 위해 혈관 신생을 향상시키는 것은 유망한 치료 접근법이다; 그러나, 에리스로포이에틴, 스타틴 및 성장 인자를 포함하는 뇌졸중 후 혈관신생을 촉진하기 위해 이전에 연구된 방법은 허용할 수 없는 수준의 독성 또는^{번역가능성에} 의해 제한되었다4.

뇌척근유막증(EMS)은 종종 뇌졸중으로 이어지는 좁아진 두개골 동맥의 상태인 모야모야병을 앓고 있는 인간의 뇌 혈관 신생을 향상시키는 수술 절차입니다. EMS는 두개골에서 환자의 측두근의 혈관 부분을 부분적으로 분리 한 다음 개두술과 근육을 영향을받는 피질에 이식하는 것을 포함합니다. 이 절차는 내약성이 뛰어나고 뇌 혈관 신생을 유도하여 모야 모야 질환 환자의 허혈성 뇌졸중 위험을 줄입니다 ^5,6. 따라서이 절차는 이러한 환자에게 주로 예방 역할을합니다. 이 절차에 의해 야기 된 혈관 신생은 또한 허혈성 뇌졸중의 설정에서 신경 혈관 보호 및 회복을 촉진하는 역할을 할 수 있습니다. 이 보고서는 EMS로 인한 혈관 신생이 뇌 허혈에 대한 이해와 치료 옵션을 확장 할 가능성이 있다는 가설을지지합니다.

EMS 외에도 혈관 신생을 개선하기위한 몇 가지 약리학 적 및 외과 적 접근법이 있지만 몇 가지 한계가 있습니다. 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 투여와 같은 약리학 적 접근법은 종양 조직 ^7,8에서 발견되는 것과 유사하고 임상 시험⁹에서 유익한 효과가 없는 혼란스럽고 무질서하며 누출되고 원시 혈관 신경총의 형성을 포함하여 몇 가지 한계로 인해 불충분하거나 심지어 해로운 것으로 밝혀졌습니다.

외과적 접근법은 표재성 측두동맥-중대뇌 동맥 문합과 같은 직접 문합, 뇌-듀로 동맥-유혈관증(EDAS)과 같은 간접 문합, 뇌척근유막증(EMS), 및 직접 및 간접 문합(¹⁰)의 조합을 포함한다. 이 모든 절차는 EMS를 제외하고 작은 동물에서 기술적으로 매우 어렵고 까다 롭습니다. 다른 절차에는 복잡한 혈관 문합이 필요하지만 EMS에는 비교적 간단한 근육 이식이 필요합니다. 또한, 측두근과 피질의 근접성은 이식에 더 먼 근육이 사용되는 경우 필요한 것처럼 혈액 공급에서 완전히 절제되거나 분리 될 필요가 없기 때문에 이식을위한 자연스러운 선택입니다.

EMS는 쥐 ^7,11의 만성 대뇌 저관류 모델에서 연구되었습니다. 그러나, 측두근 이식편을 이용한 EMS는 설치류의 급성 허혈성 뇌졸중에서 연구된 적이 없다. 여기에서는 중뇌 동맥 폐색 모델 (MCAo)을 통한 허혈성 뇌졸중 후 마우스에서 EMS의 새로운 프로토콜을 설명합니다. 이 원고는 MCAo 이후 마우스에서 EMS에 대한이 새로운 접근법에 대한 방법 및 초기 데이터에 대한 설명으로 사용됩니다.

프로토콜

모든 실험은 UConn Health의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았으며 미국 지침에 따라 수행되었습니다. 다음 프로토콜은 설치류의 모든 종 또는 균주에서 작동해야합니다. 여기에서, 8 내지 12주령, 연령 및 체중 매칭 C57BL/6 야생형 수컷 마우스를 사용하였다. 마우스는 표준 차우 식단 과 물을 먹였습니다. 표준 하우징 조건은 72.3 시간 명암 주기로 30 ° F 및 70 % -12 % 상대 습도로 유지되었습니다.

