Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מתאר את השימוש בטרנספורמציה בתיווך גידולים אגרובקטריום (AMT) לשילוב גנים בעלי עניין בגנום הגרעיני של המיקרו-אצות הירוקות Chlorella vulgaris, מה שמוביל לייצור טרנספורמנטים יציבים.

Abstract

Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation (AMT) משמש ככלי נפוץ למניפולציה של גנומים צמחיים. עם זאת, A. tumefaciens מפגינים יכולת העברת גנים למגוון רחב של מינים. למיני מיקרו-אצות רבים חסרות שיטות מבוססות היטב לשילוב אמין של גנים מעניינים בגנום הגרעיני שלהם. כדי לרתום את היתרונות הפוטנציאליים של ביוטכנולוגיה מיקרו-אצות, כלים פשוטים ויעילים למניפולציה גנומית הם חיוניים. כאן, פרוטוקול AMT ממוטב מוצג עבור מיני מיקרו-אצות תעשייתיות Chlorella vulgaris, תוך שימוש בחלבון הפלואורסצנטי הירוק (mGFP5) ובסמן העמידות לאנטיביוטיקה עבור Hygromycin B. מוטנטים נבחרים באמצעות ציפוי על מדיה Tris-אצטט-פוספט (TAP) המכילה Hygromycin B ו cefotaxime. ביטוי של mGFP5 מכומת באמצעות פלואורסצנטיות לאחר יותר מעשרה דורות של תת-תרבית, מה שמצביע על השינוי היציב של קלטת T-DNA. פרוטוקול זה מאפשר ייצור אמין של מושבות C. vulgaris טרנסגניות מרובות תוך פחות משבועיים, תוך שימוש בווקטור ביטוי הצמחים pCAMBIA1302 הזמין מסחרית.

Introduction

Agrobacterium tumefaciens, חיידק גראם-שלילי הנישא בקרקע, הוא בעל יכולת העברת גנים בין-מלכותית ייחודית, מה שזיכה אותו בתואר "מהנדס גנטי טבעי"1. חיידק זה יכול להעביר DNA (T-DNA) מפלסמיד הגורם לגידול (Ti-Plasmid) לתאים מארחים באמצעות מערכת הפרשת סוג IV, וכתוצאה מכך אינטגרציה וביטוי של T-DNA בתוך הגנום המארח 1,2,3,4. בסביבה הטבעית, תהליך זה מוביל להיווצרות גידולים בצמחים, הידוע בכינויו מחלת כיס המרה. עם זאת, אגרובקטריום יכול גם להעביר T-DNA לאורגניזמים שונים אחרים, כולל שמרים, פטריות, אצות, עוברים של קיפודי ים, ואפילו תאים אנושיים בתנאי מעבדה 5,6,7,8.

תוך ניצול מערכת טבעית זו, Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation (AMT) מאפשר שילוב אקראי של גנים מעניינים לתוך הגנום הגרעיני של התא המארח על ידי שינוי אזור T-DNA של Ti-plasmid. למטרה זו, וקטור ביטוי צמח AMT בשימוש נרחב הוא pCAMBIA13029. חוקרים יכולים להשתמש בתהליכי שיבוט פשוטים ב- E. coli לפני העברת הווקטור הרצוי ל- A. tumefaciens לצורך העברה לאחר מכן למארח העניין.

