Um modelo para o tratamento da encefalomiossinangiose após acidente vascular cerebral induzido pela oclusão da artéria cerebral média em camundongos

Resumo

O protocolo tem como objetivo fornecer métodos para encefalomiossinangiose - enxerto de um retalho vascular do músculo temporal na superfície pial do tecido cerebral isquêmico - para o tratamento de acidente vascular cerebral isquêmico agudo não-moyamoya. A eficácia da abordagem no aumento da angiogênese é avaliada usando um modelo transitório de oclusão da artéria cerebral média em camundongos.

Resumo

Não há tratamento eficaz disponível para a maioria dos pacientes que sofrem de acidente vascular cerebral isquêmico, tornando imperativo o desenvolvimento de novas terapêuticas. A capacidade do cérebro de se auto-curar após o acidente vascular cerebral isquêmico é limitada pelo suprimento inadequado de sangue na área afetada. A encefalomiossinangiose (EMS) é um procedimento neurocirúrgico que atinge a angiogênese em pacientes com doença de moyamoya. Envolve craniotomia com colocação de um enxerto de músculo temporal vascular na superfície cerebral isquêmica. EMS nunca foi estudado no contexto de acidente vascular cerebral isquêmico agudo em camundongos. A hipótese que conduz este estudo é que o EMS aumenta a angiogênese cerebral na superfície cortical ao redor do enxerto muscular. O protocolo mostrado aqui descreve o procedimento e fornece dados iniciais que apoiam a viabilidade e a eficácia da abordagem EMS. Neste protocolo, após 60 min de oclusão transitória da artéria cerebral média (MCAo), os camundongos foram randomizados para o tratamento com MCAo ou MCAo + EMS. O EMS foi realizado 3-4 h após a oclusão. Os camundongos foram sacrificados 7 ou 21 dias após o tratamento com MCAo ou MCAo + EMS. A viabilidade do enxerto temporal foi medida usando o ensaio de nicotinamida adenina dinucleotídeo redutase reduzida-tetrazólio. Uma matriz de angiogênese de camundongo quantificou a expressão de proteínas angiogênicas e neuromoduladoras. A imuno-histoquímica foi utilizada para visualizar a ligação do enxerto com o córtex cerebral e a alteração na densidade dos vasos. Os dados preliminares aqui apresentados sugerem que o músculo enxertado permaneceu viável 21 dias após a EMS. A imunocoloração mostrou sucesso no implante do enxerto e aumento da densidade dos vasos próximos ao enxerto muscular, indicando aumento da angiogênese. Os dados mostram que o EMS aumenta o fator de crescimento de fibroblastos (FGF) e diminui os níveis de osteopontina após o acidente vascular cerebral. Além disso, a EMS após acidente vascular cerebral não aumentou a mortalidade, sugerindo que o protocolo é seguro e confiável. Este novo procedimento é eficaz e bem tolerado e tem o potencial de fornecer informações de novas intervenções para angiogênese aumentada após acidente vascular cerebral isquêmico agudo.

Introdução

O acidente vascular cerebral isquêmico é uma lesão neurovascular aguda com sequelas crônicas devastadoras. A maioria dos sobreviventes de AVC, 650.000 por ano, nos EUA sofre de incapacidade funcional permanente¹. Nenhum dos tratamentos disponíveis confere neuroproteção e recuperação funcional após a fase aguda do AVC isquêmico. Após um acidente vascular cerebral isquêmico agudo, os estoques sanguíneos diretos e colaterais são diminuídos, o que leva à disfunção das células e redes cerebrais, resultando em déficits neurológicos súbitos ^2,3. A restauração do suprimento de sangue para a região isquêmica continua sendo o principal objetivo da terapia de AVC. Assim, o aumento da angiogênese para promover o suprimento sanguíneo no território isquêmico é uma abordagem terapêutica promissora; no entanto, métodos previamente estudados para promover a angiogênese pós-AVC, incluindo eritropoietina, estatinas e fatores de crescimento, têm sido limitados por níveis inaceitáveis de toxicidade ou traduzibilidade⁴.

