Ein Modell für die Enzephalomyosynangiose-Behandlung nach einem durch Verschluss der mittleren Hirnarterie induzierten Schlaganfall bei Mäusen

Zusammenfassung

Das Protokoll zielt darauf ab, Methoden für die Enzephalomomyosynangiose - Transplantation eines vaskulären Temporalis-Muskellappens auf der Pialoberfläche des ischämischen Hirngewebes - zur Behandlung des akuten ischämischen Schlaganfalls ohne Moyamoya bereitzustellen. Die Wirksamkeit des Ansatzes bei der Steigerung der Angiogenese wird anhand eines vorübergehenden Verschlussmodells der mittleren Hirnarterien bei Mäusen bewertet.

Zusammenfassung

Für die meisten Patienten, die an einem ischämischen Schlaganfall leiden, gibt es keine wirksame Behandlung, was die Entwicklung neuartiger Therapeutika zwingend erforderlich macht. Die Fähigkeit des Gehirns, sich nach einem ischämischen Schlaganfall selbst zu heilen, ist durch eine unzureichende Blutversorgung im betroffenen Bereich eingeschränkt. Die Enzephalomyosynangiose (EMS) ist ein neurochirurgisches Verfahren, das bei Patienten mit Morbus Moyamoya eine Angiogenese erreicht. Es handelt sich um eine Kraniotomie mit Platzierung eines vaskulären Temporalis-Muskeltransplantats auf der ischämischen Gehirnoberfläche. EMS wurde noch nie im Rahmen eines akuten ischämischen Schlaganfalls bei Mäusen untersucht. Die Hypothese, die dieser Studie zugrunde liegt, ist, dass EMS die zerebrale Angiogenese an der kortikalen Oberfläche um das Muskeltransplantat herum verbessert. Das hier gezeigte Protokoll beschreibt das Verfahren und liefert erste Daten, die die Machbarkeit und Wirksamkeit des EMS-Ansatzes belegen. In diesem Protokoll wurden Mäuse nach 60 Minuten vorübergehendem mittleren Hirnarterienverschluss (MCAo) randomisiert entweder einer MCAo- oder MCAo + EMS-Behandlung unterzogen. Das EMS wurde 3-4 h nach der Okklusion durchgeführt. Die Mäuse wurden 7 oder 21 Tage nach der MCAo- oder MCAo + EMS-Behandlung geopfert. Die Lebensfähigkeit des Temporalis-Transplantats wurde mit dem Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-reduzierten Tetrazoliumreduktase-Assay gemessen. Ein Mausangiogenese-Array quantifizierte die angiogene und neuromodulierende Proteinexpression. Die Immunhistochemie wurde verwendet, um die Transplantatbindung mit der Hirnrinde und die Veränderung der Gefäßdichte zu visualisieren. Die vorläufigen Daten hier deuten darauf hin, dass der transplantierte Muskel 21 Tage nach dem EMS lebensfähig blieb. Die Immunfärbung zeigte eine erfolgreiche Transplantatimplantation und eine Zunahme der Gefäßdichte in der Nähe des Muskeltransplantats, was auf eine erhöhte Angiogenese hinweist. Die Daten zeigen, dass EMS den Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF) erhöht und den Osteopontinspiegel nach einem Schlaganfall senkt. Darüber hinaus erhöhte EMS nach einem Schlaganfall die Mortalität nicht, was darauf hindeutet, dass das Protokoll sicher und zuverlässig ist. Dieses neuartige Verfahren ist wirksam und gut verträglich und hat das Potenzial, Informationen über neuartige Interventionen zur verbesserten Angiogenese nach akutem ischämischen Schlaganfall zu liefern.