מיקרו-אצות ירוקות הן איקריוטים שחולקים קווי דמיון רבים עם צמחי יבשה, אך הם עקשנים מאוד לשינוי גנטי. עם זאת, טרנספורמציה גנטית ממלאת תפקיד מכריע במחקר בסיסי וביוטכנולוגי של מיקרו-אצות. בכמה מיני מיקרו-אצות, במיוחד Chlamydomonas reinhardtii, טרנספורמציה גנטית באמצעות AMT החדירה בהצלחה טרנסגנים כגון אינטרלוקין-2 אנושי (hIL-2), תחום קשירת קולטן קורונה 2 (SARS-CoV-2 RBD), ושני פפטידים אנטי-מיקרוביאליים (AMPs)10,11,12,13. בין אלה, Chlorella vulgaris, מין אצות ירוקות פחות קפדני וגדל במהירות, טומן בחובו פוטנציאל משמעותי לייצור בר-קיימא של פחמימות, חלבונים, חומרים מזינים, פיגמנטים ותרכובות אחרות בעלות ערך גבוה14. עם זאת, היעדר כלים אמינים ליצירת זנים טרנסגניים של C. vulgaris מעכב את התקדמותה המסחרית. מאחר שפורסמו רק מספר מוגבל של עבודות המשתמשות ב-AMT ב-C. vulgaris15, ובהתחשב בהבדלים הניכרים בין גידול צמחים למיקרו-אצות, אופטימיזציה של פרוטוקול AMT הופכת חיונית.

במחקר זה, החוקרים הכניסו חלבון פלואורסצנטי ירוק (mGFP5) במורד הזרם של מקדם וירוס פסיפס הכרובית (CamV) 35S והוסיפו תג היסטידין כדי להשתמש בו כגן כתב לביטוי חלבונים. טרנספורמטורים נבחרו באמצעות היגרומיצין B, ולאחר תרבית משנה במשך למעלה מעשרים דורות, השינוי נשאר יציב. פלסמיד pCAMBIA1302 המשמש בעבודה זו יכול להיות מותאם בקלות להכיל כל גן מעניין. יתר על כן, ניתן להתאים את השיטה והחומרים המוצגים למיני אצות ירוקות אחרות עם מקדם CamV35S פעיל, מכיוון שמקדם זה משמש לבחירת היגרומיצין.

Protocol

כל המדיה והפתרונות חייבים להיות אוטומטיים לפני השימוש, אלא אם צוין אחרת. כל צינורות הצנטריפוגות, קצוות פיפטה וכו ', צריכים להיות סטריליים או autoclaved לפני השימוש. לעיון קל, מתכוני המדיה המשמשים בפרוטוקול זה מפורטים בטבלה 1.

1. הכנת תאים אלקטרוכשירים של A. tumefaciens

  1. יש לחסן את אגרובקטריום (AGL-1) לתוך בקבוק שייקר סטרילי בנפח 25 מ"ל של חומר LB (בתוספת ריפמפיצין, 20 מ"ג/L-1) ממלאי גליצרול קפוא ולגדול בן לילה ב-28-30 מעלות צלזיוס וב-150 סל"ד.
    הערה: זן אגרובקטריום AGL-1 עמיד (ראה טבלת חומרים) בפני ריפמפיצין, אמפיצילין, כלוראמפניקול וסטרפטומיצין וניתן להשיג אותו ממספר ספקים.
  2. למחרת, לדלל את התרבית פי 1,00,000 על ידי הוספת 0.5 μL של תרבית הלילה ל 50 מ"ל מים טהורים במיוחד autoclaved ולהפיץ 10 μL של תרבית מדוללת זו על צלחת LB, ולאחר מכן לדגור ב 28-30 ° C במשך 1-3 ימים.
  3. בחר מושבה והתחל תרבית לילה של 20 מ"ל ב- LB עם ריפמפיצין ב 28-30 מעלות צלזיוס.
  4. למחרת, לחסן 500 מ"ל LB מדיה (ללא אנטיביוטיקה) בבקבוק שייקר עם 9 מ"ל של תרבית לילה ולגדול ב 28-30 ° C עד OD600 מגיע 0.5.
  5. מחלקים את התרבית באופן שווה לעשרה צינורות צנטריפוגות 50 מ"ל וצוננים על קרח במשך 30 דקות. מצננים מראש את הצנטריפוגה ל-4°C.
  6. צנטריפוגה את הצינורות ב 4 ° C ו 4000 x גרם במשך 15 דקות. לאחר מכן, להסיר כמה supernatant ככל האפשר באמצעות פיפטה להשעות מחדש את הגלולה בכל צינור ב 50 מ"ל של מים קרים כקרח.
  7. צנטריפוגה את התאים ב 4 ° C ו 4000 x גרם במשך 15 דקות. הסר את supernatant ו resuspend את הגלולה ב 25 מ"ל של מים קרים כקרח בכל צינור.
  8. צנטריפוגה את התאים ב 4 ° C ו 4000 x גרם במשך 15 דקות. הסר את supernatant ו resuspend את הגלולה ב 1 מ"ל של קר כקרח 10% (w/v) גליצרול בכל צינור.
  9. שלב את כל הצינורות לתוך צינור אחד 50 מ"ל וצנטריפוגה את התאים ב 4 ° C ו 4000 x g במשך 15 דקות. הסר את supernatant ו resuspend את הגלולה ב 400 μL קר כקרח 10% (w/v) גליצרול. ריכוז התא צריך להיות בערך 1-3 x10 10 תאים / מ"ל.
  10. להפיץ את התאים כמו 50 μL aliquots ב microtubes precooled סטרילי. יש להקפיא בחנקן נוזלי ולאחסן במקפיא בטמפרטורה של -80°C.

