Agrobacterium tumefaciens-опосредованная генная инженерия зеленых микроводорослей, Chlorella vulgaris

Резюме

В этом протоколе описывается использование Agrobacterium tumefaciens-опосредованной трансформации (АМТ) для интеграции интересующего гена (генов) в ядерный геном зеленой микроводоросли Chlorella vulgaris, что приводит к производству стабильных трансформентов.

Аннотация

Agrobacterium tumefaciens-опосредованная трансформация (AMT) служит широко используемым инструментом для манипулирования геномами растений. Тем не менее, A. tumefaciens демонстрируют способность к переносу генов к разнообразным видам. У многих видов микроводорослей отсутствуют хорошо зарекомендовавшие себя методы надежной интеграции интересующих генов в их ядерный геном. Чтобы использовать потенциальные преимущества биотехнологии микроводорослей, решающее значение имеют простые и эффективные инструменты манипулирования геномом. В данной работе представлен оптимизированный протокол АМТ для промышленного вида микроводорослей Chlorella vulgaris, использующий репортерный зеленый флуоресцентный белок (mGFP5) и маркер устойчивости к антибиотикам для гигромицина В. Мутанты отбираются путем нанесения покрытия на трис-ацетат-фосфатную (TAP) среду, содержащую гигромицин В и цефотаксим. Экспрессия mGFP5 количественно оценивается с помощью флуоресценции после более чем десяти поколений субкультивирования, что указывает на стабильную трансформацию кассеты Т-ДНК. Этот протокол позволяет надежно генерировать несколько трансгенных колоний C. vulgaris менее чем за две недели, используя коммерчески доступный вектор экспрессии растений pCAMBIA1302.

Введение

Agrobacterium tumefaciens, грамотрицательная почвенная бактерия, обладает уникальной способностью к переносу генов между царствами, благодаря чему ее называют «природным генным инженером»¹. Эта бактерия может переносить ДНК (Т-ДНК) от опухолеобразующей плазмиды (Ti-плазмида) в клетки хозяина через систему секреции IV типа, что приводит к интеграции и экспрессии Т-ДНК в геноме хозяина 1,2,3,4. В естественных условиях этот процесс приводит к образованию опухолей у растений, широко известной как болезнь корончатого галла. Тем не менее, Agrobacterium также может переносить Т-ДНК в различные другие организмы, включая дрожжи, грибы, водоросли, эмбрионы морских ежей и даже клетки человека в лабораторных условиях 5,6,7,8.

Используя эту природную систему, Agrobacterium tumefaciens-опосредованная трансформация (АМТ) обеспечивает случайную интеграцию интересующего гена (генов) в ядерный геном клетки-хозяина путем модификации участка Т-ДНК Ti-плазмиды. Для этой цели широко используется вектор экспрессии растений AMT pCAMBIA1302⁹. Исследователи могут использовать простые рабочие процессы клонирования E. coli перед переносом нужного вектора в A. tumefaciens для последующей передачи интересующему их хозяину.

Зеленые микроводоросли – это эукариоты, которые имеют много общего с наземными растениями, но очень невосприимчивы к генетическим модификациям. Однако генетическая трансформация играет важнейшую роль как в фундаментальных, так и в биотехнологических исследованиях микроводорослей. У нескольких видов микроводорослей, в частности у Chlamydomonas reinhardtii, генетическая трансформация с помощью АМТ привела к успешному внедрению трансгенов, таких как интерлейкин-2 человека (hIL-2), рецептор-связывающий домен коронавируса 2 тяжелого острого респираторного синдрома (SARS-CoV-2 RBD) и два антимикробных пептида (АМП)^10,11,12,13. Среди них Chlorella vulgaris, менее привередливый и быстрорастущий вид зеленых водорослей, обладает значительным потенциалом для устойчивого производства углеводов, белков, нутрицевтиков, пигментов и других ценных соединений¹⁴. Однако отсутствие надежных инструментов для создания трансгенных штаммов C. vulgaris препятствует его коммерческому прогрессу. Поскольку существует лишь ограниченное число опубликованных работ, использующих АМТ у C. vulgaris¹⁵, и учитывая значительные различия между культивированием растений и микроводорослей, оптимизация протокола АМТ становится необходимой.