Einleitung

Der ischämische Schlaganfall ist eine akute neurovaskuläre Verletzung mit verheerenden chronischen Folgeerkrankungen. Die meisten Schlaganfallüberlebenden, 650.000 pro Jahr, in den USA leiden an einer dauerhaften funktionellen Behinderung¹. Keine der verfügbaren Behandlungen bietet Neuroprotektion und funktionelle Erholung nach der akuten Phase des ischämischen Schlaganfalls. Nach einem akuten ischämischen Schlaganfall sind sowohl die direkte als auch die kollaterale Blutversorgung vermindert, was zu Funktionsstörungen von Gehirnzellen und Netzwerken führt, was zu plötzlichen neurologischen Ausfällen führt ^2,3. Die Wiederherstellung der Blutversorgung der ischämischen Region bleibt das oberste Ziel der Schlaganfalltherapie. Daher ist die Verbesserung der Angiogenese zur Förderung der Blutversorgung im ischämischen Territorium ein vielversprechender therapeutischer Ansatz; Zuvor untersuchte Methoden zur Förderung der Angiogenese nach Schlaganfall, einschließlich Erythropoietin, Statine und Wachstumsfaktoren, wurden jedoch durch inakzeptable Toxizitäts- oder Übersetzbarkeitsniveaus eingeschränkt⁴.

Die Enzephalomyosynangiose (EMS) ist ein chirurgisches Verfahren, das die zerebrale Angiogenese bei Menschen mit Moyamoya-Krankheit verbessert, einem Zustand verengter Schädelarterien, der häufig zu einem Schlaganfall führt. EMS beinhaltet eine teilweise Ablösung eines vaskulären Abschnitts des Temporalismuskels des Patienten vom Schädel, gefolgt von einer Kraniotomie und einer Transplantation des Muskels auf den betroffenen Kortex. Dieses Verfahren ist gut verträglich und induziert eine zerebrale Angiogenese, wodurch das Risiko eines ischämischen Schlaganfalls bei Patienten mit Moyamoya-Krankheit verringert^{wird 5,6}. Somit erfüllt das Verfahren bei diesen Patienten weitgehend eine präventive Rolle. Die durch dieses Verfahren hervorgerufene Angiogenese kann auch eine Rolle bei der Förderung des neurovaskulären Schutzes und der Erholung im Rahmen eines ischämischen Schlaganfalls spielen. Dieser Bericht unterstützt die Hypothese, dass die durch EMS hervorgerufene Angiogenese das Potenzial hat, das Verständnis und die therapeutischen Optionen für zerebrale Ischämie zu erweitern.

Neben EMS gibt es mehrere pharmakologische und chirurgische Ansätze zur Verbesserung der Angiogenese, aber sie haben mehrere Einschränkungen. Pharmakologische Ansätze wie die Verabreichung des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors (VEGF) erwiesen sich aufgrund mehrerer Einschränkungen, einschließlich der Bildung chaotischer, desorganisierter, undichter und primitiver Gefäßplexus, die denen im Tumorgewebe ähneln ^7,8 und in klinischen Studien keine positiven Auswirkungen haben⁹.

Chirurgische Ansätze umfassen direkte Anastomose wie oberflächliche temporale Arterien-mittlere Hirnarterienanastomose, indirekte Anastomose wie Enzephalo-Duro-Arterio-Synangiose (EDAS), Enzephalomyosynangiose (EMS) und Kombinationen von direkter und indirekter Anastomose¹⁰. Alle diese Verfahren sind bei Kleintieren technisch sehr anspruchsvoll und anspruchsvoll, mit Ausnahme von EMS. Während die anderen Verfahren eine komplexe vaskuläre Anastomose erfordern, erfordert EMS ein relativ einfaches Muskeltransplantat. Darüber hinaus macht die Nähe des Musculus temporalis zum Kortex ihn zu einer natürlichen Wahl für die Transplantation, da er nicht vollständig herausgeschnitten oder von seiner Blutversorgung getrennt werden muss, wie es notwendig wäre, wenn ein weiter entfernter Muskel zum Pfropfen verwendet würde.