A encefalomiossinangiose (EMS) é um procedimento cirúrgico que aumenta a angiogênese cerebral em humanos com doença de moyamoya, uma condição de artérias cranianas estreitadas que muitas vezes leva a acidente vascular cerebral. EMS envolve o descolamento parcial de uma seção vascular do músculo temporal do paciente do crânio, seguido de craniotomia e enxerto do músculo no córtex afetado. Esse procedimento é bem tolerado e induz angiogênese cerebral, reduzindo o risco de acidente vascular cerebral isquêmico em pacientes com doença de moyamoya ^5,6. Assim, o procedimento serve em grande parte um papel preventivo nesses pacientes. A angiogênese provocada por esse procedimento também pode ter um papel na promoção da proteção e recuperação neurovascular no contexto de acidente vascular cerebral isquêmico. Este relatório apoia a hipótese de que a angiogênese provocada pela EMS tem o potencial de expandir a compreensão e as opções terapêuticas para isquemia cerebral.

Além do EMS, existem várias abordagens farmacológicas e cirúrgicas para melhorar a angiogênese, mas elas têm várias limitações. Abordagens farmacológicas, como a administração de fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), mostraram-se insuficientes ou mesmo prejudiciais devido a diversas limitações, incluindo a formação de plexos vasculares caóticos, desorganizados, com vazamento e primitivos, que se assemelham aos encontrados nos tecidos tumorais ^7,8 e não têm efeitos benéficos em ensaios clínicos⁹.

As abordagens cirúrgicas incluem anastomose direta, como anastomose superficial da artéria temporal média-artéria cerebral, anastomose indireta, como encefalo-duro arterio-synangiose (EDAS), encefalomiossinangiose (EMS) e combinações de anastomose direta e indireta¹⁰. Todos esses procedimentos são tecnicamente muito desafiadores e exigentes em pequenos animais, exceto no EMS. Enquanto os outros procedimentos requerem anastomose vascular complexa, o EMS requer um enxerto muscular relativamente simples. Além disso, a proximidade do músculo temporal com o córtex o torna uma escolha natural para o enxerto, pois não precisa ser completamente excisado ou desconectado de seu suprimento sanguíneo, como seria necessário se um músculo mais distante fosse usado para enxerto.

A EMS tem sido estudada em modelos de hipoperfusão cerebral crônica em ratos ^7,11. No entanto, o EMS usando um enxerto de músculo temporal nunca foi estudado no acidente vascular cerebral isquêmico agudo em roedores. Aqui, descrevemos um novo protocolo de EMS em camundongos após um acidente vascular cerebral isquêmico via modelo de oclusão da artéria cerebral média (MCAo). Este manuscrito serve como uma descrição de métodos e dados iniciais para esta nova abordagem de EMS em camundongos após MCAo.

Protocolo

Todos os experimentos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da UConn Health e conduzidos de acordo com as diretrizes dos EUA. O protocolo a seguir deve funcionar em qualquer espécie ou cepa de roedor. Aqui, foram utilizados camundongos machos C57BL/6 do tipo selvagem C57BL/6 de 8 a 12 semanas de idade, idade e peso. Os ratos foram alimentados com dieta de ração padrão e água ad libitum. As condições padrão de alojamento foram mantidas a 72,3 °F e 30%-70% de umidade relativa com um ciclo claro/escuro de 12 h.