В этом исследовании ученые вставили зеленый флуоресцентный белок (mGFP5) после промотора 35S вируса мозаики цветной капусты (CamV) и добавили метку гистидина, чтобы использовать его в качестве репортерного гена для экспрессии белка. Трансформанты были отобраны с использованием гигромицина В, и после субкультивирования в течение более чем двадцати поколений трансформация оставалась стабильной. Плазмида pCAMBIA1302, используемая в этой работе, может быть легко адаптирована для содержания любого интересующего гена. Кроме того, представленный метод и материалы могут быть адаптированы для других видов зеленых водорослей с активным промотором CamV35S, поскольку этот промотор используется для селекции гигромицина.

протокол

Все среды и растворы должны быть автоклавированы перед использованием, если не указано иное. Все центрифужные пробирки, наконечники для пипеток и т. д. должны быть стерильными или автоклавными перед использованием. Для удобства рецепты сред, используемые в этом протоколе, перечислены в таблице 1.

1. Подготовка электрокомпетентных клеток A. tumefaciens

1. Посев Agrobacterium (AGL-1) в стерильную колбу-шейкер объемом 25 мл со средой LB (с добавлением рифампицина, 20 мг/л-1) из замороженного запаса глицерина и выращивание в течение ночи при ^28-30 °C и 150 об/мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Штамм агробактерий AGL-1 (см. Таблицу материалов) устойчив к рифампицину, ампициллину, левомицетину и стрептомицину и может быть получен от нескольких поставщиков.
2. На следующий день разбавляют культуру в 1 00 000 раз, добавляя 0,5 мкл ночной культуры к 50 мл автоклавной сверхчистой воды и распределяют 10 мкл этой разбавленной культуры на планшете LB, а затем инкубируют при 28-30 °C в течение 1-3 дней.
3. Выберите колонию и начните ночную культуру по 20 мл в LB с рифампицином при 28-30 °C.
4. На следующий день инокулируют 500 мл LB среды (без антибиотика) в шейкерную колбу 9 мл ночной культуры и выращивают при 28-30 °C до тех пор, пока OD₆₀₀ не достигнет 0,5.
5. Равномерно разделите культуру на десять центрифужных пробирок по 50 мл и охладите на льду в течение 30 минут. Предварительно охладите центрифугу до 4 °C.
6. Центрифугируйте пробирки при 4 °C и 4000 x g в течение 15 минут. Затем удалите как можно больше надосадочной жидкости с помощью пипетки и повторно суспендируйте гранулу в каждой пробирке в 50 мл ледяной воды.
7. Центрифугируют клетки при 4 °C и 4000 x g в течение 15 мин. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 25 мл ледяной воды в каждой пробирке.
8. Центрифугируют клетки при 4 °C и 4000 x g в течение 15 мин. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 1 мл ледяного 10% (w/v) глицерина в каждой пробирке.
9. Объедините все пробирки в одну пробирку объемом 50 мл и центрифугируйте клетки при 4 °C и 4000 x g в течение 15 минут. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 400 мкл ледяного 10% (по массе) глицерина. Концентрация клеток должна быть около 1-3 x 10,¹⁰ клеток/мл.
10. Распределите клетки в виде аликвот по 50 мкл в стерильных предварительно охлажденных микропробирках. Заморозьте в жидком азоте и храните в морозильной камере при температуре -80 °C.

2. Электропорация A. tumefaciens

1. Добавьте 50 мкл электрокомпетентных клеток AGL-1 A. tumefaciens в предварительно охлажденную кювету диаметром 0,1 мм и добавьте 2 мкл pCAMBIA1302 или аналогичной плазмиды (conc 15 нг/мкл) (см. таблицу материалов).
2. Электропорация при напряжении 2400 В с помощью электропоратора (200 Ω, расширитель емкости 250 мкFD, емкость 25 мкFD, экспоненциальный спад, см. таблицу материалов). Постоянная времени должна быть >4,5 мс для успешной электропорации с экспоненциальным затуханием.
3. Немедленно добавьте 1 мл среды LB в кювету и осторожно пипеткой вверх и вниз для смешивания. Переложите 1 мл ресуспендированных клеток в микропробирку объемом 1,5 мл и инкубируйте ее при 28-30 °C не менее 1 ч для восстановления.
4. Поместите клетки на агар LB, содержащий соответствующий антибиотик (например, 50 мг/л канамицина для pCAMBIA1302 для выбора прокариот).
5. Выдерживают при температуре 28-30 °С в течение 2-3 дней.
6. Выберите одну колонию, вырастите в течение ночи в LB с соответствующим отбором (50 мг/л канамицина для pCAMBIA1302) и криоконсервируйте плазмидный штамм, используя 50% глицерин при -80 °C, для дальнейшего использования.

