Agrobacterium tumefaciens-опосредованная генная инженерия зеленых микроводорослей, Chlorella vulgaris

Резюме

В этом протоколе описывается использование Agrobacterium tumefaciens-опосредованной трансформации (АМТ) для интеграции интересующего гена (генов) в ядерный геном зеленой микроводоросли Chlorella vulgaris, что приводит к производству стабильных трансформентов.

Аннотация

Agrobacterium tumefaciens-опосредованная трансформация (AMT) служит широко используемым инструментом для манипулирования геномами растений. Тем не менее, A. tumefaciens демонстрируют способность к переносу генов к разнообразным видам. У многих видов микроводорослей отсутствуют хорошо зарекомендовавшие себя методы надежной интеграции интересующих генов в их ядерный геном. Чтобы использовать потенциальные преимущества биотехнологии микроводорослей, решающее значение имеют простые и эффективные инструменты манипулирования геномом. В данной работе представлен оптимизированный протокол АМТ для промышленного вида микроводорослей Chlorella vulgaris, использующий репортерный зеленый флуоресцентный белок (mGFP5) и маркер устойчивости к антибиотикам для гигромицина В. Мутанты отбираются путем нанесения покрытия на трис-ацетат-фосфатную (TAP) среду, содержащую гигромицин В и цефотаксим. Экспрессия mGFP5 количественно оценивается с помощью флуоресценции после более чем десяти поколений субкультивирования, что указывает на стабильную трансформацию кассеты Т-ДНК. Этот протокол позволяет надежно генерировать несколько трансгенных колоний C. vulgaris менее чем за две недели, используя коммерчески доступный вектор экспрессии растений pCAMBIA1302.

Введение

Agrobacterium tumefaciens, грамотрицательная почвенная бактерия, обладает уникальной способностью к переносу генов между царствами, благодаря чему ее называют «природным генным инженером»¹. Эта бактерия может переносить ДНК (Т-ДНК) от опухолеобразующей плазмиды (Ti-плазмида) в клетки хозяина через систему секреции IV типа, что приводит к интеграции и экспрессии Т-ДНК в геноме хозяина 1,2,3,4. В естественных условиях этот процесс приводит к образованию опухолей у растений, широко известной как болезнь корончат....

протокол

Все среды и растворы должны быть автоклавированы перед использованием, если не указано иное. Все центрифужные пробирки, наконечники для пипеток и т. д. должны быть стерильными или автоклавными перед использованием. Для удобства рецепты сред, используемые в этом протоколе, перечислены в таблице 1.

1. Подготовка электрокомпетентных клеток A. tumefaciens

1. Посев Agrobacterium (AGL-1) в стерильную колбу-шейкер объемом 25 мл со средой LB (с добавлением рифампицина, 20 мг/л-1) из замороженного запаса глицерина и выращивание в течение ночи при ^28-30 °C и 150 об/мин.
   ПРИМЕЧА....

Результаты

Чтобы продемонстрировать успешную трансформацию с использованием описанного выше метода, C. vulgaris культивировали либо с AGL-1, содержащим плазмиду pCAMBIA1302, либо без плазмиды (дикого типа и покрытой агаром TAP, дополненным гигромицином В и цефотаксимом (рис. 1A). Крайняя лев.......

Обсуждение

Эффективность трансформации связана с несколькими различными параметрами. Выбор штаммов A. tumefaciens , используемых для АМТ, имеет решающее значение. AGL-1 является одним из наиболее инвазивных обнаруженных штаммов и по этой причине регулярно используется в АМТ растений. Добавление в и?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 Kb Plus DNA ladder	FroggaBio	DM015
Acetosyringone	Fisher Scientific	D26665G
Agrobacterium tumefaciens	Gold Biotechnologies	Strain: AGL-1; Gift from Prof. Paul Hooykaas	Genotype: C58 RecA (RifR/CarbR) pTiBo542DT-DNA
Biotin	Enzo Life Sciences	89151-400
CaCl2·2H2O	VWR	BDH9224-1KG
Cefotaxime	AK Scientific	J90010
Chlorella vulgaris	University of Texas at Austin Culture Collection of Algae	Strain: UTEX 395	Wildtype strain
CoCl2·6H2O	Sigma Aldrich	C8661-25G
CuSO4·5H2O	EMD Millipore	CX2185-1
FeCl3·6H2O	VWR	BDH9234-500G
Gene Pulser Xcell Electroporator	Bio-Rad	1652662	Main unit equipped with PC module.
GeneJET Plant Genome Purification Kit	Thermo Scientific	K0791
Glacial acetic acid	VWR	CABDH3093-2.2P
Glycerol	BioBasic	GB0232
HEPES Buffer	Sigma Aldrich	H-3375
Hygromycin B	Fisher Scientific	AAJ6068103
K2HPO4	VWR	BDH9266-500G
Kanamycin	Gold Biotechnologies	K-250-25
KH2PO4	VWR	BDH9268-500G
MgSO4·7H2O	VWR	97062-134
MnCl2·4H2O	JT Baker	BAKR2540-01
Na2CO3	VWR	BDH7971-1
Na2EDTA·2H2O	JT Baker	8993-01
Na2MoO4·2H2O	JT Baker	BAKR3764-01
NaCl	VWR	BDH7257-7
NaH2PO4 H2O	Millipore Sigma	CA80058-650
NaNO3	VWR	BDH4574-500G
NEBExpress Ni Resin	NewEngland BioLabs	NEB #S1427
NH4Cl	VWR	BDH9208-500G
pCAMBIA1302	Leiden University	Gift from Prof. Paul Hooykaas	pBR322, KanR, pVS1, T-DNA(CaMV 35S/HygR/CaMV polyA, CaMV 35S promoter/mgpf5-6xhis/NOS terminator)
Polypropylene Columns (5 mL)	QIAGEN	34964
Precision Plus Protein Unstained Protein Standards, Strep-tagged recombinant, 1 mL	Bio-Rad	1610363
Rifampicin	Millipore Sigma	R3501-1G
SunBlaster LED Strip Light 48 Inch	SunBlaster	210000000906
Synergy 4 Microplate UV/Vis spectrometer	BioTEK	S4MLFPTA
Tetracycline	Thermo Scientific Chemicals	CAAAJ61714-14
TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 12%	Bio-Rad	1610185
Thiamine	TCI America	T0181-100G
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-500
Tryptone	BioBasic	TG217(G211)
Vitamin B12 (cyanocobalamin)	Enzo Life Sciences	89151-436
Yeast Extract	BioBasic	G0961
ZnSO4·7H2O	JT Baker	4382-01