マウスにおける中大脳動脈閉塞性脳卒中後の脳筋シナジア症治療モデル

要約

このプロトコルは、脳筋結合症(虚血性脳組織の髄面に血管側頭筋皮弁を移植する)の方法を提供することを目的としています-非モヤモヤ急性虚血性脳卒中の治療用。血管新生の増加におけるこのアプローチの有効性は、マウスの一過性中大脳動脈閉塞モデルを使用して評価されます。

要約

虚血性脳卒中を患っているほとんどの患者に利用可能な効果的な治療法はなく、新しい治療法の開発が不可欠です。虚血性脳卒中後の脳の自己治癒能力は、患部での不十分な血液供給によって制限されます。脳筋シナジア症(EMS)は、モヤモヤ病患者の血管新生を達成する脳神経外科手術です。それは虚血性脳表面に血管側頭筋移植片を配置する開頭術を含む。EMSは、マウスの急性虚血性脳卒中の設定で研究されたことはありません。この研究を推進する仮説は、EMSが筋移植片周囲の皮質表面での脳血管新生を促進するというものです。ここに示すプロトコルは、手順を説明し、EMSアプローチの実現可能性と有効性をサポートする初期データを提供します。このプロトコールでは、一過性中大脳動脈閉塞(MCAo)の60分後に、マウスをMCAoまたはMCAo+EMS処置のいずれかに無作為化した。EMSは閉塞後3〜4時間で実施した。MCAoまたはMCAo+EMS処置の7または21日後にマウスを屠殺した。側頭筋移植片の生存率は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型テトラゾリウムレダクターゼアッセイを用いて測定した。マウス血管新生アレイは、血管新生および神経調節タンパク質発現を定量化した。免疫組織化学を用いて、脳皮質との移植片結合および血管密度の変化を可視化した。ここでの予備データは、移植された筋肉がEMSの21日後に生存可能なままであったことを示唆しています。免疫染色は、移植片移植の成功と筋移植片近傍の血管密度の増加を示し、血管新生の増加を示しました。データは、EMSが線維芽細胞成長因子(FGF)を増加させ、脳卒中後のオステオポンチンレベルを低下させることを示しています。さらに、脳卒中後のEMSは死亡率を増加させなかったため、プロトコルが安全で信頼できることが示唆されました。この新しい手順は効果的で忍容性が高く、急性虚血性脳卒中後の血管新生の増強のための新しい介入の情報を提供する可能性があります。

概要

虚血性脳卒中は、壊滅的な慢性後遺症を伴う急性神経血管損傷です。米国の脳卒中生存者のほとんどは、年間65万人で、永続的な機能障害に苦しんでいます¹。利用可能な治療法のいずれも、虚血性脳卒中の急性期後の神経保護と機能回復をもたらしません。.急性虚血性脳卒中の後、直接血液供給と側副血液供給の両方が減少し、脳細胞とネットワークの機能不全につながり、突然の神経学的欠損を引き起こします^2,3。虚血領域への血液供給の回復は、脳卒中治療の最も重要な目標であり続けています。したがって、虚血領域における血液供給を促進するために血管新生を増強することは、有望な治療アプローチである。しかし、エリスロポエチン、スタチン、成長因子など、脳卒中後の血管新生を促進するために以前に研究された方法は、許容できないレベルの毒性または翻訳可能性によって制限されてきました⁴。

脳筋膜症(EMS)は、脳卒中につながることが多い頭蓋動脈が狭窄した状態であるモヤモヤ病のヒトの脳血管新生を促進する外科的処置です。EMSには、頭蓋骨からの患者の側頭筋の血管部分の部分的な剥離、それに続く開頭術および罹患皮質への筋肉の移植が含まれる。この手順は忍容性が高く、脳血管新生を誘発し、モヤモヤ病患者の虚血性脳卒中のリスクを軽減します^5,6。したがって、この手順は、これらの患者において主に予防的役割を果たす。この手順によってもたらされる血管新生はまた、虚血性脳卒中の設定における神経血管の保護および回復を促進する役割を有する可能性がある。本報告は、EMSがもたらす血管新生が脳虚血の理解と治療選択肢を広げる可能性があるという仮説を支持しています。

EMSの他に、血管新生を改善するためのいくつかの薬理学的および外科的アプローチがありますが、それらにはいくつかの制限があります。血管内皮増殖因子(VEGF)投与などの薬理学的アプローチは、腫瘍組織に見られるものに似ており、臨床試験では有益な効果を有さない、混沌とした、混乱した、漏出性のある、原始的な血管神経叢の形成を含むいくつかの制限のために不十分または有害でさえ^{あることがわかってい}ます^7,8。

外科的アプローチには、表在側頭動脈-中大脳動脈吻合などの直接吻合、脳二重動脈シナジア症(EDAS)、脳筋結合症(EMS)などの間接吻合、および直接および間接吻合の組み合わせが含まれます¹⁰。これらの手順はすべて、EMSを除いて、小動物では非常に技術的に困難で要求が厳しいものです。他の手順では複雑な血管吻合が必要ですが、EMSでは比較的単純な筋移植が必要です。さらに、側頭筋が皮質に近接しているため、より遠い筋肉を移植に使用する場合のように、完全に切除したり血液供給から切り離したりする必要がないため、移植に自然な選択になります。

EMSは、ラット^7,11の慢性脳低灌流モデルで研究されています。しかし、側頭筋移植を用いたEMSは、げっ歯類の急性虚血性脳卒中において研究されたことがない。ここでは、中大脳動脈閉塞モデル(MCAo)を介した虚血性脳卒中後のマウスにおけるEMSの新しいプロトコルについて説明します。この原稿は、MCAo後のマウスにおけるEMSのこの新しいアプローチの方法と初期のデータの説明として機能します。

プロトコル

すべての実験は、UConn Healthの施設動物管理および使用委員会によって承認され、米国のガイドラインに従って実施されました。次のプロトコルは、げっ歯類のあらゆる種または系統で機能するはずです。ここでは、8〜12週齢の年齢と体重が一致したC57BL / 6野生型雄マウスを使用しました。マウスには、標準的な飼料飼料および水を 自由摂取させた。標準的な住宅条件は、72.3時間の明暗サイクルで70%〜70%の相対湿度で12%〜12%に維持されました。

1.手術前の準備

1. 手術前にオートクレーブ滅菌してすべての器具を滅菌してください。操作面を70%エタノールで消毒し、電気加熱パッドで操作面を37°Cに温めます。
2. 誘導チャンバーを使用して、誘導のために4%〜5%イソフルランでマウスを麻酔します。手術終了まで維持のために、ノーズコーン を介して 1.5%〜2.0%のイソフルランを送達する。手術の前に、しっかりとした後ろ足のつまみに対する反応の欠如と姿勢反応と直正反射の喪失を評価することにより、マウスが適切に麻酔されていることを確認してください。
3. マウスを手術面の左側に置き、両目を保護するために目の軟膏を塗ります。
4. 電気バリカンで手術野(つまり、目と耳の間の右外側頭蓋骨)の上で髪を剃ります。手術部位の中央から外側に同心円状に手術野を洗浄し、70%エタノールとそれに続くポビドン溶液で、これらの手順を2回繰り返します。
   注意: 手術部位が目に近いため、手術部位の周囲の領域を150%除去しても、眼への刺激や偶発的な損傷を回避できない場合があります。
5. 手術部位での術前鎮痛として、皮下注射により0.25%ブピバカイン(最大8 mg / kg体重)の単回投与を投与します。.
6. 4倍の倍率で手術用顕微鏡を設置します。顕微鏡はすべての手術ステップに使用されます。

2.手術手順

注:手術の手順は 図1に示されています。このプロトコルのために、3匹のマウスを偽群に、3匹のマウスをEMS単独に、12匹のマウスをMCAoに、23匹のマウスをMCAo+EMS群に割り付けた。

1. MCAo手術
   注:MCAoは、私たちや他の人が説明しているように、げっ歯類の虚血性脳卒中の十分に特徴付けられたモデルです^12,13,14。手術の手順はここで簡単に説明されています。限局性一過性脳虚血は、イソフルラン麻酔下で60分間の右MCAoとそれに続く7または21日間の再灌流によって誘発されました。
   1. 内頸動脈分岐部から外頸動脈断端 を介して 長さ10〜11 mmの6.0シリコーンゴムコーティングモノフィラメントを進めることにより、正中線腹頸部切開を行い、続いて片側右MCAoを行います。偽マウスでは、縫合糸が内頸動脈に進んだことを除いて、同一の手術を行う。
   2. 温度制御システムを使用して直腸温度を測定し、自動加熱パッドで手術中の温度を~37°Cに維持します。
   3. レーザードップラー流量測定を使用して、ドップラープローブを外側頭蓋骨(MCA領域に対応)に配置し、値⁸を記録することにより、縫合糸挿入前に脳血流を測定します。ベースラインの脳血流の15%への閉塞の減少を確認するには、縫合が進んだ後に同じ手順を使用します。再灌流を確認するには、縫合糸を取り外した後も同じ手順を使用します。
   4. 動物は脳卒中後の飼育不足があるため、慢性エンドポイントに十分な栄養を確保するために、犠牲までおよび/または手術後1週間まで、すべての動物に湿ったマッシュを与えます。
2. EMS手術
   1. MCAoの60分後、マウスをMCAoのみまたはMCAo + EMSグループにランダム化します。MCAo(MCAo + EMSグループ)または一部の実験(EMSのみのグループ)の偽手術の4時間後にEMSを実行します。手術前に新しい滅菌手術用手袋に交換してください。
      注:マウスはMCAoの60分後に麻酔から回復し、EMS手術の前に再麻酔されました。
   2. EMSを受けるグループ(MCAo + EMSまたはEMSのみのグループ)の場合は、ハサミで10〜15 mmの皮膚切開を行い、1〜2 mmの吻側から右耳、1〜2 mmの尾から右目まで伸ばします。
      注:滅菌ハサミは、下の側頭筋への偶発的な損傷を防ぐために使用されました。
   3. クランプを使用して皮膚フラップを引っ込め、側頭筋と頭蓋骨を視覚的に識別します。
   4. 側頭筋を頭蓋骨から鈍く解剖し、はさみを使用して広げます。腹側反射を促進するために、筋肉の尾側の境界に沿って腹側に向けられた2〜3 mmの筋切り術を実行します。
   5. マイクロドリルを使用して、反射側頭筋の下の頭蓋骨で直径~5mmの開頭術を行います。
   6. ピンセットで硬膜を取り除き、脳の眼底面を露出させます。脳への偶発的な損傷を避けるために細心の注意を払ってください。
   7. 側頭筋の背側境界を背側皮膚皮弁の皮下組織に6-0本のモノクリルフィラメントで縫合し、露出した大脳皮質と同じ高さにします。
   8. 6-0モノフィラメント縫合糸で皮膚切開を閉じます。マウスをケージに戻し、麻酔から回復するまで監視します。マウスを住宅施設に戻します。

3.術後の考慮事項

1. マウスの病気と手術部位の感染を毎日監視します。水分補給をサポートするために、皮下生理食塩水(体重1%)を毎日与えます。.
2. 手術後7日まで重度の脱水症(体重減少>20%)を監視します。>20%体重減少の場合は体重で1%容量の皮下生理食塩水の追加ボーラスを投与する。
3. 注射、生理学的モニタリング、およびその他のテストは、特別な考慮なしに進めてください。
   注:この手順では、手術後の治療にオピオイドまたは非ステロイド性抗炎症薬(NSAID)を使用することは、社内の施設動物ケアおよび使用委員会^15,16,17,18と協議して、脳卒中の結果または梗塞のサイズに対するこれらの薬剤の既知の効果のために回避されました。ただし、他のモデルとのEMS手術には、術後鎮痛の使用が強く推奨されます。これについては、施設動物管理使用委員会(IACUC)にご相談ください。

結果

合計41匹のマウスをこの研究に使用しました。MCAoにおける1匹およびMCAo+EMSにおける2匹の3匹の死亡後、合計38匹のマウスを、示された結果を得るために使用した。

統計学
各実験のデータは、平均±標準偏差(S.D.)として表されます。有意性は、2つのグループを比較するための対応のないスチューデントのt検定または2つ以上のグループに対する一元配置分散?...

ディスカッション

このプロトコルは、MCAo誘発脳卒中のマウスモデルにおける成功したEMS手順について説明しています。データは、移植された組織が生存可能なままであり、EMS手術後もずっと脳皮質と結合を形成する可能性があることを示しています。これらの知見は、脳卒中部位に血管栄養環境を徐々に発達させるために脳筋移植を使用する理論的根拠を支持している。EMSは、同じ環境で梗塞した大脳組織を...

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