3. АМТ C. vulgaris

ПРИМЕЧАНИЕ: Параллельно подготавливайте культуры C. vulgaris (UTEX 395, см. Таблицу материалов) и A. tumefaciens для совместного культивирования. Посевы C. vulgariследует начинать за 3 дня до подготовки культур A. tumefaciens. Протокол был изменен на основе протокола, опубликованного Kumar et ^al.7.

1. Подготовьте культуру C. vulgaris
   1. C. vulgaris традиционно хранят на наклонных участках или в логарифмических культурах в освещенных условиях. Из логарифмической фазовой культуры при OD₆₀₀ = 1,0 распределить 0,5 мл на агаровые пластины с трис-ацетат-фосфатом (TAP, см. таблицу 1) (1,2% w/v агара A) и выращивать в течение 5 дней при 25 °C при освещении (50 мкЭ/^м2с). В результате получится примерно 5 x 10⁶ клеток.
2. Подготовьте культуру A. tumefaciens
   1. Штамм A. tumefaciens AGL-1 pCAMBIA1302 выращивают в колбе-шейкере путем посева 10 мл среды LB с добавлением 15 мМ глюкозы, 20 мг/л рифампицина и 50 мг/л канамицина (см. таблицу материалов) с использованием глицеринового сырья. Выдерживают при температуре 28-30 °C и 250 об/мин в течение ночи.
   2. Инокулируют 1 мл ночной культуры в 50 мл LB с 15 мМ глюкозы, 20 мг/л рифампицина и 50 мг/л канамицина и инкубируют при 28-30 °C и 250 об/мин до тех пор, пока OD₆₀₀ не достигнет 1,0.
3. Совместное культивирование C. vulgaris и A. tumefaciens
   1. Чтобы подготовить культуру A. tumefaciens к совместному культивированию, переложите выращенную культуру в пробирку объемом 50 мл и центрифугируйте при 4000 x g в течение 30 мин при комнатной температуре. Удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки и дважды промойте клетки индукционной средой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве индукционной среды используется среда TAP, рассчитанная на pH 5,5 и дополненная микроэлементами F/2 и витаминами с ацетосирингоном 200 мкМ (AS, см. Таблицу материалов). Ресуспендируйте ячейки в индукционной среде так, чтобы наружный диаметр₆₀₀ = 0,5.
   2. Чтобы подготовить культуру C. vulgaris к совместному культивированию, добавьте 25 мл индукционной среды в планшет C. vulgaris, содержащий ~ 5 x 10⁶ клеток. Перелейте в пробирку объемом 50 мл. Центрифугируют клетки при концентрации 4000 x g в течение 15 мин при комнатной температуре и выбрасывают надосадочную жидкость.
   3. Смешайте гранулы клеток водорослей с 200 мкл бактериальной суспензии (OD₆₀₀: 0,5) и инкубируйте их во вращающемся шейкере при 21-25 °C при 150 об/мин в течение 1 ч.
   4. Смешанную культуру (200 мкл) распределить по индукционным планшетам с добавлением 15 мМ глюкозы и инкубировать при 21-25 °C в темноте в течение 3 дней.
   5. Через 3 дня используют 10 мл TAP-среды с добавлением 400 мг/л цефотаксима или 20 мг/л тетрациклина (см. таблицу материалов) для сбора микроводорослей и инкубации в темноте при 21-25 °C в течение 2 дней для удаления A. tumefaciens из культуры.
   6. Распределите 500 мкл культуры на селективную среду, например, TAP-среду, дополненную 20-70 мг/л гигромицина B (при использовании pCAMBIA1302) и 400 мг/^л-1 цефотаксима или 20 мг/л тетрациклина. Выдерживают при температуре 21-25 °C в темноте в течение 2 дней, прежде чем поместить их в освещенную камеру.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Резистентные колонии появляются через 5-7 дней после воздействия света.
   7. Выберите отдельные колонии из трансформационной пластины и повторно нанесите их на планшеты с агаром TAP, добавив 400 мг/л цефотаксима или 20 мг/л тетрациклина и 20-70 мг/л гигромицина В.