1. 수술 전 준비

1. 수술 전에 오토클레이빙으로 모든 기구를 소독하십시오. 작동 표면을 70 % 에탄올로 살균하고 전기 가열 패드로 작동 표면을 37 ° C로 따뜻하게합니다.
2. 유도 챔버를 사용하여 유도를 위해 4%-5% 이소플루란으로 마우스를 마취합니다. 수술이 끝날 때까지 유지 보수를 위해 코 콘을 통해 1.5 % -2.0 % 이소 플루 란을 전달합니다. 수술 전에 단단한 뒷발 꼬집음에 대한 반응의 부족과 자세 반응의 상실 및 올바른 반사를 평가하여 마우스가 적절하게 마취되었는지 확인하십시오.
3. 마우스를 작동 표면의 왼쪽에 놓고 눈 연고를 바르면 두 눈을 보호합니다.
4. 전기 클리퍼로 수술 부위(즉, 눈과 귀 사이의 오른쪽 측면 두개골) 위로 머리카락을 면도합니다. 수술 부위 중앙에서 바깥쪽으로 동심원으로 수술 부위를 청소하고 70 % 에탄올과 포비돈 용액을 사용하여이 단계를 2 배 반복하십시오.
   참고: 수술 부위가 눈에 가깝기 때문에 수술 부위 주변 부위를 150% 제거하면 눈에 대한 자극이나 우발적인 부상을 피할 수 없습니다.
5. 수술 부위에 수술 전 진통제로 0.25 % 부피 바카 인 (최대 8mg / kg 체중)을 피하 주사로 1 회 투여하십시오.
6. 수술용 현미경을 4배 배율로 설정합니다. 현미경은 모든 수술 단계에 사용됩니다.

2. 수술 절차

참고: 수술 단계는 그림 1에 나와 있습니다. 이 프로토콜을 위해, 3마리의 마우스를 가짜 그룹에, 3마리의 마우스를 EMS 단독으로, 12마리의 마우스를 MCAo에 대해, 및 23마리의 마우스를 MCAo+ EMS 그룹에 할당하였다.

1. MCAo 수술
   참고 : MCAo는 우리와 다른 사람들^12,13,14에 의해 설명 된 바와 같이 설치류에서 허혈성 뇌졸중의 잘 특성화 된 모델입니다. 수술 단계는 여기에 간략하게 설명되어 있습니다. 국소 일과성 뇌 허혈은 이소플루란 마취 하에 60분 우측 MCAo에 의해 유도되었고, 이어서 7일 또는 21일 동안 재관류되었다.
   1. 외경동맥 그루터기를 통해 내경동맥 분기점에서 10-11mm 길이의 6.0mm 실리콘 고무 코팅 모노필라멘트를 전진시켜 정중선 복부 경부 절개 후 편측적 오른쪽 MCAo를 만듭니다. 가짜 마우스에서는 봉합사가 내 경동맥으로 전진하는 것을 제외하고는 동일한 수술을 수행하십시오.
   2. 온도 제어 시스템을 사용하여 직장 온도를 측정하고 자동 가열 패드로 수술 중 온도를 ~ 37 ° C로 유지합니다.
   3. 레이저 도플러 유량 측정을 사용하여 봉합사 삽입 전에 도플러 프로브를 측면 두개골(MCA 영역에 해당)에 대고 값⁸을 기록하여 뇌 혈류를 측정합니다. 기준 뇌 혈류의 15 %까지 폐색 감소를 확인하려면 봉합이 진행된 후 동일한 절차를 사용하십시오. 재관류를 확인하려면 봉합사를 제거한 후 동일한 절차를 사용하십시오.
   4. 동물은 뇌졸중 후 양육 결핍이 있으므로 만성 종점에 대한 적절한 영양을 보장하기 위해 희생 될 때까지 및 / 또는 수술 후 1 주일까지 모든 동물에게 젖은 매쉬를 먹이십시오.
2. 응급의료외과
   1. MCAo의 60분 후, 마우스를 MCAo 전용 또는 MCAo + EMS 그룹으로 무작위 배정한다. MCAo (MCAo + EMS 그룹) 후 EMS 4 시간 또는 일부 실험 (EMS 전용 그룹)에 대한 가짜 수술을 수행합니다. 수술 전에 새로운 멸균 수술 장갑으로 교체하십시오.
      참고: 마우스는 MCAo 60분 후에 마취에서 회복되었고 EMS 수술 전에 다시 마취되었습니다.
   2. EMS (MCAo + EMS 또는 EMS 전용 그룹)를받는 그룹의 경우 가위로 10-15mm 피부 절개를하여 1-2mm 주둥이에서 오른쪽 귀까지 1-2mm 꼬리까지 연장합니다.
      알림: 아래의 측두근에 우발적 인 손상을 방지하기 위해 멸균 가위를 사용했습니다.
   3. 클램프를 사용하여 피부 플랩을 수축시키고 측두근과 두개골을 시각적으로 식별합니다.
   4. 퍼짐 기술로 가위를 사용하여 두개골에서 측두근을 무뚝뚝하게 해부하십시오. 복부 반사를 촉진하기 위해 근육의 꼬리 경계를 따라 복부로 향하는 2-3mm 근절개술을 수행하십시오.
   5. 마이크로 드릴을 사용하여 반사된 측두근 아래의 두개골에서 직경 ~5mm의 개두술을 시행합니다.
   6. 핀셋으로 경막을 제거하여 뇌의 표면이 노출됩니다. 우발적 인 뇌 손상을 방지하기 위해 각별히주의하십시오.
   7. 측두근의 등쪽 경계를 6-0 개의 모노 크릴 필라멘트로 등쪽 피부 플랩의 피하 조직에 봉합하여 노출 된 대뇌 피질과 같은 높이로 만듭니다.
   8. 6-0 모노 필라멘트 봉합사로 피부 절개를 닫습니다. 마우스를 케이지에 다시 넣고 마취에서 회복 될 때까지 모니터링하십시오. 마우스를 하우징 시설로 되돌립니다.

