JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Протокол направлен на предоставление методов энцефаломиосинангиоза - пересадки сосудистого височного мышечного лоскута на пиальную поверхность ишемизированной мозговой ткани - для лечения немоямоя острого ишемического инсульта. Эффективность подхода в увеличении ангиогенеза оценивается с использованием модели транзиторной окклюзии средней мозговой артерии у мышей.

Аннотация

Для большинства пациентов, страдающих ишемическим инсультом, нет эффективного лечения, что делает разработку новых терапевтических средств обязательной. Способность мозга к самовосстановлению после ишемического инсульта ограничена недостаточным кровоснабжением в пораженной области. Энцефаломиосинангиоз (ЭМС) – это нейрохирургическая процедура, которая достигает ангиогенеза у пациентов с моямой болезнью. Он включает в себя трепанацию черепа с размещением сосудистого височного мышечного трансплантата на ишемической поверхности мозга. ЭМС никогда не изучалась в условиях острого ишемического инсульта у мышей. Гипотеза, лежащая в основе этого исследования, заключается в том, что EMS усиливает церебральный ангиогенез на кортикальной поверхности, окружающей мышечный трансплантат. Протокол, показанный здесь, описывает процедуру и предоставляет исходные данные, подтверждающие осуществимость и эффективность подхода EMS. В этом протоколе после 60 мин транзиторной окклюзии средней мозговой артерии (MCAo) мыши были рандомизированы для лечения MCAo или MCAo + EMS. ЭМС проводили через 3-4 ч после окклюзии. Мышей приносили в жертву через 7 или 21 день после лечения MCAo или MCAo + EMS. Жизнеспособность темпорального трансплантата измеряли с помощью анализа никотинамидадениндинуклеотида с восстановленной тетразолиумредуктазой. Массив ангиогенеза мыши количественно определял экспрессию ангиогенного и нейромодулирующего белка. Иммуногистохимия использовалась для визуализации связи трансплантата с корой головного мозга и изменения плотности сосудов. Предварительные данные здесь свидетельствуют о том, что привитая мышца оставалась жизнеспособной через 21 день после ЭМС. Иммуноокрашивание показало успешную имплантацию трансплантата и увеличение плотности сосудов вблизи мышечного трансплантата, что свидетельствует об усилении ангиогенеза. Данные показывают, что EMS увеличивает фактор роста фибробластов (FGF) и снижает уровень остеопонтина после инсульта. Кроме того, EMS после инсульта не увеличивала смертность, предполагая, что протокол безопасен и надежен. Эта новая процедура эффективна и хорошо переносится и может предоставить информацию о новых вмешательствах для усиления ангиогенеза после острого ишемического инсульта.

Введение

Ишемический инсульт представляет собой острую нейрососудистую травму с разрушительными хроническими последствиями. Большинство выживших после инсульта, 650 000 в год, в США страдают от постоянной функциональной инвалидности1. Ни один из доступных методов лечения не обеспечивает нейропротекцию и функциональное восстановление после острой фазы ишемического инсульта. После острого ишемического инсульта как прямые, так и коллатеральные запасы крови уменьшаются, что приводит к дисфункции клеток и сетей мозга, что приводит к внезапному неврологическому дефициту 2,3. Восстановление кровоснабжения ишемической области остается первостепенной целью терапии инсульта. Таким образом, усиление ангиогенеза для стимулирования кровоснабжения на ишемической территории является перспективным терапевтическим подходом; однако ранее изученные методы стимулирования постинсультного ангиогенеза, включая эритропоэтин, статины и факторы роста, были ограничены неприемлемыми уровнями токсичности или транслируемости4.

Энцефаломиосинангиоз (ЭМС) - это хирургическая процедура, которая усиливает церебральный ангиогенез у людей с болезнью моямоя, состоянием суженных черепных артерий, которое часто приводит к инсульту. EMS включает в себя частичное отслоение сосудистого отдела височной мышцы пациента от черепа с последующей трепанацией и пересадкой мышцы на пораженную кору. Эта процедура хорошо переносится и индуцирует церебральный ангиогенез, снижая риск ишемического инсульта у пациентов с моемой болезнью 5,6. Таким образом, процедура выполняет в значительной степени профилактическую роль у этих пациентов. Ангиогенез, вызванный этой процедурой, также может играть роль в содействии нейрососудистой защите и восстановлению в условиях ишемического инсульта. Этот отчет поддерживает гипотезу о том, что ангиогенез, вызванный EMS, может расширить понимание и терапевтические возможности ишемии головного мозга.

