Un modello per il trattamento dell'encefalomiosinangiosi dopo ictus indotto da occlusione dell'arteria cerebrale media nei topi

Riepilogo

Il protocollo mira a fornire metodi per l'encefalomiosinangiosi - innesto di un lembo muscolare temporale vascolare sulla superficie piale del tessuto cerebrale ischemico - per il trattamento dell'ictus ischemico acuto non moyamoya. L'efficacia dell'approccio nell'aumentare l'angiogenesi viene valutata utilizzando un modello transitorio di occlusione dell'arteria cerebrale media nei topi.

Abstract

Non esiste un trattamento efficace disponibile per la maggior parte dei pazienti affetti da ictus ischemico, rendendo imperativo lo sviluppo di nuove terapie. La capacità del cervello di auto-guarire dopo l'ictus ischemico è limitata da un inadeguato apporto di sangue nell'area colpita. L'encefalomiosinangiosi (EMS) è una procedura neurochirurgica che raggiunge l'angiogenesi nei pazienti con malattia di moyamoya. Si tratta di craniotomia con posizionamento di un innesto muscolare temporale vascolare sulla superficie ischemica del cervello. L'EMS non è mai stato studiato nel contesto dell'ictus ischemico acuto nei topi. L'ipotesi alla base di questo studio è che l'EMS migliora l'angiogenesi cerebrale sulla superficie corticale che circonda l'innesto muscolare. Il protocollo qui illustrato descrive la procedura e fornisce i dati iniziali a supporto della fattibilità e dell'efficacia dell'approccio EMS. In questo protocollo, dopo 60 minuti di occlusione transitoria dell'arteria cerebrale media (MCAo), i topi sono stati randomizzati al trattamento MCAo o MCAo + EMS. L'EMS è stato eseguito 3-4 ore dopo l'occlusione. I topi sono stati sacrificati 7 o 21 giorni dopo il trattamento MCAo o MCAo + EMS. La vitalità dell'innesto temporale è stata misurata utilizzando il saggio della nicotinammide adenina dinucleotide ridotto-tetrazolium reduttasi. Un array di angiogenesi murina ha quantificato l'espressione proteica angiogenica e neuromodulante. L'immunoistochimica è stata utilizzata per visualizzare il legame del trapianto con la corteccia cerebrale e il cambiamento nella densità dei vasi. I dati preliminari qui suggeriscono che il muscolo innestato è rimasto vitale 21 giorni dopo l'EMS. L'immunocolorazione ha mostrato un impianto di innesto riuscito e un aumento della densità dei vasi vicino all'innesto muscolare, indicando un aumento dell'angiogenesi. I dati mostrano che l'EMS aumenta il fattore di crescita dei fibroblasti (FGF) e diminuisce i livelli di osteopontina dopo l'ictus. Inoltre, l'EMS dopo l'ictus non ha aumentato la mortalità, suggerendo che il protocollo è sicuro e affidabile. Questa nuova procedura è efficace e ben tollerata e ha il potenziale per fornire informazioni su nuovi interventi per migliorare l'angiogenesi dopo ictus ischemico acuto.

Introduzione

L'ictus ischemico è una lesione neurovascolare acuta con sequele croniche devastanti. La maggior parte dei sopravvissuti all'ictus, 650.000 all'anno, negli Stati Uniti soffre di disabilità funzionale permanente¹. Nessuno dei trattamenti disponibili conferisce neuroprotezione e recupero funzionale dopo la fase acuta dell'ictus ischemico. Dopo un ictus ischemico acuto, sia l'apporto di sangue diretto che quello collaterale sono diminuiti, il che porta alla disfunzione delle cellule e delle reti cerebrali, con conseguenti improvvisi deficit neurologici ^2,3. Il ripristino dell'afflusso di sangue alla regione ischemica rimane l'obiettivo principale della terapia dell'ictus. Pertanto, migliorare l'angiogenesi per promuovere l'afflusso di sangue nel territorio ischemico è un approccio terapeutico promettente; Tuttavia, i metodi precedentemente studiati per promuovere l'angiogenesi post-ictus, tra cui eritropoietina, statine e fattori di crescita, sono stati limitati da livelli inaccettabili di tossicità o traducibilità⁴.