2. אלקטרופורציה של A. tumefaciens

  1. הוסף 50 μL של תאים אלקטרוכשירים AGL-1 A. tumefaciens לקובט 0.1 מ"מ מקורר מראש והוסף 2 μL של pCAMBIA1302 או פלסמיד דומה (conc 15 ng/μL) (ראה טבלת חומרים).
  2. אלקטרופורטים ב 2400 V באמצעות אלקטרופורטור (200 Ω, מאריך קיבוליות 250 μFD, קיבוליות 25 μFD, דעיכה מעריכית, ראה טבלת חומרים). קבוע הזמן צריך להיות >4.5 אלפיות השנייה עבור אלקטרופורציה מוצלחת עם דעיכה מעריכית.
  3. מיד להוסיף 1 מ"ל של מדיה LB לקובט ופיפטה בעדינות למעלה ולמטה כדי לערבב. להעביר את 1 מ"ל של תאים מרחפים לתוך microtube 1.5 מ"ל לדגור אותו ב 28-30 ° C לפחות 1 שעה כדי להתאושש.
  4. צלחת את התאים על אגר LB המכיל את האנטיביוטיקה המתאימה (כלומר, 50 מ"ג / ליטר של kanamycin עבור pCAMBIA1302 עבור בחירה פרוקריוטית).
  5. לדגור ב 28-30 מעלות צלזיוס במשך 2-3 ימים.
  6. בחר מושבה אחת, גדל לילה ב- LB עם הבחירה המתאימה (50 מ"ג / ליטר קנמיצין עבור pCAMBIA1302), ושמור בהקפאה את הזן המכיל פלסמיד באמצעות 50% גליצרול ב -80 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי.

3. AMT של C. vulgaris

הערה: הכינו תרביות C. vulgaris (UTEX 395, ראו טבלת חומרים) ו-A. tumefaciens במקביל לטיפוח משותף. C. vulgaris cultures יש להתחיל 3 ימים לפני הכנת תרביות A. tumefaciens. הפרוטוקול שונה בהתבסס על זה שפורסם על ידי Kumar et al.7.