EMS wurde in chronischen zerebralen Hypoperfusionsmodellen an Ratten untersucht ^7,11. EMS mit einem Temporalis-Muskeltransplantat wurde jedoch noch nie bei akutem ischämischem Schlaganfall bei Nagetieren untersucht. Hier beschreiben wir ein neuartiges EMS-Protokoll bei Mäusen nach einem ischämischen Schlaganfall über ein mittleres Hirnarterienverschlussmodell (MCAo). Dieses Manuskript dient als Beschreibung von Methoden und frühen Daten für diesen neuartigen Ansatz des EMS bei Mäusen nach MCAo.

Protokoll

Alle Experimente wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee von UConn Health genehmigt und gemäß den US-Richtlinien durchgeführt. Das folgende Protokoll sollte bei jeder Art oder jedem Nagetierstamm funktionieren. Hier wurden 8 bis 12 Wochen alte, alters- und gewichtsangepasste C57BL/6-Wildtyp-Männchen verwendet. Mäuse wurden mit Standardfutter und Wasser ad libitum gefüttert. Die Standard-Gehäusebedingungen wurden bei 72,3 ° F und 30% -70% relativer Luftfeuchtigkeit mit einem Hell-Dunkel-Zyklus von 12 Stunden beibehalten.

1. Vorbereitung vor der Operation

1. Sterilisieren Sie alle Instrumente vor der Operation durch Autoklavieren. Desinfizieren Sie die Bedienfläche mit 70% Ethanol und erwärmen Sie die Bedienfläche mit einem elektrischen Heizkissen auf 37 °C.
2. Verwenden Sie eine Induktionskammer, um die Maus mit 4% -5% Isofluran zur Induktion zu betäuben. Verabreichen Sie 1,5% -2,0% Isofluran über den Nasenkonus zur Aufrechterhaltung bis zum Ende der Operation. Stellen Sie vor der Operation sicher, dass die Maus ordnungsgemäß betäubt wird, indem Sie das Fehlen einer Reaktion auf eine feste Hinterfußklemme und den Verlust der Haltungsreaktion und des Aufrichtreflexes beurteilen.
3. Legen Sie die Maus auf die linke Seite auf die Operationsfläche und tragen Sie eine Augensalbe auf, um beide Augen zu schützen.
4. Rasieren Sie Haare über dem Operationsfeld (d.h. rechter lateraler Schädel zwischen Auge und Ohr) mit elektrischen Haarschneidemaschinen. Reinigen Sie das Operationsfeld in konzentrischen Kreisen von der Mitte der Operationsstelle nach außen mit 70% Ethanol gefolgt von Povidonlösung und wiederholen Sie diese Schritte 2x.
   HINWEIS: Da sich die Operationsstelle in der Nähe des Auges befindet, ist es möglicherweise nicht möglich, 150% des Bereichs um eine Operationsstelle herum zu entfernen, um Reizungen oder versehentliche Verletzungen des Auges zu vermeiden.
5. Verabreichen Sie eine Einzeldosis von 0,25% Bupivacain (bis zu 8 mg/kg Körpergewicht) durch subkutane Injektion als präoperative Analgesie an der Operationsstelle.
6. Stellen Sie ein Operationsmikroskop mit 4-facher Vergrößerung auf. Das Mikroskop wird für alle chirurgischen Schritte verwendet.

2. Chirurgischer Eingriff

HINWEIS: Die Operationsschritte sind in Abbildung 1 dargestellt. Für dieses Protokoll wurden drei Mäuse der Scheingruppe, drei Mäuse für EMS allein, 12 Mäuse für MCAo und 23 Mäuse für MCAo + EMS-Gruppe zugeordnet.

