Un modèle pour le traitement de l’encéphalomyosynangiose après un accident vasculaire cérébral induit par l’occlusion de l’artère cérébrale moyenne chez la souris

Résumé

Le protocole vise à fournir des méthodes pour l’encéphalomyosynangiose - greffe d’un lambeau musculaire temporalis vasculaire sur la surface piale du tissu cérébral ischémique - pour le traitement de l’AVC ischémique aigu non-moyamoya. L’efficacité de l’approche dans l’augmentation de l’angiogenèse est évaluée à l’aide d’un modèle d’occlusion transitoire de l’artère cérébrale moyenne chez la souris.

Résumé

Il n’existe aucun traitement efficace pour la plupart des patients souffrant d’AVC ischémique, ce qui rend impératif le développement de nouvelles thérapies. La capacité du cerveau à s’auto-guérir après un AVC ischémique est limitée par un apport sanguin insuffisant dans la zone touchée. L’encéphalomyosynangiose (EMS) est une procédure neurochirurgicale qui réalise l’angiogenèse chez les patients atteints de la maladie de moyamoya. Il s’agit d’une craniotomie avec placement d’une greffe musculaire vasculaire temporale sur la surface du cerveau ischémique. EMS n’a jamais été étudié dans le cadre d’un AVC ischémique aigu chez la souris. L’hypothèse à l’origine de cette étude est que l’EMS améliore l’angiogenèse cérébrale à la surface corticale entourant la greffe musculaire. Le protocole présenté ici décrit la procédure et fournit des données initiales à l’appui de la faisabilité et de l’efficacité de l’approche EMS. Dans ce protocole, après 60 minutes d’occlusion transitoire de l’artère cérébrale moyenne (MCAo), les souris ont été randomisées pour un traitement MCAo ou MCAo + EMS. L’EMS a été effectué 3-4 h après l’occlusion. Les souris ont été sacrifiées 7 ou 21 jours après le traitement MCAo ou MCAo + EMS. La viabilité du greffon temporalis a été mesurée à l’aide du test nicotinamide adénine dinucléotide réduit tétrazolium réductase. Un réseau d’angiogenèse de souris a quantifié l’expression des protéines angiogéniques et neuromodulatrices. L’immunohistochimie a été utilisée pour visualiser la liaison du greffon avec le cortex cérébral et le changement de densité des vaisseaux. Les données préliminaires ici suggèrent que le muscle greffé est resté viable 21 jours après EMS. L’immunomarquage a montré une implantation réussie du greffon et une augmentation de la densité des vaisseaux près de la greffe musculaire, indiquant une augmentation de l’angiogenèse. Les données montrent que l’EMS augmente le facteur de croissance des fibroblastes (FGF) et diminue les niveaux d’ostéopontine après un AVC. De plus, les SMU après un AVC n’ont pas augmenté la mortalité, ce qui suggère que le protocole est sûr et fiable. Cette nouvelle procédure est efficace et bien tolérée et a le potentiel de fournir des informations sur de nouvelles interventions pour l’angiogenèse améliorée après un AVC ischémique aigu.

Introduction

L’AVC ischémique est une lésion neurovasculaire aiguë avec des séquelles chroniques dévastatrices. La plupart des survivants d’un AVC, 650 000 par an, aux États-Unis souffrent d’une incapacité fonctionnelle permanente¹. Aucun des traitements disponibles ne confère de neuroprotection et de récupération fonctionnelle après la phase aiguë de l’AVC ischémique. Après un AVC ischémique aigu, les apports sanguins directs et collatéraux sont diminués, ce qui entraîne un dysfonctionnement des cellules et des réseaux cérébraux, entraînant des déficits neurologiques soudains ^2,3. La restauration de l’apport sanguin à la région ischémique demeure l’objectif principal du traitement de l’AVC. Ainsi, l’amélioration de l’angiogenèse pour favoriser l’apport sanguin dans le territoire ischémique est une approche thérapeutique prometteuse; Cependant, les méthodes précédemment étudiées pour favoriser l’angiogenèse post-AVC, y compris l’érythropoïétine, les statines et les facteurs de croissance, ont été limitées par des niveaux inacceptables de toxicité ou de translatabilité⁴.