Помимо EMS, существует несколько фармакологических и хирургических подходов к улучшению ангиогенеза, но они имеют несколько ограничений. Фармакологические подходы, такие как введение фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), оказались недостаточными или даже вредными из-за ряда ограничений, включая образование хаотичных, дезорганизованных, протекающих и примитивных сосудистых сплетений, которые напоминают те, которые обнаружены в опухолевых тканях 7,8 и не оказывают благотворного влияния в клинических испытаниях9.

Хирургические подходы включают прямой анастомоз, такой как анастомоз поверхностной височной артерии-средней мозговой артерии, непрямой анастомоз, такой как энцефало-дуро-артерио-синангиоз (ЭДАС), энцефаломиосинангиоз (ЭМС) и комбинации прямого и непрямого анастомоза10. Все эти процедуры очень технически сложны и требовательны у мелких животных, за исключением EMS. В то время как другие процедуры требуют сложного сосудистого анастомоза, EMS требует относительно простого мышечного трансплантата. Более того, близость височной мышцы к коре делает ее естественным выбором для пересадки, так как ее не нужно полностью иссекать или отключать от кровоснабжения, как это было бы необходимо, если бы для пересадки использовалась более отдаленная мышца.

EMS был изучен в моделях хронической церебральной гипоперфузии у крыс 7,11. Тем не менее, EMS с использованием трансплантата височной мышцы никогда не изучался при остром ишемическом инсульте у грызунов. Здесь мы описываем новый протокол ЭМС у мышей после ишемического инсульта с помощью модели окклюзии средней мозговой артерии (MCAo). Эта рукопись служит описанием методов и ранних данных для этого нового подхода EMS у мышей после MCAo.

протокол

Все эксперименты были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию UConn Health и проводились в соответствии с руководящими принципами США. Следующий протокол должен работать у любого вида или штамма грызунов. Здесь использовались самцы мышей дикого типа C57BL/6 в возрасте от 8 до 12 недель, возраст и вес. Мышей кормили стандартной диетой чау и водой ad libitum. Стандартные жилищные условия поддерживались на уровне 72,3 ° F и относительной влажности 30-70% с циклом 12 часов света / темноты.

1. Предоперационная подготовка

  1. Стерилизуйте все инструменты путем автоклавирования перед операцией. Продезинфицируйте рабочую поверхность 70% этанолом и прогрейте рабочую поверхность до 37 °C с помощью электрической грелки.
  2. Используйте индукционную камеру для обезболивания мыши 4%-5% изофлураном для индукции. Доставляют 1,5%-2,0% изофлурана через носовой конус для поддержания до конца операции. Убедитесь перед операцией, что мышь должным образом обезболена, оценив отсутствие реакции на твердое защемление задней ноги и потерю постуральной реакции и корректирующего рефлекса.
  3. Поместите мышь на левую сторону на операционную поверхность и нанесите глазную мазь для защиты обоих глаз.
  4. Брейте волосы над хирургическим полем (т.е. правым боковым черепом между глазом и ухом) с помощью электрических машинок для стрижки. Очистите хирургическое поле концентрическими кругами наружу от середины хирургического участка, с 70% этанолом, за которым следует раствор повидона, и повторите эти шаги 2 раза.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за того, что место операции находится близко к глазу, удаление 150% области, окружающей хирургический участок, может быть невозможным, чтобы избежать раздражения или случайной травмы глаза.
  5. Вводят однократную дозу 0,25% бупивакаина (до 8 мг/кг массы тела) путем подкожной инъекции в качестве предоперационной анальгезии в месте операции.
  6. Настройте хирургический микроскоп с 4-кратным увеличением. Микроскоп используется для всех хирургических этапов.

2. Хирургическая процедура

ПРИМЕЧАНИЕ: Этапы операции представлены на рисунке 1. Для этого протокола три мыши были выделены в фиктивную группу, три мыши для одной только EMS, 12 мышей для MCAo и 23 мыши для группы MCAo + EMS.

