מודל לטיפול באנצפלומיוסיננגיוזיס לאחר שבץ מוחי הנגרם על ידי חסימת עורקים מוחיים באמצע בעכברים

Summary

הפרוטוקול נועד לספק שיטות לאנצפלומיוסיננגיוזיס - השתלה של דש שריר טמפורליס וסקולרי על פני השטח של רקמת מוח איסכמית - לטיפול בשבץ איסכמי שאינו מויאמויה. יעילות הגישה בהגברת אנגיוגנזה מוערכת באמצעות מודל חסימה חולף של עורק מוחי אמצעי בעכברים.

Abstract

אין טיפול יעיל זמין עבור רוב החולים הסובלים משבץ איסכמי, מה שהופך את הפיתוח של טיפולים חדשניים הכרחי. יכולתו של המוח לרפא את עצמו לאחר שבץ איסכמי מוגבלת על ידי אספקת דם לא מספקת באזור הפגוע. אנצפלומיוסיננגיוזיס (EMS) הוא הליך נוירוכירורגי המשיג אנגיוגנזה בחולים עם מחלת מויאמויה. זה כרוך craniotomy עם מיקום של שתל שריר temporalis כלי הדם על פני השטח של המוח איסכמי. EMS מעולם לא נחקר במסגרת שבץ איסכמי חריף בעכברים. ההשערה המניעה את המחקר היא ש-EMS משפר את האנגיוגנזה המוחית במשטח קליפת המוח המקיף את שתל השריר. הפרוטוקול המוצג כאן מתאר את ההליך ומספק נתונים ראשוניים התומכים בהיתכנות וביעילות של גישת EMS. בפרוטוקול זה, לאחר 60 דקות של חסימת עורק מוחי אמצעי חולף (MCAo), עכברים שובצו באקראי לטיפול MCAo או MCAo + EMS. ה- EMS בוצע 3-4 שעות לאחר החסימה. העכברים הוקרבו 7 או 21 יום לאחר טיפול MCAo או MCAo + EMS. כדאיות השתל הטמפורליס נמדדה באמצעות בדיקת ניקוטינאמיד אדנין דינוקלאוטיד מופחת-טטרזוליום רדוקטאז. מערך אנגיוגנזה של עכבר כימת ביטוי חלבונים אנגיוגניים ונוירומודולטוריים. אימונוהיסטוכימיה שימשה להדמיה של קשר שתלים עם קליפת המוח ושינוי בצפיפות כלי הדם. הנתונים הראשוניים כאן מצביעים על כך ששריר מושתל נשאר בר קיימא 21 יום לאחר EMS. אימונוסטינינג הראה השתלה מוצלחת ועלייה בצפיפות כלי הדם ליד השתלת השריר, מה שמעיד על אנגיוגנזה מוגברת. הנתונים מראים כי EMS מגביר את גורם הגדילה של פיברובלסטים (FGF) ומוריד את רמות האוסטאופונטין לאחר שבץ מוחי. בנוסף, EMS לאחר שבץ לא העלה את התמותה מה שמרמז על כך שהפרוטוקול בטוח ואמין. הליך חדשני זה יעיל ונסבל היטב ויש לו פוטנציאל לספק מידע על התערבויות חדשניות לאנגיוגנזה משופרת לאחר שבץ איסכמי חריף.

Introduction

שבץ איסכמי הוא פגיעה נוירו-וסקולרית חריפה עם sequelae כרונית הרסנית. רוב הסובלים משבץ מוחי, 650,000 בשנה, בארה"ב סובלים מנכות תפקודית קבועה¹. אף אחד מהטיפולים הזמינים אינו מעניק הגנה עצבית והתאוששות תפקודית לאחר השלב החריף של שבץ איסכמי. לאחר שבץ איסכמי חריף, אספקת הדם הישירה והבטוחה פוחתת, מה שמוביל לתפקוד לקוי של תאי המוח והרשתות, וכתוצאה מכך לליקויים נוירולוגיים פתאומיים ^2,3. שיקום אספקת הדם לאזור האיסכמי נותר המטרה הראשונה במעלה של טיפול בשבץ מוחי. לפיכך, שיפור אנגיוגנזה כדי לקדם את אספקת הדם בשטח איסכמי היא גישה טיפולית מבטיחה; עם זאת, שיטות שנחקרו בעבר לקידום אנגיוגנזה לאחר שבץ, כולל אריתרופואיטין, סטטינים וגורמי גדילה, הוגבלו על ידי רמות בלתי מתקבלות על הדעת של רעילות או תרגום⁴.