L'encefalomiosinangiosi (EMS) è una procedura chirurgica che migliora l'angiogenesi cerebrale negli esseri umani con malattia di moyamoya, una condizione delle arterie craniche ristrette che spesso porta all'ictus. L'EMS comporta il distacco parziale di una sezione vascolare del muscolo temporale del paziente dal cranio, seguito da craniotomia e innesto del muscolo sulla corteccia interessata. Questa procedura è ben tollerata e induce l'angiogenesi cerebrale, riducendo il rischio di ictus ischemico nei pazienti con malattia di moyamoya ^5,6. Pertanto, la procedura svolge in gran parte un ruolo preventivo in questi pazienti. L'angiogenesi causata da questa procedura può anche avere un ruolo nel promuovere la protezione neurovascolare e il recupero nel contesto dell'ictus ischemico. Questo rapporto supporta l'ipotesi che l'angiogenesi causata dall'EMS abbia il potenziale per espandere la comprensione e le opzioni terapeutiche per l'ischemia cerebrale.

Oltre all'EMS, ci sono diversi approcci farmacologici e chirurgici per migliorare l'angiogenesi, ma hanno diversi limiti. Approcci farmacologici come la somministrazione del fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF) sono risultati insufficienti o addirittura dannosi a causa di diverse limitazioni, tra cui la formazione di plessi vascolari caotici, disorganizzati, permeabili e primitivi, che assomigliano a quelli trovati nei tessuti tumorali ^7,8 e non hanno effetti benefici negli studi clinici⁹.

Gli approcci chirurgici comprendono l'anastomosi diretta come l'anastomosi superficiale dell'arteria temporale-media cerebrale, l'anastomosi indiretta come l'encefalo-duro arterio-sinangiosi (EDAS), l'encefalomiosinangiosi (EMS) e combinazioni di anastomosi diretta e indiretta¹⁰. Tutte queste procedure sono molto impegnative dal punto di vista tecnico e impegnative nei piccoli animali, ad eccezione dell'EMS. Mentre le altre procedure richiedono anastomosi vascolare complessa, EMS richiede un innesto muscolare relativamente semplice. Inoltre, la vicinanza del muscolo temporale alla corteccia lo rende una scelta naturale per l'innesto, in quanto non ha bisogno di essere completamente asportato o scollegato dal suo apporto di sangue, come sarebbe necessario se un muscolo più distante fosse utilizzato per l'innesto.

L'EMS è stato studiato in modelli di ipoperfusione cerebrale cronica nei ratti ^7,11. Tuttavia, l'EMS che utilizza un innesto muscolare temporale non è mai stato studiato nell'ictus ischemico acuto nei roditori. Qui, descriviamo un nuovo protocollo di EMS nei topi dopo un ictus ischemico tramite il modello di occlusione dell'arteria cerebrale media (MCAo). Questo manoscritto serve come descrizione dei metodi e dei primi dati per questo nuovo approccio di EMS nei topi dopo MCAo.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee di UConn Health e condotti in conformità con le linee guida statunitensi. Il seguente protocollo dovrebbe funzionare in qualsiasi specie o ceppo di roditore. Qui, sono stati utilizzati topi maschi selvatici C57BL / 6 di età e peso corrispondenti. I topi sono stati nutriti con dieta standard di chow e acqua ad libitum. Le condizioni abitative standard sono state mantenute a 72,3 ° F e 30% -70% di umidità relativa con un ciclo luce / buio di 12 ore.