1. Preparação pré-cirúrgica

1. Esterilizar todos os instrumentos por autoclave antes da cirurgia. Higienize a superfície de operação com etanol a 70% e aqueça a superfície de operação a 37 °C com uma almofada de aquecimento elétrico.
2. Use uma câmara de indução para anestesiar o camundongo com isoflurano a 4% a 5% para indução. Administrar 1,5%-2,0% de isoflurano via cone nasal para manutenção até o final da cirurgia. Certifique-se, antes da cirurgia, de que o rato está devidamente anestesiado, avaliando a falta de uma resposta a uma pitada firme do pé traseiro e a perda da reação postural e do reflexo de endireitamento.
3. Coloque o rato no seu lado esquerdo na superfície de operação e aplique pomada ocular para proteger ambos os olhos.
4. Raspe o cabelo sobre o campo cirúrgico (ou seja, crânio lateral direito entre o olho e a orelha) com cortadores elétricos. Limpe o campo cirúrgico em círculos concêntricos para fora do meio do local cirúrgico, com etanol a 70% seguido de solução de povidona, e repita esses passos 2x.
   NOTA: Devido ao local da cirurgia estar perto do olho, a remoção de 150% da área ao redor de um local cirúrgico pode não ser possível evitar irritação ou lesão acidental no olho.
5. Administrar uma dose única de bupivacaína a 0,25% (até 8 mg/kg de peso corporal) por injeção subcutânea como analgesia pré-operatória no local da cirurgia.
6. Configure um microscópio cirúrgico com ampliação de 4x. O microscópio é usado para todas as etapas cirúrgicas.

2. Procedimento cirúrgico

NOTA: As etapas da cirurgia são apresentadas na Figura 1. Para este protocolo, três camundongos foram alocados no grupo simulado, três camundongos apenas para EMS, 12 camundongos para MCAo e 23 camundongos para o grupo MCAo + EMS.

1. Cirurgia MCAo
   NOTA: O MCAo é um modelo bem caracterizado de acidente vascular cerebral isquêmico em roedores, conforme descrito por nós e outros^12,13,14. As etapas da cirurgia são descritas em resumo aqui. A isquemia cerebral transitória focal foi induzida por um MCAo direito de 60 minutos sob anestesia com isoflurano seguido de reperfusão por 7 ou 21 dias.
   1. Faça uma incisão no pescoço ventral da linha média seguida de MCAo direito unilateral, avançando um monofilamento revestido de borracha de silicone de 6,0 mm de 10-11 mm de comprimento da bifurcação da artéria carótida interna através de um coto externo da artéria carótida. Em camundongos simulados, realizar cirurgias idênticas, exceto para o avanço da sutura na artéria carótida interna.
   2. Meça as temperaturas retais usando um sistema de controle de temperatura, mantendo a temperatura em ~ 37 ° C durante a cirurgia com uma almofada de aquecimento automática.
   3. Utilizar a dopplerfluxometria a laser para medir o fluxo sanguíneo cerebral antes da inserção da sutura, colocando a sonda Doppler contra o crânio lateral (correspondente ao território da ACM) e registrando o valor⁸. Para confirmar a redução da oclusão para 15% do fluxo sanguíneo cerebral basal, use o mesmo procedimento após o avanço da sutura. Para confirmar a reperfusão, use o mesmo procedimento após a sutura ser removida.
   4. Alimente todos os animais com mosto molhado até o sacrifício e/ou 1 semana após a cirurgia para garantir uma nutrição adequada para desfechos crônicos, pois os animais apresentam déficits de criação após acidente vascular cerebral.
2. Cirurgia EMS
   1. Após 60 minutos de MCAo, randomize os camundongos em grupos somente MCAo ou MCAo + EMS. Realizar EMS 4 h após MCAo (grupo MCAo + EMS) ou cirurgia simulada para experimentos selecionados (grupo somente EMS). Mude para um novo par de luvas cirúrgicas estéreis antes da cirurgia.
      NOTA: Os camundongos se recuperaram da anestesia após 60 minutos de MCAo e foram reanestesiados antes da cirurgia EMS.
   2. Para grupos que recebem EMS (MCAo + EMS ou grupos somente EMS), faça uma incisão de pele de 10-15 mm com tesoura, estendendo-se de 1-2 mm rostral para a orelha direita para 1-2 mm caudal para o olho direito.
      NOTA: Tesouras estéreis foram usadas para evitar danos acidentais aos músculos temporais por baixo.
   3. Retraia os retalhos cutâneos usando grampos e identifique visualmente o músculo temporal e o crânio.
   4. Disseque sem rodeios o músculo temporal para longe do crânio usando uma tesoura com uma técnica de espalhamento. Realizar uma miotomia de 2-3 mm direcionada ventralmente ao longo da borda caudal do músculo para facilitar a reflexão ventral.
   5. Realize uma craniotomia ~ 5 mm de diâmetro no crânio sob o músculo temporal refletido usando uma microbroca.
   6. Remova a dura-máter com uma pinça para expor a superfície pial do cérebro. Tenha extrema cautela para evitar lesões acidentais no cérebro.
   7. Suture a borda dorsal do músculo temporal para o tecido subcutâneo do retalho cutâneo dorsal com filamentos monocrilos 6-0, tornando-o nivelado ao córtex cerebral exposto.
   8. Feche a incisão da pele com sutura de monofilamento 6-0. Coloque o rato de volta na gaiola e monitorize até à recuperação da anestesia. Devolva o mouse ao seu compartimento.