אנצפלומיוסיננגיוזיס (EMS) הוא הליך כירורגי המשפר אנגיוגנזה מוחית בבני אדם עם מחלת moyamoya, מצב של עורקי גולגולת צרים שלעתים קרובות מוביל לשבץ. EMS כולל ניתוק חלקי של קטע כלי הדם של שריר הטמפורליס של המטופל מהגולגולת, ולאחר מכן קרניוטומיה והשתלה של השריר על קליפת המוח הפגועה. הליך זה נסבל היטב ומשרה אנגיוגנזה מוחית, הפחתת הסיכון לשבץ איסכמי בחולים עם מחלת moyamoya ^5,6. לפיכך, ההליך משמש במידה רבה תפקיד מניעתי בחולים אלה. לאנגיוגנזה שנגרמת על ידי הליך זה עשוי להיות גם תפקיד בקידום הגנה נוירו-וסקולרית והתאוששות בסביבה של שבץ איסכמי. דו"ח זה תומך בהשערה כי אנגיוגנזה שנוצרה על ידי EMS יש פוטנציאל להרחיב את ההבנה ואת האפשרויות הטיפוליות עבור איסכמיה מוחית.

לצד EMS, ישנן מספר גישות פרמקולוגיות וכירורגיות לשיפור אנגיוגנזה, אך יש להן מספר מגבלות. גישות פרמקולוגיות כגון מתן פקטור גדילה אנדותל וסקולרי (VEGF) נמצאו כבלתי מספקות או אפילו מזיקות בשל מספר מגבלות, כולל היווצרות של פלקסוסים כאוטיים, לא מאורגנים, דולפים ופרימיטיביים של כלי הדם, הדומים לאלה שנמצאו ברקמות הגידול ^7,8 ואין להם השפעות מועילות בניסויים קליניים⁹.

גישות כירורגיות כוללות אנסטומוזיס ישיר כגון אנסטומוזיס עורק רקיע-עורקי מוח אמצעי-שטחי שטחי, אנסטומוזיס עקיף כגון אנצפלו-דורו עורקי-סיננגיוזיס (EDAS), אנצפלומיוסיננגיוזיס (EMS), ושילובים של אנסטומוזיס ישיר ועקיף¹⁰. כל ההליכים הללו מאתגרים מאוד מבחינה טכנית ותובעניים בבעלי חיים קטנים, למעט EMS. בעוד שההליכים האחרים דורשים אנסטומוזיס וסקולרי מורכב, EMS דורש השתלת שריר פשוטה יחסית. יתר על כן, הקרבה של שריר temporalis לקליפת המוח עושה את זה בחירה טבעית עבור השתלה, כפי שהוא לא צריך להיות נכרת לחלוטין או מנותק מאספקת הדם שלה, כפי שיהיה צורך אם שריר מרוחק יותר שימשו להשתלה.

EMS נחקר במודלים של היפופרפוזיה מוחית כרונית בחולדות ^7,11. עם זאת, EMS באמצעות שתל שריר טמפורליס מעולם לא נחקר בשבץ איסכמי חריף במכרסמים. כאן אנו מתארים פרוטוקול חדש של EMS בעכברים לאחר שבץ איסכמי באמצעות מודל חסימת עורק המוח האמצעי (MCAo). כתב יד זה משמש כתיאור של שיטות ונתונים מוקדמים עבור גישה חדשנית זו של EMS בעכברים לאחר MCAo.

Protocol

כל הניסויים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של UConn Health ונערכו בהתאם להנחיות ארה"ב. הפרוטוקול הבא צריך לעבוד בכל מין או זן של מכרסם. כאן נעשה שימוש בעכברים זכרים מסוג C57BL/6 בני 8 עד 12 שבועות, התואמים לגיל ולמשקל. עכברים הוזנו בדיאטת צ'או סטנדרטית ובמים עד ליביטום. תנאי הדיור הסטנדרטיים נשמרו על 72.3 מעלות פרנהייט ולחות יחסית של 30%-70% עם מחזור אור/חושך של 12 שעות.