1. Preparazione pre-operatoria

1. Sterilizzare tutti gli strumenti mediante autoclave prima dell'intervento chirurgico. Sanificare la superficie operativa con etanolo al 70% e riscaldare la superficie operativa a 37 °C con una piastra riscaldante elettrica.
2. Utilizzare una camera di induzione per anestetizzare il topo con isoflurano al 4% -5% per l'induzione. Fornire isoflurano all'1,5%-2,0% attraverso il cono del naso per il mantenimento fino alla fine dell'intervento chirurgico. Assicurarsi prima dell'intervento chirurgico che il topo sia adeguatamente anestetizzato valutando la mancanza di una risposta a un fermo pizzicamento del piede posteriore e la perdita della reazione posturale e del riflesso raddrizzante.
3. Posizionare il mouse sul lato sinistro sulla superficie operatoria e applicare un unguento per gli occhi per proteggere entrambi gli occhi.
4. Rasare i peli sul campo chirurgico (cioè il cranio laterale destro tra occhio e orecchio) con tagliacapelli elettrici. Pulire il campo chirurgico in cerchi concentrici verso l'esterno dal centro del sito chirurgico, con etanolo al 70% seguito da una soluzione di povidone, e ripetere questi passaggi 2x.
   NOTA: A causa del fatto che il sito chirurgico è vicino all'occhio, la rimozione del 150% dell'area circostante un sito chirurgico potrebbe non essere possibile per evitare irritazioni o lesioni accidentali all'occhio.
5. Somministrare una singola dose di bupivacaina allo 0,25% (fino a 8 mg/kg di peso corporeo) mediante iniezione sottocutanea come analgesia preoperatoria nel sito dell'intervento.
6. Installare un microscopio chirurgico con ingrandimento 4x. Il microscopio viene utilizzato per tutte le fasi chirurgiche.

2. Procedura chirurgica

NOTA: le fasi dell'intervento chirurgico sono presentate nella Figura 1. Per questo protocollo, tre topi sono stati assegnati al gruppo sham, tre topi per EMS da solo, 12 topi per MCAo e 23 topi per MCAo + gruppo EMS.

1. Chirurgia MCAo
   NOTA: MCAo è un modello ben caratterizzato di ictus ischemico nei roditori, come descritto da noi e altri^12,13,14. Le fasi dell'intervento chirurgico sono descritte in breve qui. L'ischemia cerebrale transitoria focale è stata indotta da un MCAo destro di 60 minuti in anestesia isoflurana seguita da riperfusione per 7 o 21 giorni.
   1. Effettuare un'incisione del collo ventrale della linea mediana seguita da MCAo destro unilaterale facendo avanzare un monofilamento rivestito di gomma siliconica 6,0 lungo 10-11 mm dalla biforcazione interna dell'arteria carotide attraverso un moncone esterno dell'arteria carotide. Nei topi fittizi, eseguire interventi chirurgici identici ad eccezione dell'avanzamento della sutura nell'arteria carotide interna.
   2. Misurare le temperature rettali utilizzando un sistema di controllo della temperatura, mantenendo la temperatura a ~ 37 ° C durante l'intervento chirurgico con una piastra riscaldante automatica.
   3. Utilizzare la flussimetria laser Doppler per misurare il flusso sanguigno cerebrale prima dell'inserimento della sutura posizionando la sonda Doppler contro il cranio laterale (corrispondente al territorio MCA) e registrando il valore⁸. Per confermare la riduzione dell'occlusione al 15% del flusso sanguigno cerebrale basale, utilizzare la stessa procedura dopo l'avanzamento della sutura. Per confermare la riperfusione, utilizzare la stessa procedura dopo aver rimosso la sutura.
   4. Nutrire tutti gli animali con poltiglia umida fino al sacrificio e/o 1 settimana dopo l'intervento chirurgico per garantire un'alimentazione adeguata per gli endpoint cronici, poiché gli animali hanno deficit di allevamento dopo l'ictus.
2. Chirurgia EMS
   1. Dopo 60 minuti di MCAo, randomizzare i topi in gruppi solo MCAo o MCAo + EMS. Eseguire EMS 4 ore dopo MCAo (gruppo MCAo + EMS) o chirurgia fittizia per esperimenti selezionati (gruppo solo EMS). Passare a un nuovo paio di guanti chirurgici sterili prima dell'intervento.
      NOTA: I topi si sono ripresi dall'anestesia dopo 60 minuti di MCAo e sono stati nuovamente anestetizzati prima dell'intervento chirurgico EMS.
   2. Per i gruppi che ricevono EMS (MCAo + EMS o gruppi solo EMS), eseguire un'incisione cutanea di 10-15 mm con le forbici, che si estende da 1-2 mm rostrale all'orecchio destro a 1-2 mm caudale all'occhio destro.
      NOTA: Le forbici sterili sono state utilizzate per prevenire danni accidentali ai muscoli temporali sottostanti.
   3. Ritrarre i lembi cutanei usando morsetti e identificare visivamente il muscolo temporale e il cranio.
   4. Sezionare senza mezzi termini il muscolo temporale lontano dal cranio usando le forbici con una tecnica di diffusione. Eseguire una miotomia di 2-3 mm diretta ventralmente lungo il bordo caudale del muscolo per facilitare la riflessione ventrale.
   5. Eseguire una craniotomia ~ 5 mm di diametro al cranio sotto il muscolo temporale riflesso utilizzando un micro trapano.
   6. Rimuovere la dura madre con una pinzetta per esporre la superficie piale del cervello. Prestare estrema attenzione per evitare lesioni accidentali al cervello.
   7. Suturare il bordo dorsale del muscolo temporale al tessuto sottocutaneo del lembo cutaneo dorsale con 6-0 filamenti monocrilici, rendendolo a filo della corteccia cerebrale esposta.
   8. Chiudere l'incisione cutanea con sutura monofilamento 6-0. Rimettere il mouse nella sua gabbia e monitorare fino al recupero dall'anestesia. Riportare il mouse nella sua struttura abitativa.

3. Considerazioni post-operatorie

1. Monitorare quotidianamente i topi per la malattia e il sito chirurgico per l'infezione. Somministrare soluzione salina normale per via sottocutanea (1% del volume corporeo) ogni giorno per sostenere l'idratazione.
2. Monitorare la disidratazione grave (perdita di peso corporeo >20%) fino a 7 giorni dopo l'intervento. Somministrare un ulteriore bolo di soluzione salina normale sottocutanea 1% volume in base al peso corporeo se >20% di perdita di peso.
3. Procedere con iniezioni, monitoraggio fisiologico e altri test senza particolari considerazioni.
   NOTA: In questa procedura, l'uso di oppioidi o farmaci antinfiammatori non steroidei (FANS) per il trattamento post-operatorio è stato evitato a causa degli effetti noti di questi agenti sull'esito dell'ictus o sulle dimensioni dell'infarto in consultazione con il comitato istituzionale interno per la cura e l'uso degli animali^15,16,17,18. Tuttavia, l'uso dell'analgesia post-operatoria è altamente incoraggiato per la chirurgia EMS con altri modelli. Si prega di consultare il Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) per questo.

Risultati

Un totale di 41 topi sono stati utilizzati per questo studio. Dopo tre mortalità, una in MCAo e due in MCAo + EMS, un totale di 38 topi sono stati utilizzati per ottenere i risultati mostrati.

Statistica
I dati di ciascun esperimento sono presentati come media ± deviazione standard (S.D.). La significatività è stata determinata utilizzando il test t dello studente spaiato per confrontare due gruppi o ANOVA unidirezionale per più di due gruppi, con un test post-hoc di N...

Discussione

Questo protocollo descrive una procedura EMS di successo in un modello murino di ictus indotto da MCAo. I dati mostrano che il tessuto innestato rimane vitale e può formare legami con la corteccia cerebrale molto tempo dopo l'intervento chirurgico EMS. Questi risultati supportano il razionale per l'utilizzo di un innesto muscolare cerebrale per sviluppare gradualmente un ambiente trofico riccamente vascolare nel sito dell'ictus. L'EMS è una terapia promettente per riparare potenzialmente il tessuto cerebrale infartuato...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-0 monocryl suture	Ethilon	697G
70% ethanol to sanitize operating surface	Walgreen
Bupivacaine 0.25% solution	Midwest Vet
Clamps for tissue retraction	Roboz
Doccal suture with Nylon coating	Doccal corporation Sharon MA	602145PK10Re
Electric heating pad for operating surface
Isoflurane anesthesia	Piramal Critical Care Inc
Isoflurane delivery apparatus	--B6Surgivet (Isotech 4)
Micro drill	Harvard Apparatus
Microdissecting tweezers, curved x2	Piramal Critical Care Inc
mouse angiogenesis panel arrat	R& D biotech	ARY015
Needle driver	Ethilon
Ointment for eye protection	walgreen
Operating microscope	Olympus
Operating surface	Olympus
Povidone iodine solution	walgreen
Rectal thermometer	world precison instrument
Saline or 70% ethanol for irrigation	walgreen
Small electric razor to shave operative site	generic
Surgical scissors	Roboz