  1. הכנת תרבות C. vulgaris
    1. C. vulgaris מאוחסן באופן מסורתי על סלנטים או נשמר בתרביות לוג-פאזה בתנאים מוארים. מתרבית שלב יומן ב- OD600 = 1.0, יש למרוח 0.5 מ"ל על לוחות אגר Tris-אצטט-פוספט (TAP, ראה טבלה 1) ( 1.2% w / v אגר A) ולגדול במשך 5 ימים ב 25 ° C עם תאורה (50 μE / m2שניות). זה יניב בערך 5 x 106 תאים.
  2. הכנת תרבית A. tumefaciens
    1. יש לגדל את זן A. tumefaciens AGL-1 pCAMBIA1302 בבקבוק שייקר על ידי חיסון 10 מ"ל של חומר LB בתוספת גלוקוז של 15 mM, 20 mg/L rifampicin ו-50 mg/L kanamycin (ראה טבלת חומרים) באמצעות מלאי גליצרול. יש לדגור ב-28-30 מעלות צלזיוס וב-250 סל"ד למשך הלילה.
    2. יש לחסן 1 מ"ל של תרבית לילה לתוך 50 מ"ל של LB עם 15 מ"מ גלוקוז, 20 מ"ג / ליטר ריפמפיצין, ו 50 מ"ג / ליטר קנמיצין ולדגור ב 28-30 ° C ו 250 סל"ד עד OD600 מגיע 1.0.
  3. Coלטפח C. vulgaris ו A. tumefaciens
    1. כדי להכין את תרבית A. tumefaciens לגידול משותף, להעביר את התרבות הגדלה לצינור 50 מ"ל וצנטריפוגה ב 4000 x גרם במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. מוציאים את הסופרנאטנט בעזרת פיפטה ושוטפים את התאים פעמיים עם מדיום האינדוקציה.
      הערה: מדיית האינדוקציה המשמשת היא מדיית TAP המותאמת ל- pH 5.5 ומשלימה מתכות קורט בינוניות F/2 וויטמינים עם אצטוסירינגון של 200 מיקרומטר (AS, ראה טבלת חומרים). השעה מחדש את התאים במדיית אינדוקציה כך ש- OD600 = 0.5.
    2. כדי להכין את תרבית C. vulgaris לגידול משותף, הוסף 25 מ"ל של מדיה אינדוקציה לצלחת C. vulgaris המכילה ~ 5 x 106 תאים. מעבירים לצינור 50 מ"ל. צנטריפוגו את התאים ב 4000 x גרם במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר ולהשליך את supernatant.
    3. מערבבים את גלולת תא האצות עם 200 μL של תרחיף החיידקים (OD600: 0.5) ודגרים אותם בשייקר סיבובי ב 21-25 ° C ב 150 סל"ד במשך 1 שעה.
    4. יש לפזר את התרבית המעורבת (200 μL) על צלחות מדיה אינדוקציה בתוספת גלוקוז של 15 מ"מ ולדגור בטמפרטורה של 21-25 מעלות צלזיוס בחושך למשך 3 ימים.
    5. לאחר 3 ימים, יש להשתמש ב-10 מ"ל של מדיית TAP בתוספת 400 מ"ג/ליטר cefotaxime או 20 מ"ג/ליטר טטרציקלין (ראה טבלת חומרים) כדי לאסוף את המיקרו-אצות ולדגור בחושך בטמפרטורה של 21-25 מעלות צלזיוס למשך יומיים כדי לסלק את A. tumefaciens מהתרבית.
    6. צלחת 500 μL של התרבית על מדיה סלקטיבית, למשל, מדיה TAP בתוספת 20-70 מ"ג / ליטר של Hygromycin B (בעת שימוש pCAMBIA1302) ו 400 מ"ג / L-1 cefotaxime או 20 מ"ג / ליטר של טטרציקלין. לדגור 21-25 מעלות צלזיוס בחושך במשך 2 ימים לפני הצבתם בתא מואר.
      הערה: מושבות עמידות יופיעו 5-7 ימים לאחר החשיפה לאור.
    7. בחר מושבות בודדות מצלחת הטרנספורמציה ופזר אותן מחדש על צלחות אגר TAP בתוספת 400 מ"ג / ליטר של cefotaxime או 20 מ"ג / ליטר של טטרציקלין ו 20-70 מ"ג / ליטר של היגרומיצין B.