3. 수술 후 고려 사항

1. 마우스의 질병 및 수술 부위의 감염 여부를 매일 모니터링하십시오. 수분 공급을 지원하기 위해 매일 피하 생리식염수(체중 기준 1% 부피)를 투여하십시오.
2. 수술 후 7 일까지 심한 탈수 (체중 감소 >20 %)를 모니터링하십시오. 체중 감소의 경우 체중에 대해 1 부피% 부피%의 피하 정상 생리 식염수를 추가로 투여>.
3. 특별한 고려 사항 없이 주사, 생리학적 모니터링 및 기타 검사를 진행하십시오.
   참고: 이 절차에서는 사내 기관 동물 관리 및 사용 위원회^15,16,17,18과 협의하여 뇌졸중 결과 또는 경색 크기에 대한 이러한 약제의 알려진 영향으로 인해 수술 후 치료를 위한 아편유사제 또는 비스테로이드성 항염증제(NSAID)의 사용을 피했습니다. 그러나 수술 후 진통제의 사용은 다른 모델과의 EMS 수술에 적극 권장됩니다. 이에 대해서는 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)에 문의하십시오.

결과

총 41마리의 마우스를 본 연구에 사용하였다. MCAo에서 1마리, MCAo+EMS에서 2마리, 총 38마리의 마우스가 사망한 후 나타낸 결과를 얻기 위해 사용되었습니다.

통계
각 실험의 데이터는 평균 ± 표준 편차(SD)로 표시됩니다. 유의성은 두 그룹을 비교하기 위해 짝을 이루지 않은 학생의 t-검정 또는 두 개 이상의 그룹에 대한 일원 분산 분석을 사용하여 결정되었으며, 다...

토론

이 프로토콜은 MCAo-유도 뇌졸중의 마우스 모델에서 성공적인 EMS 절차를 설명한다. 데이터는 이식 된 조직이 생존 가능하고 EMS 수술 후에도 오랫동안 뇌 피질과 결합을 형성 할 수 있음을 보여줍니다. 이러한 발견은 뇌졸중 부위에서 풍부한 혈관 영양 환경을 점진적으로 개발하기 위해 대뇌 근육 이식편을 사용하는 근거를 뒷받침합니다. EMS는 동일한 환경에서 경색 된 뇌 조직을 잠재적으로 복구하...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-0 monocryl suture	Ethilon	697G
70% ethanol to sanitize operating surface	Walgreen
Bupivacaine 0.25% solution	Midwest Vet
Clamps for tissue retraction	Roboz
Doccal suture with Nylon coating	Doccal corporation Sharon MA	602145PK10Re
Electric heating pad for operating surface
Isoflurane anesthesia	Piramal Critical Care Inc
Isoflurane delivery apparatus	--B6Surgivet (Isotech 4)
Micro drill	Harvard Apparatus
Microdissecting tweezers, curved x2	Piramal Critical Care Inc
mouse angiogenesis panel arrat	R& D biotech	ARY015
Needle driver	Ethilon
Ointment for eye protection	walgreen
Operating microscope	Olympus
Operating surface	Olympus
Povidone iodine solution	walgreen
Rectal thermometer	world precison instrument
Saline or 70% ethanol for irrigation	walgreen
Small electric razor to shave operative site	generic
Surgical scissors	Roboz