1. MCAo-Chirurgie
   HINWEIS: MCAo ist ein gut charakterisiertes Modell des ischämischen Schlaganfalls bei Nagetieren, wie von uns und anderen beschrieben^12,13,14. Die Operationsschritte werden hier kurz beschrieben. Die fokale transiente zerebrale Ischämie wurde durch eine 60-minütige rechte MCAo unter Isoflurananästhesie induziert, gefolgt von einer Reperfusion für 7 oder 21 Tage.
   1. Machen Sie einen ventralen Nackenschnitt in der Mittellinie, gefolgt von einem einseitigen rechten MCAo, indem Sie ein 10-11 mm langes 6.0-Silikongummi-beschichtetes Monofilament von der inneren Karotis-Arterienbifurkation über einen äußeren Karotis-Arterienstumpf vorschieben. Führen Sie bei Scheinmäusen identische Operationen durch, mit Ausnahme des Vorrückens der Naht in die Arteria carotis interna.
   2. Messen Sie die Rektaltemperaturen mit einem Temperaturkontrollsystem und halten Sie die Temperatur während der Operation mit einem automatischen Heizkissen bei ~ 37 ° C.
   3. Verwenden Sie die Laser-Doppler-Durchflussmessung, um den zerebralen Blutfluss vor dem Nahteinführen zu messen, indem Sie die Dopplersonde gegen den lateralen Schädel (entsprechend dem MCA-Territorium) legen und den Wert⁸ aufzeichnen. Um die Okklusionsreduktion auf 15% des zerebralen Blutflusses zu bestätigen, verwenden Sie das gleiche Verfahren, nachdem die Naht vorgeschoben wurde. Um die Reperfusion zu bestätigen, verwenden Sie das gleiche Verfahren, nachdem die Naht entfernt wurde.
   4. Füttern Sie alle Tiere mit nassem Brei bis zum Opfer und/oder 1 Woche nach der Operation, um eine angemessene Ernährung für chronische Endpunkte zu gewährleisten, da die Tiere nach einem Schlaganfall Aufzuchtdefizite aufweisen.
2. EMS-Chirurgie
   1. Nach 60 Minuten MCAo randomisieren Sie Mäuse in MCAo-only- oder MCAo + EMS-Gruppen. Führen Sie EMS 4 h nach MCAo (MCAo + EMS-Gruppe) oder Scheinoperationen für ausgewählte Experimente (EMS-only-Gruppe) durch. Wechseln Sie vor der Operation in ein neues Paar sterile OP-Handschuhe.
      HINWEIS: Die Mäuse erholten sich nach 60 Minuten MCAo von der Anästhesie und wurden vor der EMS-Operation erneut betäubt.
   2. Für Gruppen, die EMS erhalten (MCAo + EMS oder EMS-only-Gruppen), machen Sie einen 10-15 mm Hautschnitt mit einer Schere, der sich von 1-2 mm rostral zum rechten Ohr bis 1-2 mm kaudal zum rechten Auge erstreckt.
      HINWEIS: Eine sterile Schere wurde verwendet, um eine versehentliche Beschädigung der darunter liegenden Temporalis-Muskeln zu verhindern.
   3. Ziehen Sie Hautlappen mit Klemmen zurück und identifizieren Sie visuell den Temporalismuskel und den Schädel.
   4. Sezieren Sie den Musculus temporalis stumpf vom Schädel weg, indem Sie eine Schere mit einer Spreiztechnik verwenden. Führen Sie eine 2-3 mm Myotomie durch, die ventral entlang der kaudalen Grenze des Muskels gerichtet ist, um die ventrale Reflexion zu erleichtern.
   5. Führen Sie eine Kraniotomie ~ 5 mm Durchmesser am Schädel unter dem reflektierten Temporalismuskel mit einem Mikrobohrer durch.
   6. Entfernen Sie die Dura mater mit einer Pinzette, um die Pialoberfläche des Gehirns freizulegen. Seien Sie äußerst vorsichtig, um versehentliche Verletzungen des Gehirns zu vermeiden.
   7. Vernähen Sie den dorsalen Rand des Musculus temporalis mit dem Unterhautgewebe des dorsalen Hautlappens mit 6-0 Monokrylfilamenten, wodurch er bündig zur freiliegenden Großhirnrinde wird.
   8. Schließen Sie den Hautschnitt mit einer 6-0-Monofilamentnaht. Setzen Sie die Maus zurück in den Käfig und überwachen Sie, bis sie sich von der Narkose erholt hat. Bringen Sie die Maus in ihre Wohneinrichtung zurück.