  1. Хирургия MCAo
    ПРИМЕЧАНИЕ: MCAo является хорошо охарактеризованной моделью ишемического инсульта у грызунов, как описано нами и другими 12,13,14. Этапы операции кратко описаны здесь. Фокальная транзиторная церебральная ишемия индуцировалась 60-минутным правым MCAo под изофлурановой анестезией с последующей реперфузией в течение 7 или 21 дня.
    1. Сделайте вентральный разрез шеи средней линии с последующим односторонним правым MCAo, продвигая монофиламент из внутренней сонной артерии длиной 10-11 мм длиной 6,0 силиконового покрытия от бифуркации внутренней сонной артерии через культю наружной сонной артерии. У фиктивных мышей выполняют идентичные операции, за исключением продвижения шва во внутреннюю сонную артерию.
    2. Измеряйте ректальную температуру с помощью системы контроля температуры, поддерживая температуру на уровне ~ 37 ° C во время операции с помощью автоматической грелки.
    3. Используйте лазерную допплеровскую флоуметрию для измерения мозгового кровотока перед введением шва путем размещения допплеровского зонда против бокового черепа (соответствующего территории MCA) и регистрации значения8. Чтобы подтвердить снижение окклюзии до 15% от исходного мозгового кровотока, используйте ту же процедуру после того, как шов будет выдвинут. Чтобы подтвердить реперфузию, используйте ту же процедуру после снятия шва.
    4. Кормите всех животных влажным пюре до жертвоприношения и / или через 1 неделю после операции, чтобы обеспечить адекватное питание для хронических конечных точек, так как животные имеют дефицит выращивания после инсульта.
  2. Хирургия EMS
    1. После 60 минут MCAo рандомизируйте мышей в группы только MCAo или MCAo + EMS. Выполняйте EMS через 4 ч после MCAo (группа MCAo + EMS) или фиктивную операцию для отдельных экспериментов (группа только EMS). Перед операцией переодевайтесь в новую пару стерильных хирургических перчаток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши восстановились после анестезии после 60 минут ПРИЕМА MCAo и были повторно обезболены перед операцией EMS.
    2. Для групп, получающих EMS (MCAo + EMS или EMS-только группы), сделайте разрез кожи 10-15 мм ножницами, простирающийся от 1-2 мм рострального до правого уха до 1-2 мм каудального правого глаза.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Стерильные ножницы использовались для предотвращения случайного повреждения височных мышц под ними.
    3. Втягивайте кожные лоскуты с помощью зажимов и визуально идентифицируйте височную мышцу и череп.
    4. Тупо рассекните височную мышцу от черепа с помощью ножниц с помощью техники распространения. Выполняют миотомию 2-3 мм, направленную вентрально вдоль каудальной границы мышцы для облегчения вентрального отражения.
    5. Выполните трепанацию черепа диаметром ~ 5 мм под отраженной височной мышцей с помощью микродресла.
    6. Удалите твердую мозговую оболочку пинцетом, чтобы обнажить пиальную поверхность мозга. Соблюдайте крайнюю осторожность, чтобы избежать случайного повреждения головного мозга.
    7. Пришить дорсальную границу височной мышцы к подкожной клетчатке дорсального кожного лоскута с 6-0 монокриловыми нитями, делая ее приливной к открытой коре головного мозга.
    8. Закройте разрез кожи 6-0 монофиламентным швом. Поместите мышь обратно в клетку и следите за восстановлением после анестезии. Верните мышь в ее корпус.

3. Послеоперационные соображения

  1. Ежедневно контролируйте мышей на наличие болезни и место хирургического вмешательства на предмет инфекции. Ежедневно давайте подкожно нормальный физиологический раствор (1% объема от массы тела) для поддержки гидратации.
  2. Следите за сильным обезвоживанием (потеря массы тела >20%) до 7 дней после операции. Вводят дополнительный болюс подкожного нормального физиологического раствора 1% объема по массе тела, если >20% потери веса.
  3. Приступайте к инъекциям, физиологическому мониторингу и другим испытаниям без особых соображений.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этой процедуре использование опиоидов или нестероидных противовоспалительных препаратов (НПВП) для лечения после операции было исключено из-за известного воздействия этих агентов на исход инсульта или размер инфаркта в консультации с внутренним институциональным комитетом по уходу за животными и его использованию 15,16,17,18. Тем не менее, использование послеоперационной анальгезии настоятельно рекомендуется для хирургии EMS с другими моделями. Пожалуйста, обратитесь к Институциональному комитету по уходу за животными и их использованию (IACUC) для этого.

