小鼠脑中动脉闭塞诱导脑卒中后脑肌粘连血管病治疗模型

摘要

该方案旨在提供脑肌粘连血管病的方法 - 在缺血性脑组织的皮瓣上移植血管颞肌瓣 - 用于治疗非烟雾病急性缺血性中风。该方法在增加血管生成方面的功效是在小鼠中使用瞬时大脑中动脉闭塞模型进行评估的。

摘要

对于大多数缺血性中风患者来说，没有有效的治疗方法，因此开发新的治疗方法势在必行。缺血性卒中后大脑的自我修复能力受到受影响区域血液供应不足的限制。脑肌粘连血管病（EMS）是一种神经外科手术，可在烟雾病患者中实现血管生成。它涉及开颅术，在缺血性脑表面放置血管颞肌移植物。EMS从未在小鼠急性缺血性卒中的情况下进行过研究。推动这项研究的假设是EMS增强了肌肉移植周围皮质表面的脑血管生成。此处显示的方案描述了该过程，并提供了支持EMS方法的可行性和有效性的初始数据。在该协议中，在短暂的大脑中动脉闭塞（MCAo）60分钟后，将小鼠随机分配到MCAo或MCAo + EMS治疗。EMS在闭塞后3-4小时进行。在MCAo或MCAo + EMS治疗后7或21天处死小鼠。使用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原四唑还原酶测定法测量颞移植物活力。小鼠血管生成阵列定量了血管生成和神经调节蛋白的表达。免疫组织化学用于可视化移植物与脑皮层的结合和血管密度的变化。这里的初步数据表明，移植的肌肉在EMS后21天仍然存活。免疫染色显示移植物植入成功，肌肉移植物附近的血管密度增加，表明血管生成增加。数据显示，EMS增加成纤维细胞生长因子（FGF）并降低中风后的骨桥蛋白水平。此外，卒中后的EMS并没有增加死亡率，这表明该方案是安全可靠的。这种新手术有效且耐受性良好，并有可能为急性缺血性卒中后增强血管生成的新干预措施提供信息。

引言

缺血性卒中是一种急性神经血管损伤，伴有毁灭性的慢性后遗症。在美国，大多数中风幸存者（每年 650，000 人）患有永久性功能残疾¹。没有一种可用的治疗方法在缺血性卒中的急性期后提供神经保护和功能恢复。急性缺血性中风后，直接和侧支血液供应减少，导致脑细胞和网络功能障碍，导致突发神经功能缺损^2，3。恢复缺血区域的血液供应仍然是中风治疗的首要目标。因此，增强血管生成以促进缺血区域的血液供应是一种有前途的治疗方法;然而，先前研究的促进卒中后血管生成的方法，包括促红细胞生成素、他汀类药物和生长因子，受到不可接受的毒性^或可转化性水平的限制4。

脑肌粘连血管病（EMS）是一种外科手术，可增强烟雾病患者的脑血管生成，烟雾病是一种经常导致中风的颅动脉狭窄的疾病。EMS 涉及患者颞肌的血管部分与颅骨部分分离，然后进行开颅手术并将肌肉移植到受影响的皮质上。该手术耐受性良好，可诱导脑血管生成，降低烟雾病患者缺血性卒中的风险^5，6。因此，该程序在这些患者中主要起到预防作用。在缺血性卒中的情况下，该手术带来的血管生成也可能在促进神经血管保护和恢复方面发挥作用。该报告支持这样的假....

研究方案

所有实验均由康涅狄格大学健康机构动物护理和使用委员会批准，并按照美国指南进行。以下协议应适用于任何种类或品系的啮齿动物。在这里，使用8至12周龄，年龄和体重匹配的C57BL / 6野生型雄性小鼠。小鼠随意喂食标准食物饮食 和水。标准住房条件保持在72.3°F和30%-70%相对湿度，光照/黑暗循环12小时。

1. 术前准备

1. 手术前通过高压灭菌对所有器械进行灭菌。用70%乙醇消毒操作表面，并用电加热垫将操作表面加热至37°C。
2. 使用诱导室用4%-5%异氟醚麻醉小鼠进行诱导。通过鼻锥 输送 1.5%-2.0%异氟醚进行维护，直到手术结束。在手术前，通过评估对坚定的后脚捏合缺乏反应以及姿势反应和矫正反射的丧失，确保小鼠得到适当的麻醉。
3. 将鼠标放在手术表面上的左侧，涂抹眼膏以保护双眼。
4. 用电剪在手术区域（即眼睛和耳朵之间的右外侧颅骨）剃毛。从手术部位中间向外以同心圆清洁手术区域，然后用70%乙醇和聚维酮溶液，并重复这些步骤2次。
   注意：由于手术部位靠近眼睛，因此可能无法切除手术部位周围 150% 的区域以避免对眼睛的刺激或意外伤害。
5. 通过皮下注射给予单剂量的0.25%布比卡因（高达8mg / kg体重），作为手术部位的术前镇痛。
6. 以4倍放大倍率设置手术显微镜。显微镜用于所有手术步骤。

结果

本研究共使用了41只小鼠。在三次死亡后，一次在MCAo中，两次在MCAo + EMS中，总共使用38只小鼠来获得所示结果。

统计学
每个实验的数据以平均±标准差（S.D.）表示。使用未配对学生的t检验来比较两组，或者使用单因素方差分析来确定两组以上的显著性，并使用Newman-Keuls事后检验来校正多重比较。

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（还原）-四?.......

讨论

该协议描述了MCAo诱导的中风小鼠模型中成功的EMS程序。数据显示，移植的组织仍然有活力，并且可以在EMS手术后很长时间内与大脑皮层形成联系。这些发现支持使用脑肌肉移植物在中风部位逐渐形成丰富的血管营养环境的基本原理。EMS是一种有前途的疗法，可以在相同的环境中潜在地修复梗死的脑组织。

协议的关键步骤包括步骤2.2.4：此步骤对TM造成不可避免的创伤，这可能.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-0 monocryl suture	Ethilon	697G
70% ethanol to sanitize operating surface	Walgreen
Bupivacaine 0.25% solution	Midwest Vet
Clamps for tissue retraction	Roboz
Doccal suture with Nylon coating	Doccal corporation Sharon MA	602145PK10Re
Electric heating pad for operating surface
Isoflurane anesthesia	Piramal Critical Care Inc
Isoflurane delivery apparatus	--B6Surgivet (Isotech 4)
Micro drill	Harvard Apparatus
Microdissecting tweezers, curved x2	Piramal Critical Care Inc
mouse angiogenesis panel arrat	R& D biotech	ARY015
Needle driver	Ethilon
Ointment for eye protection	walgreen
Operating microscope	Olympus
Operating surface	Olympus
Povidone iodine solution	walgreen
Rectal thermometer	world precison instrument
Saline or 70% ethanol for irrigation	walgreen
Small electric razor to shave operative site	generic
Surgical scissors	Roboz