1. הכנה לפני הניתוח

1. יש לעקר את כל המכשירים על ידי אוטוקלבינג לפני הניתוח. יש לחטא את משטח ההפעלה עם 70% אתנול ולחמם את משטח ההפעלה ל-37°C באמצעות כרית חימום חשמלית.
2. השתמש בתא אינדוקציה כדי להרדים את העכבר עם 4%-5% isoflurane עבור אינדוקציה. יש לספק 1.5%-2.0% איזופלוראן דרך חרוט האף לתחזוקה עד סוף הניתוח. ודא לפני הניתוח כי העכבר מורדם כראוי על ידי הערכת חוסר תגובה לצביטה מוצקה בכף הרגל האחורית ואובדן תגובת היציבה ורפלקס הימין.
3. הניחו את העכבר על צדו השמאלי על משטח הניתוח ומרחו משחת עיניים כדי להגן על שתי העיניים.
4. יש לגלח את השיער מעל שדה הניתוח (כלומר, גולגולת צידית ימנית בין העין לאוזן) באמצעות קוצץ חשמלי. נקו את שדה הניתוח במעגלים קונצנטריים כלפי חוץ מאמצע האתר הכירורגי, עם 70% אתנול ואחריו תמיסת פובידון, וחזרו על שלבים אלה פי 2.
   הערה: בשל היותו של אתר הניתוח קרוב לעין, ייתכן שלא ניתן יהיה להסיר 150% מהאזור המקיף אתר ניתוחי כדי למנוע גירוי או פגיעה מקרית בעין.
5. מתן מנה אחת של 0.25% bupivacaine (עד 8 מ"ג / ק"ג משקל גוף) על ידי הזרקה תת עורית כמו משכך כאבים טרום ניתוחי באתר הניתוח.
6. הגדר מיקרוסקופ כירורגי בהגדלה של 4x. המיקרוסקופ משמש לכל השלבים הכירורגיים.

2. הליך כירורגי

הערה: שלבי הניתוח מוצגים באיור 1. עבור פרוטוקול זה, שלושה עכברים הוקצו לקבוצת sham, שלושה עכברים לקבוצת EMS בלבד, 12 עכברים לקבוצת MCAo ו-23 עכברים לקבוצת MCAo + EMS.

1. ניתוח MCAo
   הערה: MCAo הוא מודל מאופיין היטב של שבץ איסכמי במכרסמים, כפי שתואר על ידינו ואחרים^12,13,14. שלבי הניתוח מתוארים כאן בקצרה. איסכמיה מוחית חולפת מוקדית הושרה על ידי MCAo ימני של 60 דקות תחת הרדמה איזופלורן ואחריו reperfusion במשך 7 או 21 ימים.
   1. בצע חתך בצוואר הגחון בקו האמצע ואחריו MCAo ימני חד צדדי על ידי קידום מונופילמנט מצופה גומי סיליקון באורך 10-11 מ"מ 6.0 מצופה גומי מהביפורקציה של עורק הצוואר הפנימי דרך גדם עורק הצוואר החיצוני. בעכברי שאם, לבצע ניתוחים זהים למעט התקדמות התפר לתוך עורק הצוואר הפנימי.
   2. מדוד טמפרטורות רקטליות באמצעות מערכת בקרת טמפרטורה, שמירה על הטמפרטורה ב ~ 37 מעלות צלזיוס במהלך הניתוח עם כרית חימום אוטומטית.
   3. השתמש בזרימת דופלר בלייזר כדי למדוד את זרימת הדם במוח לפני החדרת התפר על ידי הצבת גשושית הדופלר כנגד הגולגולת הצידית (המתאימה לשטח MCA) ורישום הערך⁸. כדי לאשר את הפחתת החסימה ל-15% מזרימת הדם המוחית הבסיסית, יש להשתמש באותו הליך לאחר התקדמות התפר. כדי לאשר reperfusion, להשתמש באותו הליך לאחר הסרת התפר.
   4. יש להאכיל את כל בעלי החיים במחית רטובה עד להקרבתם ו/או שבוע לאחר הניתוח כדי להבטיח תזונה נאותה לנקודות קצה כרוניות, שכן לבעלי החיים יש גירעונות גידול לאחר שבץ.
2. ניתוח EMS
   1. לאחר 60 דקות של MCAo, הפוך עכברים באופן אקראי לקבוצות MCAo בלבד או MCAo + EMS. בצע EMS 4 שעות לאחר MCAo (קבוצת MCAo + EMS) או ניתוח בושה לניסויים נבחרים (קבוצת EMS בלבד). החלף לזוג חדש של כפפות כירורגיות סטריליות לפני הניתוח.
      הערה: העכברים התאוששו מההרדמה לאחר 60 דקות של MCAo והורדו מחדש לפני ניתוח ה- EMS.
   2. עבור קבוצות המקבלות EMS (MCAo + EMS או EMS בלבד קבוצות), לבצע חתך עור 10-15 מ"מ עם מספריים, המשתרע מ 1-2 מ"מ rostral לאוזן ימין ל 1-2 מ"מ caudal לעין ימין.
      הערה: נעשה שימוש במספריים סטריליים כדי למנוע נזק מקרי לשרירי הטמפורליס שמתחת.
   3. הסירו את דשי העור באמצעות מלחציים וזהו באופן חזותי את שריר הטמפורליס ואת הגולגולת.
   4. לנתח באופן בוטה את שריר הטמפורליס הרחק מהגולגולת באמצעות מספריים בטכניקת התפשטות. בצע מיוטומיה 2-3 מ"מ מכוונת הגחון לאורך הגבול caudal של השריר כדי להקל על השתקפות הגחון.
   5. בצע קרניוטומיה בקוטר ~ 5 מ"מ בגולגולת מתחת לשריר הטמפורליס המוחזר באמצעות מקדחה זעירה.
   6. הסר את הדורה מאטר עם פינצטה כדי לחשוף את פני השטח pial של המוח. נקוט משנה זהירות כדי למנוע פגיעה מקרית במוח.
   7. תפר את הגבול הגבי של שריר הטמפורליס לרקמה התת עורית של דש העור הגבי עם 6-0 חוטים מונוקריליים, מה שהופך אותו סמוק לקליפת המוח החשופה.
   8. סגרו את החתך בעור עם תפר מונופילמנט 6-0. החזירו את העכבר לכלוב שלו ועקבו אחריו עד להתאוששות מההרדמה. החזר את העכבר למתקן הדיור שלו.