Результаты

В общей сложности для этого исследования была использована 41 мышь. После трех смертей, одной в MCAo и двух в MCAo + EMS, в общей сложности 38 мышей были использованы для получения показанных результатов.

Статистика
Данные каждого эксперимента представлены в виде средн...

Обсуждение

Этот протокол описывает успешную процедуру EMS в мышиной модели MCAo-индуцированного инсульта. Данные показывают, что трансплантированная ткань остается жизнеспособной и может образовывать связи с корой головного мозга еще долго после операции EMS. Эти результаты подтверждают обосновани...

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Благодарности

Эта работа была поддержана Программой передового опыта исследований - UConn Health (для Кетана Р. Булсара и Раджкумара Вермы) и стартапом UConn Health (для Раджкумара Вермы).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
6-0 monocryl sutureEthilon697G
70% ethanol to sanitize operating surfaceWalgreens
Bupivacaine 0.25% solutionMidwest Vet
Clamps for tissue retractionRoboz
Doccal suture with silicone coatingDoccal Corporation602145PK10Re
Electric heating pad for operating surface
Isoflurane anesthesiaPiramal Critical Care Inc
Isoflurane delivery apparatusB6Surgivet (Isotech 4)
Micro drillHarvard Apparatus
Microdissecting tweezers, curved x2Piramal Critical Care Inc
mouse angiogenesis panel arratR& D biotechARY015
Needle driverEthilon
Ointment for eye protectionWalgreens
Operating microscopeOlympus
Operating surfaceOlympus
Povidone iodine solutionWalgreens
Rectal thermometerworld precison instrument
Saline or 70% ethanol for irrigationWalgreens
Small electric razor to shave operative siteGeneric
Surgical scissorsRoboz