3. Considerações pós-operatórias

1. Monitore os ratos para a doença e o local cirúrgico para a infecção diariamente. Dê solução salina normal subcutânea (1% de volume por peso corporal) diariamente para apoiar a hidratação.
2. Monitore a desidratação grave (perda de peso corporal >20%) até 7 dias após a cirurgia. Administrar um bolus adicional de solução salina normal subcutânea 1% em volume por peso corporal se >20% de perda de peso.
3. Prossiga com injeções, monitoramento fisiológico e outros testes sem considerações especiais.
   NOTA: Neste procedimento, o uso de opioides ou anti-inflamatórios não esteroidais (AINEs) para o tratamento pós-operatório foi evitado devido aos efeitos conhecidos desses agentes no desfecho do AVC ou no tamanho do infarto em consulta com o comitê institucional interno de cuidados e uso de animais^15,16,17,18. No entanto, o uso de analgesia pós-operatória é altamente encorajado para a cirurgia EMS com outros modelos. Consulte o Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) para isso.

Resultados

Um total de 41 camundongos foram utilizados para este estudo. Após três mortalidades, uma em MCAo e duas em MCAo + EMS, um total de 38 camundongos foram utilizados para a obtenção dos resultados apresentados.

Estatística
Os dados de cada experimento são apresentados como média ± desvio padrão (S.D.). A significância foi determinada usando o teste t de Student não pareado para comparar dois grupos ou ANOVA one-way para mais de dois grupos, com um teste post-hoc de...

Discussão

Este protocolo descreve um procedimento EMS bem-sucedido em um modelo de camundongo de acidente vascular cerebral induzido por MCAo. Os dados mostram que o tecido enxertado permanece viável e pode formar ligações com o córtex cerebral muito tempo após a cirurgia EMS. Esses achados apoiam a lógica para o uso de um enxerto muscular cerebral para desenvolver gradualmente um ambiente trófico ricamente vascular no local do acidente vascular cerebral. EMS é uma terapia promissora para potencialmente reparar o tecido ce...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-0 monocryl suture	Ethilon	697G
70% ethanol to sanitize operating surface	Walgreens
Bupivacaine 0.25% solution	Midwest Vet
Clamps for tissue retraction	Roboz
Doccal suture with silicone coating	Doccal Corporation	602145PK10Re
Electric heating pad for operating surface
Isoflurane anesthesia	Piramal Critical Care Inc
Isoflurane delivery apparatus	B6Surgivet (Isotech 4)
Micro drill	Harvard Apparatus
Microdissecting tweezers, curved x2	Piramal Critical Care Inc
mouse angiogenesis panel arrat	R& D biotech	ARY015
Needle driver	Ethilon
Ointment for eye protection	Walgreens
Operating microscope	Olympus
Operating surface	Olympus
Povidone iodine solution	Walgreens
Rectal thermometer	world precison instrument
Saline or 70% ethanol for irrigation	Walgreens
Small electric razor to shave operative site	Generic
Surgical scissors	Roboz