L’encéphalomyosynangiose (EMS) est une intervention chirurgicale qui améliore l’angiogenèse cérébrale chez les humains atteints de la maladie de moyamoya, une affection des artères crâniennes rétrécies qui conduit souvent à un accident vasculaire cérébral. EMS implique le détachement partiel d’une section vasculaire du muscle temporalis du patient du crâne, suivi d’une craniotomie et d’une greffe du muscle sur le cortex affecté. Cette procédure est bien tolérée et induit une angiogenèse cérébrale, réduisant le risque d’accident vasculaire cérébral ischémique chez les patients atteints de la maladie de moyamoya ^5,6. Ainsi, la procédure joue un rôle largement préventif chez ces patients. L’angiogenèse provoquée par cette procédure peut également jouer un rôle dans la promotion de la protection neurovasculaire et de la récupération dans le cadre d’un AVC ischémique. Ce rapport soutient l’hypothèse selon laquelle l’angiogenèse provoquée par EMS a le potentiel d’élargir la compréhension et les options thérapeutiques pour l’ischémie cérébrale.

Outre l’EMS, il existe plusieurs approches pharmacologiques et chirurgicales pour améliorer l’angiogenèse, mais elles ont plusieurs limites. Les approches pharmacologiques telles que l’administration de facteur de croissance de l’endothélium vasculaire (VEGF) se sont révélées insuffisantes ou même préjudiciables en raison de plusieurs limitations, notamment la formation de plexus vasculaires chaotiques, désorganisés, perméables et primitifs, qui ressemblent à ceux trouvés dans les tissus tumoraux ^7,8 et n’ont aucun effet bénéfique dans les essais cliniques⁹.

Les approches chirurgicales comprennent l’anastomose directe telle que l’anastomose superficielle de l’artère temporale et de l’artère cérébrale moyenne, l’anastomose indirecte telle que l’encéphalo-duro artério-synangiose (EDAS), l’encéphalomyosynangiose (EMS) et les combinaisons d’anastomose directe et indirecte¹⁰. Toutes ces procédures sont très difficiles et exigeantes sur le plan technique chez les petits animaux, à l’exception des SME. Alors que les autres procédures nécessitent une anastomose vasculaire complexe, EMS nécessite une greffe musculaire relativement simple. De plus, la proximité du muscle temporel avec le cortex en fait un choix naturel pour la greffe, car il n’a pas besoin d’être complètement excisé ou déconnecté de son approvisionnement en sang, comme cela serait nécessaire si un muscle plus éloigné était utilisé pour la greffe.

EMS a été étudié dans des modèles d’hypoperfusion cérébrale chronique chez le rat ^7,11. Cependant, l’EMS utilisant une greffe musculaire temporale n’a jamais été étudié dans l’AVC ischémique aigu chez les rongeurs. Ici, nous décrivons un nouveau protocole d’EMS chez la souris après un AVC ischémique via un modèle d’occlusion de l’artère cérébrale moyenne (MCAo). Ce manuscrit sert de description des méthodes et des premières données pour cette nouvelle approche de l’EMS chez la souris après MCAo.

Protocole

Toutes les expériences ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de UConn Health et menées conformément aux directives américaines. Le protocole suivant devrait fonctionner dans n’importe quelle espèce ou souche de rongeur. Ici, des souris mâles de type sauvage C57BL/6 âgées de 8 à 12 semaines, appariées selon l’âge et le poids, ont été utilisées. Les souris ont été nourries avec un régime alimentaire standard et de l’eau ad libitum. Les conditions de logement standard ont été maintenues à 72,3 ° F et 30% à 70% d’humidité relative avec un cycle lumière/obscurité de 12 heures.

1. Préparation préopératoire

1. Stérilisez tous les instruments par autoclavage avant la chirurgie. Désinfectez la surface de fonctionnement avec de l’éthanol à 70 % et réchauffez la surface de travail à 37 °C avec un coussin chauffant électrique.
2. Utilisez une chambre d’induction pour anesthésier la souris avec 4% -5% d’isoflurane pour l’induction. Administrer de l’isoflurane de 1,5 % à 2,0 % par cône nasal pour l’entretien jusqu’à la fin de la chirurgie. Avant la chirurgie, assurez-vous que la souris est correctement anesthésiée en évaluant l’absence de réponse à un pincement ferme du pied postérieur et à la perte de la réaction posturale et du réflexe de redressement.
3. Placez la souris sur son côté gauche sur la surface d’opération et appliquez une pommade pour les yeux pour protéger les deux yeux.
4. Rasez les poils sur le champ chirurgical (c.-à-d. le crâne latéral droit entre l’œil et l’oreille) avec des tondeuses électriques. Nettoyez le champ chirurgical en cercles concentriques vers l’extérieur à partir du milieu du site chirurgical, avec de l’éthanol à 70% suivi d’une solution de povidone, et répétez ces étapes 2x.
   REMARQUE: En raison de la proximité du site de chirurgie de l’œil, l’ablation de 150% de la zone entourant un site chirurgical peut ne pas être possible pour éviter une irritation ou une blessure accidentelle à l’œil.
5. Administrer une dose unique de bupivacaïne à 0,25 % (jusqu’à 8 mg/kg de poids corporel) par injection sous-cutanée comme analgésie préopératoire au site de la chirurgie.
6. Installez un microscope chirurgical à un grossissement de 4x. Le microscope est utilisé pour toutes les étapes chirurgicales.

2. Procédure chirurgicale

REMARQUE : Les étapes de la chirurgie sont présentées à la figure 1. Pour ce protocole, trois souris ont été assignées au groupe placebo, trois souris pour EMS seul, 12 souris pour MCAo et 23 souris pour le groupe MCAo + EMS.

1. Chirurgie MCAo
   NOTE: MCAo est un modèle bien caractérisé d’AVC ischémique chez les rongeurs, tel que décrit par nous et d’autres^12,13,14. Les étapes de la chirurgie sont brièvement décrites ici. L’ischémie cérébrale transitoire focale a été induite par un MCAo droit de 60 min sous anesthésie à l’isoflurane suivi d’une reperfusion pendant 7 ou 21 jours.
   1. Faire une incision médiane du cou ventrale suivie d’un MCAo droit unilatéral en avançant un monofilament recouvert de caoutchouc de silicone de 10 à 11 mm de long de 6,0 à partir de la bifurcation de l’artère carotide interne via un moignon de l’artère carotide externe. Chez les souris simulées, effectuer des chirurgies identiques, à l’exception de l’avancement de la suture dans l’artère carotide interne.
   2. Mesurez la température rectale à l’aide d’un système de contrôle de la température, en maintenant la température à ~37 °C pendant la chirurgie avec un coussin chauffant automatique.
   3. Utilisez la débitmétrie Doppler laser pour mesurer le débit sanguin cérébral avant l’insertion de la suture en plaçant la sonde Doppler contre le crâne latéral (correspondant au territoire MCA) et en enregistrant la valeur⁸. Pour confirmer la réduction de l’occlusion à 15% du débit sanguin cérébral de base, utilisez la même procédure après l’avancement de la suture. Pour confirmer la reperfusion, utilisez la même procédure après le retrait de la suture.
   4. Nourrir tous les animaux avec de la purée humide jusqu’au sacrifice et / ou 1 semaine après la chirurgie pour assurer une nutrition adéquate pour les paramètres chroniques, car les animaux ont des déficits d’élevage après un AVC.
2. Chirurgie EMS
   1. Après 60 min de MCAo, randomiser les souris en groupes MCAo seul ou MCAo + EMS. Effectuer EMS 4 h après MCAo (groupe MCAo + EMS) ou une chirurgie simulée pour certaines expériences (groupe EMS uniquement). Adoptez une nouvelle paire de gants chirurgicaux stériles avant la chirurgie.
      REMARQUE: Les souris se sont rétablies de l’anesthésie après 60 minutes de MCAo et ont été réanesthésiées avant la chirurgie EMS.
   2. Pour les groupes qui reçoivent EMS (MCAo + EMS ou EMS uniquement), faites une incision cutanée de 10-15 mm avec des ciseaux, s’étendant de 1-2 mm rostral à l’oreille droite à 1-2 mm caudale à l’œil droit.
      REMARQUE: Des ciseaux stériles ont été utilisés pour prévenir les dommages accidentels aux muscles temporalis en dessous.
   3. Rétractez les lambeaux cutanés à l’aide de pinces et identifiez visuellement le muscle temporalis et le crâne.
   4. Disséquez carrément le muscle temporel loin du crâne à l’aide de ciseaux avec une technique d’étalement. Effectuer une myotomie de 2-3 mm dirigée ventralement le long du bord caudale du muscle pour faciliter la réflexion ventrale.
   5. Effectuer une craniotomie ~ 5 mm de diamètre au niveau du crâne sous le muscle temporalis réfléchi à l’aide d’une micro-perceuse.
   6. Retirez la dure-mère avec une pince à épiler pour exposer la surface piale du cerveau. Faites preuve d’une extrême prudence pour éviter les blessures accidentelles au cerveau.
   7. Suturer le bord dorsal du muscle temporal au tissu sous-cutané du lambeau de peau dorsale avec des filaments monocryliques 6-0, le faisant affleurer le cortex cérébral exposé.
   8. Fermez l’incision cutanée avec une suture monofilament 6-0. Replacez la souris dans sa cage et surveillez jusqu’à ce qu’elle se rétablisse de l’anesthésie. Remettez la souris dans son logement.