Ссылки

  1. Stroke, Last updated 10/22/20. , (2020).
  2. Cipolla, M. J., McCall, A. L., Lessov, N., Porter, J. M. Reperfusion decreases myogenic reactivity and alters middle cerebral artery function after focal cerebral ischemia in rats. Stroke. 28 (1), 176-180 (1997).
  3. Arai, K., et al. Cellular mechanisms of neurovascular damage and repair after stroke. Journal of Child Neurology. 26 (9), 1193-1198 (2011).
  4. Ergul, A., Alhusban, A., Fagan, S. C. Angiogenesis: a harmonized target for recovery after stroke. Stroke. 43 (8), 2270-2274 (2012).
  5. Imai, H., et al. The importance of encephalo-myo-synangiosis in surgical revascularization strategies for moyamoya disease in children and adults. World Neurosurgery. 83 (5), 691-699 (2015).
  6. Ravindran, K., Wellons, J. C., Dewan, M. C. Surgical outcomes for pediatric moyamoya: a systematic review and meta-analysis. Journal of Neurosurgery: Pediatrics. 24 (6), 663-672 (2019).
  7. Kim, H. S., et al. The neovascularization effect of bone marrow stromal cells in temporal muscle after encephalomyosynangiosis in chronic cerebral ischemic rats. Journal of Korean Neurosurgical Society. 44 (4), 249-255 (2008).
  8. Srivastava, P., et al. Neuroprotective and neuro-rehabilitative effects of acute purinergic receptor P2X4 (P2X4R) blockade after ischemic stroke. Experimental Neurology. , 329 (2020).
  9. Cao, R., et al. VEGFR1-mediated pericyte ablation links VEGF and PlGF to cancer-associated retinopathy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (2), 856-861 (2010).
  10. Hedlund, E., Hosaka, K., Zhong, Z., Cao, R., Cao, Y. Malignant cell-derived PlGF promotes normalization and remodeling of the tumor vasculature. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (41), 17505-17510 (2009).
  11. Cao, Y. Therapeutic angiogenesis for ischemic disorders: what is missing for clinical benefits. Discovery Medicine. 9 (46), 179-184 (2010).
  12. Verma, R., et al. Inhibition of miR-141-3p ameliorates the negative effects of poststroke social isolation in aged mice. Stroke. 49 (7), 1701-1707 (2018).
  13. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
  14. Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling stroke in mice-middle cerebral artery occlusion with the filament model. Journal of Visualized Experiments. 47 (47), 2423 (2011).
  15. Pétrault, M., et al. Neither nefopam nor acetaminophen can be used as postoperative analgesics in a rat model of ischemic stroke. Fundam Clin Pharmacol. (2), 194-200 (2017).
  16. Khansari PS, ., Halliwell RF, . Mechanisms Underlying Neuroprotection by the NSAID Mefenamic Acid in an Experimental Model of Stroke. (64), (2019).
  17. Mishra, V., Verma, R., Raghubir, R. Neuroprotective effect of flurbiprofen in focal cerebral ischemia: the possible role of ASIC1a. Neuropharmacology. 59 (7-8), 582-588 (2010).
  18. Chen, T. Y., Goyagi, T., Toung, T. J., Kirsch, J. R., Hurn, P. D., Koehler, R. C., Bhardwaj, A. Prolonged opportunity for ischemic neuroprotection with selective kappa-opioid receptor agonist in rats. Stroke. 35 (5), 1180-1185 (2004).
  19. Turóczi, Z., et al. Muscle fiber viability, a novel method for the fast detection of ischemic muscle injury in rats. PLoS ONE. 9 (1), e84783 (2014).
  20. Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. An introduction to performing immunofluorescence staining. Methods in Molecular Biology. , 299-311 (2019).
  21. Zheng, J., et al. Protective roles of adenosine A1, A2A, and A3 receptors in skeletal muscle ischemia and reperfusion injury. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 293 (6), H3685-H3691 (2007).
  22. Jiao, C., et al. Visualization of mouse choroidal and retinal vasculature using fluorescent tomato lectin perfusion. Translational Vision Science and Technology. 9 (1), (2020).
  23. Simard, J. M., Sahuquillo, J., Sheth, K. N., Kahle, K. T., Walcott, B. P. Managing malignant cerebral infarction. Current Treatment Options in Neurology. 13 (2), 217-229 (2011).
  24. Liu, X., et al. Osteoclasts protect bone blood vessels against senescence through the angiogenin/plexin-B2 axis. Nature Communications. 12 (1), 1832 (2021).
  25. Paro, M., Gamiotea-Turro, D., Blumenfeld, L., Bulsara KR, ., Verma, R. A Novel Model for Encephalomyosynangiosis Surgery after Middle Cerebral Artery Occlusion-Induced Stroke in Mice. BioXriv. 10, (2021).
  26. Venkat, P., et al. Treatment with an Angiopoietin-1 mimetic peptide promotes neurological recovery after stroke in diabetic rats. CNS Neuroscience & Therapeutics. 27 (1), 48-59 (2021).
  27. Cheng, X., et al. Acidic fibroblast growth factor delivered intranasally induces neurogenesis and angiogenesis in rats after ischemic stroke. Neurological Research. 33 (7), 675-680 (2011).
  28. Xu, H. Protective effects of mutant of acidic fibroblast growth factor against cerebral ischaemia-reperfusion injury in rats. Injury. 40 (9), 963-967 (2009).
  29. Tsai, M. J., et al. Acidic FGF promotes neurite outgrowth of cortical neurons and improves neuroprotective effect in a cerebral ischemic rat model. Neuroscience. 305, 238-247 (2015).
  30. Meller, R., et al. Neuroprotection by osteopontin in stroke. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 25 (2), 217-225 (2005).
  31. Meseguer, E., et al. Osteopontin predicts three-month outcome in stroke patients treated by reperfusion therapies. Journal of Clinical Medicine. 9 (12), 4028 (2020).
  32. Zhu, Z., et al. Plasma osteopontin levels and adverse clinical outcomes after ischemic stroke. Atherosclerosis. 332, 33-40 (2021).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

184

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены