Agrobacterium tumefaciens-Ingeniería genética mediada por microalgas verdes, Chlorella vulgaris

Resumen

Este protocolo describe la utilización de la transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens (AMT) para integrar genes de interés en el genoma nuclear de la microalga verde Chlorella vulgaris, lo que conduce a la producción de transformantes estables.

Resumen

La transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens (AMT) sirve como una herramienta ampliamente empleada para manipular los genomas de las plantas. Sin embargo, A. tumefaciens exhibe la capacidad de transferencia génica a una amplia gama de especies. Numerosas especies de microalgas carecen de métodos bien establecidos para integrar de forma fiable genes de interés en su genoma nuclear. Para aprovechar los beneficios potenciales de la biotecnología de microalgas, es crucial contar con herramientas de manipulación genómica sencillas y eficientes. En este trabajo, se presenta un protocolo de AMT optimizado para la especie de microalga industrial Chlorella vulgaris, utilizando la proteína fluorescente verde reportera (mGFP5) y el marcador de resistencia a antibióticos para la higromicina B. Los mutantes se seleccionan mediante siembra en medios de tris-acetato-fosfato (TAP) que contienen higromicina B y cefotaxima. La expresión de mGFP5 se cuantifica a través de la fluorescencia después de más de diez generaciones de subcultivo, lo que indica la transformación estable del casete de ADN-T. Este protocolo permite la generación confiable de múltiples colonias transgénicas de C. vulgaris en menos de dos semanas, empleando el vector de expresión vegetal pCAMBIA1302 disponible comercialmente.

Introducción

Agrobacterium tumefaciens, una bacteria gramnegativa transmitida por el suelo, posee una capacidad única de transferencia de genes entre reinos, lo que le valió el título de "ingeniero genético natural"¹. Esta bacteria puede transferir ADN (ADN-T) de un plásmido inductor de tumores (Plásmido Ti) a las células huésped a través de un sistema de secreción de tipo IV, lo que resulta en la integración y expresión del ADN-T dentro del genoma del huésped 1,2,3,4. En el entorno natural, este proceso conduce a la form....

Protocolo

Todos los medios y soluciones deben esterilizarse en autoclave antes de su uso, a menos que se indique lo contrario. Todos los tubos de centrífuga, puntas de pipeta, etc., deben ser estériles o esterilizados en autoclave antes de su uso. Para facilitar la referencia, las recetas de medios utilizadas en este protocolo se enumeran en la Tabla 1.

1. Preparación de células electrocompetentes de A. tumefaciens

1. Inocular Agrobacterium (AGL-1) en un matraz agitador estéril de 25 ml de medios LB (suplementado con rifampicina, 20 mg/L-1) a partir de una reserva de glicerol congelada y cre....

Resultados

Para demostrar el éxito de la transformación utilizando el método anterior, C. vulgaris se cocultivó con AGL-1 que contenía el plásmido pCAMBIA1302 o sin el plásmido (tipo salvaje y se colocó en agar TAP suplementado con higromicina B y cefotaxima (Figura 1A). La placa más a la izquierda muestra las colonias transformadas capaces de crecer en las placas de higromicina B/cefotaxima, y la placa del medio muestra que AGL-1 de tipo salvaje no puede crecer en las placas de higro.......

Discusión

La eficiencia de la transformación está asociada a varios parámetros diferentes. La elección de las cepas de A. tumefaciens utilizadas para AMT es crucial. AGL-1 es una de las cepas más invasivas descubiertas y, por esta razón, se ha utilizado de forma rutinaria en la AMT de las plantas. La suplementación de los medios de inducción con glucosa (15-20 mM) también es importante para la eficiencia de la AMT. Teniendo en cuenta que C. vulgaris puede crecer tanto en condiciones fototróficas como he.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 Kb Plus DNA ladder	FroggaBio	DM015
Acetosyringone	Fisher Scientific	D26665G
Agrobacterium tumefaciens	Gold Biotechnologies	Strain: AGL-1; Gift from Prof. Paul Hooykaas	Genotype: C58 RecA (RifR/CarbR) pTiBo542DT-DNA
Biotin	Enzo Life Sciences	89151-400
CaCl2·2H2O	VWR	BDH9224-1KG
Cefotaxime	AK Scientific	J90010
Chlorella vulgaris	University of Texas at Austin Culture Collection of Algae	Strain: UTEX 395	Wildtype strain
CoCl2·6H2O	Sigma Aldrich	C8661-25G
CuSO4·5H2O	EMD Millipore	CX2185-1
FeCl3·6H2O	VWR	BDH9234-500G
Gene Pulser Xcell Electroporator	Bio-Rad	1652662	Main unit equipped with PC module.
GeneJET Plant Genome Purification Kit	Thermo Scientific	K0791
Glacial acetic acid	VWR	CABDH3093-2.2P
Glycerol	BioBasic	GB0232
HEPES Buffer	Sigma Aldrich	H-3375
Hygromycin B	Fisher Scientific	AAJ6068103
K2HPO4	VWR	BDH9266-500G
Kanamycin	Gold Biotechnologies	K-250-25
KH2PO4	VWR	BDH9268-500G
MgSO4·7H2O	VWR	97062-134
MnCl2·4H2O	JT Baker	BAKR2540-01
Na2CO3	VWR	BDH7971-1
Na2EDTA·2H2O	JT Baker	8993-01
Na2MoO4·2H2O	JT Baker	BAKR3764-01
NaCl	VWR	BDH7257-7
NaH2PO4 H2O	Millipore Sigma	CA80058-650
NaNO3	VWR	BDH4574-500G
NEBExpress Ni Resin	NewEngland BioLabs	NEB #S1427
NH4Cl	VWR	BDH9208-500G
pCAMBIA1302	Leiden University	Gift from Prof. Paul Hooykaas	pBR322, KanR, pVS1, T-DNA(CaMV 35S/HygR/CaMV polyA, CaMV 35S promoter/mgpf5-6xhis/NOS terminator)
Polypropylene Columns (5 mL)	QIAGEN	34964
Precision Plus Protein Unstained Protein Standards, Strep-tagged recombinant, 1 mL	Bio-Rad	1610363
Rifampicin	Millipore Sigma	R3501-1G
SunBlaster LED Strip Light 48 Inch	SunBlaster	210000000906
Synergy 4 Microplate UV/Vis spectrometer	BioTEK	S4MLFPTA
Tetracycline	Thermo Scientific Chemicals	CAAAJ61714-14
TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 12%	Bio-Rad	1610185
Thiamine	TCI America	T0181-100G
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-500
Tryptone	BioBasic	TG217(G211)
Vitamin B12 (cyanocobalamin)	Enzo Life Sciences	89151-436
Yeast Extract	BioBasic	G0961
ZnSO4·7H2O	JT Baker	4382-01