3. Considérations postopératoires

1. Surveillez quotidiennement les souris pour détecter la maladie et le site chirurgical pour détecter l’infection. Administrer quotidiennement une solution saline sous-cutanée normale (1 % du volume en poids corporel) pour favoriser l’hydratation.
2. Surveillez la déshydratation sévère (perte de poids corporel >20%) jusqu’à 7 jours après la chirurgie. Administrer un bolus supplémentaire de solution saline sous-cutanée normale à 1% du volume par poids corporel si >20% de perte de poids.
3. Procéder aux injections, à la surveillance physiologique et à d’autres tests sans considérations particulières.
   REMARQUE : Dans cette procédure, l’utilisation d’opioïdes ou d’anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS) pour traiter la chirurgie a été évitée en raison des effets connus de ces agents sur l’issue de l’AVC ou la taille de l’infarctus en consultation avec le comité interne de soins et d’utilisation des animaux de l’établissement^15,16,17,18. Cependant, l’utilisation de l’analgésie postopératoire est fortement encouragée pour la chirurgie EMS avec d’autres modèles. Veuillez consulter le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) pour cela.

Résultats

Au total, 41 souris ont été utilisées pour cette étude. Après trois mortalités, une dans MCAo et deux dans MCAo + EMS, un total de 38 souris ont été utilisées pour obtenir les résultats montrés.

Statistiques
Les données de chaque expérience sont présentées sous forme d’écart type moyen ± (S.D.). La signification a été déterminée à l’aide du test t de l’étudiant non apparié pour comparer deux groupes ou de l’ANOVA unidirectionnelle pour plus d...

Discussion

Ce protocole décrit une procédure EMS réussie dans un modèle murin d’AVC induit par MCAo. Les données montrent que le tissu greffé reste viable et peut former des liaisons avec le cortex cérébral longtemps après la chirurgie EMS. Ces résultats soutiennent la justification de l’utilisation d’une greffe musculaire cérébrale pour développer progressivement un environnement trophique richement vasculaire au site de l’AVC. EMS est une thérapie prometteuse pour potentiellement réparer le tissu cérébral...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-0 monocryl suture	Ethilon	697G
70% ethanol to sanitize operating surface	Walgreens
Bupivacaine 0.25% solution	Midwest Vet
Clamps for tissue retraction	Roboz
Doccal suture with silicone coating	Doccal Corporation	602145PK10Re
Electric heating pad for operating surface
Isoflurane anesthesia	Piramal Critical Care Inc
Isoflurane delivery apparatus	B6Surgivet (Isotech 4)
Micro drill	Harvard Apparatus
Microdissecting tweezers, curved x2	Piramal Critical Care Inc
mouse angiogenesis panel arrat	R& D biotech	ARY015
Needle driver	Ethilon
Ointment for eye protection	Walgreens
Operating microscope	Olympus
Operating surface	Olympus
Povidone iodine solution	Walgreens
Rectal thermometer	world precison instrument
Saline or 70% ethanol for irrigation	Walgreens
Small electric razor to shave operative site	Generic
Surgical scissors	Roboz