4. ПЦР колоний (цПЦР) для подтверждения интеграции генов в трансформантах C. vulgaris

1. Извлечение геномной ДНК из трансформанта C. vulgaris после не менее двух субкультивирования из одной колонии с помощью набора для экстракции геномной ДНК растений (см. таблицу материалов). Используя его в качестве шаблона для ПЦР, разработайте праймеры для участка Т-ДНК mgfp5 (mgfp5-Fwd: 5' CCCATCTCATAAATAACGTC 3' и M13-Rev: 5' CAGGAAACAGCTATGAC 3').
   1. Используя высокоточный набор мастер-смеси ДНК-полимеразы Q5 (см. таблицу материалов), проведите полимеразную цепную реакцию (ПЦР) для проверки интеграции трансгенов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для настоящего исследования использовались следующие условия: 98 °C в течение 3 мин; 35 циклов (98 °C в течение 10 с, 57 °C в течение 30 с, 72 °C в течение 1 мин); 72 °C в течение 5 мин. Используйте pCAMBIA1302 в качестве положительного контроля и геномную ДНК C. vulgaris дикого типа в качестве отрицательного контроля.
2. Чтобы подтвердить, что pCAMBIA1302 отсутствует в образце из-за остаточной контаминации A. tumefaciens, используют ПЦР колонии. Добавьте небольшое количество клеток-трансформантов в 10 мкл стерильной воды и кипятите при 98 °C в течение 15 мин. Используйте это в качестве шаблона для ПЦР.
   1. Проектируйте праймеры для области вне Т-ДНК на pCAMBIA1302 (B1-Fwd: 5'AGTAAAGGAGAAGAACTTTTC 3' и B1-Rev: 5'CCTGATGCGGTATTTTCTC 3').
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для настоящего исследования использовались следующие условия: 94 °C в течение 3 мин; 30 циклов (94 °C в течение 30 с, 48 °C в течение 30 с, 68 °C в течение 5 мин); 68 °C в течение 7 мин. В качестве положительного контроля используют кипяченую колонию A. tumefaciens AGL-1 (pCAMBIA1302), а в качестве отрицательного контроля — вареную колонию C. vulgaris дикого типа.
3. Чтобы убедиться в отсутствии контаминации A. tumerfaciens в образце, используйте ПЦР колонии. Добавьте небольшое количество клеток-трансформантов в 10 мкл стерильной воды и кипятите при 98 °C в течение 15 мин. Используйте это в качестве шаблона для ПЦР.
   1. Разработка праймеров для гена virE2, содержащегося в плазмиде вирулентности AGL-1 (virE2-Fwd: 5' AGGGAGCCCTACCCG 3' и virE2-Rev: 5' GAACCAGCCTGGAGTTCG 3').
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для настоящего исследования использовались следующие условия: 94 °C в течение 3 мин; 30 циклов (94 °C в течение 30 с, 53 °C в течение 30 с, 68 °C в течение 3 мин); 68 °C в течение 7 мин. В качестве положительного контроля используют кипяченую колонию A. tumefaciens AGL-1 (pCAMBIA1302), а в качестве отрицательного контроля — вареную колонию C. vulgaris дикого типа.
4. Для подтверждения размера полученных фрагментов¹⁶ проводят ПЦР-образцы на агарозном геле ДНК вместе с лестницей (лестница ДНК 1 Кбит/с, см. таблицу материалов).

5. Измерение флуоресценции трансформаторов

1. Засейте каждый трансформант из культуры поддержания логарифмической фазы или наклона агара TAP в 50 мл TAP с добавлением 200 мг^/л цефотаксима и 25 мг/^л гигромицина B так, чтобы начальный OD₆₀₀ = 0,1. Инокуляцию одной культуры C. vulgaris дикого типа и цефотаксима только 200 мг^{/л в} качестве отрицательного контроля. Инкубируют при 25 °C при 150 об/мин при 150 мкмоль/^м2с фотосинтетически активного света (см. Таблицу материалов).
2. Каждые 24 ч берут 300 мкл образца и измеряют поглощение и флуоресценцию (возбуждение 488 нм, излучение 526 нм) в 96-луночном планшетном ридере или УФ/ВИД спектрометре и флуориметре (см. таблицу материалов). Используйте черную пластину с прозрачным дном для одновременных измерений.