3. Postoperative Überlegungen

1. Überwachen Sie die Mäuse täglich auf Krankheiten und die Operationsstelle auf Infektionen. Geben Sie täglich subkutane normale Kochsalzlösung (1% Volumen nach Körpergewicht), um die Hydratation zu unterstützen.
2. Überwachung auf schwere Dehydratation (Verlust des Körpergewichts >20%) bis 7 Tage nach der Operation. Verabreichen Sie einen zusätzlichen Bolus von subkutaner normaler Kochsalzlösung 1% Volumen nach Körpergewicht, wenn >20% Gewichtsverlust.
3. Fahren Sie mit Injektionen, physiologischer Überwachung und anderen Tests ohne besondere Überlegungen fort.
   HINWEIS: Bei diesem Verfahren wurde die Verwendung von Opioiden oder nichtsteroidalen Antirheumatika (NSAIDs) zur Behandlung nach der Operation aufgrund der bekannten Auswirkungen dieser Mittel auf das Schlaganfallergebnis oder die Infarktgröße in Absprache mit dem internen institutionellen Tierpflege- und -verwendungsausschuss^15,16,17,18 vermieden. Die Verwendung von postoperativer Analgesie wird jedoch für EMS-Operationen mit anderen Modellen dringend empfohlen. Bitte wenden Sie sich hierzu an das Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

Ergebnisse

Insgesamt wurden 41 Mäuse für diese Studie verwendet. Nach drei Mortalitäten, eine in MCAo und zwei in MCAo + EMS, wurden insgesamt 38 Mäuse verwendet, um die gezeigten Ergebnisse zu erhalten.

Statistik
Die Daten aus jedem Experiment werden als Mittelwert ± Standardabweichung (S.D.) dargestellt. Die Signifikanz wurde entweder unter Verwendung des ungepaarten studentischen t-Tests zum Vergleich zweier Gruppen oder der Einweg-ANOVA für mehr als zwei Gruppen bestimmt, wo...

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt ein erfolgreiches EMS-Verfahren in einem Mausmodell des MCAo-induzierten Schlaganfalls. Die Daten zeigen, dass transplantiertes Gewebe lebensfähig bleibt und lange nach der EMS-Operation Bindungen mit der Hirnrinde eingehen kann. Diese Ergebnisse unterstützen die Begründung für die Verwendung eines zerebralen Muskeltransplantats, um allmählich eine reich vaskuläre trophische Umgebung am Ort des Schlaganfalls zu entwickeln. EMS ist eine vielversprechende Therapie zur potenziellen Reparatu...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-0 monocryl suture	Ethilon	697G
70% ethanol to sanitize operating surface	Walgreen
Bupivacaine 0.25% solution	Midwest Vet
Clamps for tissue retraction	Roboz
Doccal suture with Nylon coating	Doccal corporation Sharon MA	602145PK10Re
Electric heating pad for operating surface
Isoflurane anesthesia	Piramal Critical Care Inc
Isoflurane delivery apparatus	--B6Surgivet (Isotech 4)
Micro drill	Harvard Apparatus
Microdissecting tweezers, curved x2	Piramal Critical Care Inc
mouse angiogenesis panel arrat	R& D biotech	ARY015
Needle driver	Ethilon
Ointment for eye protection	walgreen
Operating microscope	Olympus
Operating surface	Olympus
Povidone iodine solution	walgreen
Rectal thermometer	world precison instrument
Saline or 70% ethanol for irrigation	walgreen
Small electric razor to shave operative site	generic
Surgical scissors	Roboz