3. שיקולים פוסט-ניתוחיים

1. עקוב אחר העכברים למחלה והאתר הכירורגי לזיהום מדי יום. יש לתת מלח תת-עורי רגיל (1% נפח לפי משקל גוף) מדי יום לתמיכה בהידרציה.
2. עקוב אחר התייבשות חמורה (ירידה במשקל הגוף >20%) עד 7 ימים לאחר הניתוח. יש לתת בולוס נוסף של 1% מלוחים תת-עוריים רגילים לפי משקל הגוף אם >20% ירידה במשקל.
3. המשך עם זריקות, ניטור פיזיולוגי, ובדיקות אחרות ללא שיקולים מיוחדים.
   הערה: בהליך זה, השימוש באופיואידים או בתרופות נוגדות דלקת שאינן סטרואידים (NSAIDs) לטיפול לאחר הניתוח נמנע בשל ההשפעות הידועות של חומרים אלה על תוצאות שבץ או גודל אוטם בהתייעצות עם הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים 15,16,17,18. עם זאת, השימוש במשכך כאבים לאחר הניתוח מעודד מאוד לניתוח EMS עם מודלים אחרים. אנא התייעצו עם הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) לשם כך.

תוצאות

בסך הכל 41 עכברים שימשו למחקר זה. לאחר שלושה מקרי מוות, אחד ב- MCAo ושניים ב- MCAo + EMS, בסך הכל 38 עכברים שימשו להשגת התוצאות המוצגות.

סטטיסטיקה
הנתונים מכל ניסוי מוצגים כממוצע ± סטיית תקן (S.D.). המשמעות נקבעה באמצעות מבחן t של תלמיד לא מזווג להשוואה בין שתי קבוצות או ANOVA חד-כי...

Discussion

פרוטוקול זה מתאר הליך EMS מוצלח במודל עכבר של שבץ מוחי המושרה על-ידי MCAo. הנתונים מראים כי רקמה מושתלת נשארת בת קיימא ויכולה ליצור קשרים עם קליפת המוח זמן רב לאחר ניתוח EMS. ממצאים אלה תומכים ברציונל של שימוש בשתל שריר מוחי כדי לפתח בהדרגה סביבה טרופית עשירה בכלי הדם במקום של שבץ. EMS הוא טיפול מב?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-0 monocryl suture	Ethilon	697G
70% ethanol to sanitize operating surface	Walgreen
Bupivacaine 0.25% solution	Midwest Vet
Clamps for tissue retraction	Roboz
Doccal suture with Nylon coating	Doccal corporation Sharon MA	602145PK10Re
Electric heating pad for operating surface
Isoflurane anesthesia	Piramal Critical Care Inc
Isoflurane delivery apparatus	--B6Surgivet (Isotech 4)
Micro drill	Harvard Apparatus
Microdissecting tweezers, curved x2	Piramal Critical Care Inc
mouse angiogenesis panel arrat	R& D biotech	ARY015
Needle driver	Ethilon
Ointment for eye protection	walgreen
Operating microscope	Olympus
Operating surface	Olympus
Povidone iodine solution	walgreen
Rectal thermometer	world precison instrument
Saline or 70% ethanol for irrigation	walgreen
Small electric razor to shave operative site	generic
Surgical scissors	Roboz