6. Экстракция сырого белка, очистка белка и электрофорез SDS-PAGE

1. Инокулировать трансформант (#50) из логарифмической поддерживающей культуры в 300 мл TAP с добавлением 200 мг^/л цефотаксима и 25 мг/^л гигромицина B до достижения OD₆₈₀ = 0,1. Инокуляцию одной культуры C. vulgaris дикого типа и цефотаксима только 200 мг^{/л в} качестве отрицательного контроля. Инкубировать при 25 °C при 150 об/мин при 150 мкмоль/^м2с фотосинтетически активного света.
2. Экстрагируют образец сырого белка из трансформанта (#50) и штаммов дикого типа с помощью 5 мл лизисного буфера (см. таблицу 1) с последующей ультразвуковой обработкой в течение 4 мин.
3. Очистите образец сырого белка смолой Ni-NTA через полипропиленовые колонки объемом 5 мл (см. таблицу материалов).
4. Лиофилизировать 15 мл очищенных образцов белка и повторно суспендировать их в 1 мл лизисного буфера для анализа SDS-PAGE¹⁷.

Результаты

Чтобы продемонстрировать успешную трансформацию с использованием описанного выше метода, C. vulgaris культивировали либо с AGL-1, содержащим плазмиду pCAMBIA1302, либо без плазмиды (дикого типа и покрытой агаром TAP, дополненным гигромицином В и цефотаксимом (рис. 1A). Крайняя лев...

Обсуждение

Эффективность трансформации связана с несколькими различными параметрами. Выбор штаммов A. tumefaciens , используемых для АМТ, имеет решающее значение. AGL-1 является одним из наиболее инвазивных обнаруженных штаммов и по этой причине регулярно используется в АМТ растений. Добавление в и?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 Kb Plus DNA ladder	FroggaBio	DM015
Acetosyringone	Fisher Scientific	D26665G
Agrobacterium tumefaciens	Gold Biotechnologies	Strain: AGL-1; Gift from Prof. Paul Hooykaas	Genotype: C58 RecA (RifR/CarbR) pTiBo542DT-DNA
Biotin	Enzo Life Sciences	89151-400
CaCl2·2H2O	VWR	BDH9224-1KG
Cefotaxime	AK Scientific	J90010
Chlorella vulgaris	University of Texas at Austin Culture Collection of Algae	Strain: UTEX 395	Wildtype strain
CoCl2·6H2O	Sigma Aldrich	C8661-25G
CuSO4·5H2O	EMD Millipore	CX2185-1
FeCl3·6H2O	VWR	BDH9234-500G
Gene Pulser Xcell Electroporator	Bio-Rad	1652662	Main unit equipped with PC module.
GeneJET Plant Genome Purification Kit	Thermo Scientific	K0791
Glacial acetic acid	VWR	CABDH3093-2.2P
Glycerol	BioBasic	GB0232
HEPES Buffer	Sigma Aldrich	H-3375
Hygromycin B	Fisher Scientific	AAJ6068103
K2HPO4	VWR	BDH9266-500G
Kanamycin	Gold Biotechnologies	K-250-25
KH2PO4	VWR	BDH9268-500G
MgSO4·7H2O	VWR	97062-134
MnCl2·4H2O	JT Baker	BAKR2540-01
Na2CO3	VWR	BDH7971-1
Na2EDTA·2H2O	JT Baker	8993-01
Na2MoO4·2H2O	JT Baker	BAKR3764-01
NaCl	VWR	BDH7257-7
NaH2PO4 H2O	Millipore Sigma	CA80058-650
NaNO3	VWR	BDH4574-500G
NEBExpress Ni Resin	NewEngland BioLabs	NEB #S1427
NH4Cl	VWR	BDH9208-500G
pCAMBIA1302	Leiden University	Gift from Prof. Paul Hooykaas	pBR322, KanR, pVS1, T-DNA(CaMV 35S/HygR/CaMV polyA, CaMV 35S promoter/mgpf5-6xhis/NOS terminator)
Polypropylene Columns (5 mL)	QIAGEN	34964
Precision Plus Protein Unstained Protein Standards, Strep-tagged recombinant, 1 mL	Bio-Rad	1610363
Rifampicin	Millipore Sigma	R3501-1G
SunBlaster LED Strip Light 48 Inch	SunBlaster	210000000906
Synergy 4 Microplate UV/Vis spectrometer	BioTEK	S4MLFPTA
Tetracycline	Thermo Scientific Chemicals	CAAAJ61714-14
TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 12%	Bio-Rad	1610185
Thiamine	TCI America	T0181-100G
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-500
Tryptone	BioBasic	TG217(G211)
Vitamin B12 (cyanocobalamin)	Enzo Life Sciences	89151-436
Yeast Extract	BioBasic	G0961
ZnSO4·7H2O	JT Baker	4382-01