4. PCR מושבה (cPCR) כדי לאשר שילוב גנים טרנספורמנטים C. vulgaris

  1. חילוץ DNA גנומי מטרנספורמנט C. vulgaris לאחר תרבית משנה לפחות פעמיים ממושבה אחת באמצעות ערכת מיצוי DNA גנומי של צמחים (ראה טבלת חומרים). באמצעות זה כתבנית עבור PCR, לעצב פריימרים עבור אזור mgfp5 של T-DNA (mgfp5-Fwd: 5' CCCATCTCATAAATAACGTC 3', ו M13-Rev: 5' CAGGAAACAGCTATGAC 3').
    1. באמצעות ערכת תערובת מאסטר Q5 של DNA פולימראז באיכות גבוהה (ראה טבלת חומרים), בצע תגובת שרשרת פולימראז (PCR) כדי לאמת אינטגרציה טרנסגנית.
      הערה: התנאים הבאים שימשו במחקר הנוכחי: 98 ° C למשך 3 דקות; 35 מחזורים (98°C למשך 10 שניות, 57°C למשך 30 שניות, 72°C למשך דקה אחת); 72°C למשך 5 דקות. השתמש ב- pCAMBIA1302 כבקרה חיובית וב- DNA גנומי מסוג פראי C. vulgaris כבקרה שלילית.
  2. כדי לאשר כי אין pCAMBIA1302 נוכח במדגם עקב זיהום שיורי על ידי A. tumefaciens, להשתמש PCR מושבה. הוסיפו כמות קטנה של תאי טרנספורמציה ל-10 מיקרוליטר מים סטריליים והרתיחו ב-98°C למשך 15 דקות. השתמש באפשרות זו כתבנית עבור PCR.
    1. עיצוב פריימרים לאזור מחוץ ל-T-DNA ב-pCAMBIA1302 (B1-Fwd: 5'AGTAAAGGAGAAGAACTTTTT 3' ו-B1-Rev: 5'CCTGATGCGGTATTTTTTC 3').
      הערה: התנאים הבאים שימשו במחקר הנוכחי: 94 ° C במשך 3 דקות; 30 מחזורים (94°C למשך 30 שניות, 48°C למשך 30 שניות, 68°C למשך 5 דקות); 68°C למשך 7 דקות. השתמש במושבה מבושלת של A. tumefaciens AGL-1 (pCAMBIA1302) כבקרה חיובית ומושבה מבושלת של בר מסוג C. vulgaris כבקרה שלילית.
  3. כדי לאשר כי אין זיהום A. tumerfaciens נוכח המדגם, להשתמש PCR מושבה. הוסיפו כמות קטנה של תאי טרנספורמציה ל-10 מיקרוליטר מים סטריליים והרתיחו ב-98°C למשך 15 דקות. השתמש באפשרות זו כתבנית עבור PCR.
    1. תכנון פריימרים לגן virE2 הכלול בפלסמיד האלים AGL-1 (virE2-Fwd: 5' AGGGAGCCCTACCCG 3' ו-virE2-Rev: 5' GAACCAGCCTGGAGTTCG 3').
      הערה: התנאים הבאים שימשו במחקר הנוכחי: 94 ° C במשך 3 דקות; 30 מחזורים (94°C למשך 30 שניות, 53°C למשך 30 שניות, 68°C למשך 3 דקות); 68°C למשך 7 דקות. השתמש במושבה מבושלת של A. tumefaciens AGL-1 (pCAMBIA1302) כבקרה חיובית ומושבה מבושלת של בר מסוג C. vulgaris כבקרה שלילית.
  4. הפעל דגימות PCR על ג'ל אגרוז DNA יחד עם סולם (סולם DNA 1 Kbp, ראה רשימת חומרים) כדי לאשר את גודל המקטעים המתקבלים16.

5. מדידת הפלואורסצנטיות של טרנספורמציות

  1. חסן כל טרנספורמטור מתרבית תחזוקה בשלב היומן או שיפוע אגר TAP ל- 50 מ"ל של TAP בתוספת 200 מ"ג / L-1 cefotaxime ו- 25 מ"ג / L-1 היגרומיצין B כך שה- ODההתחלתי 600 = 0.1. חסן תרבית אחת עם סוג פראי C. vulgaris ורק 200 מ"ג / L-1 cefotaxime כמו הביקורת השלילית. דגירה ב-25°C ב-150 סל"ד עם 150 μmol/m2שניות של אור פעיל פוטוסינתטי (ראו טבלת חומרים).
  2. כל 24 שעות, לקחת דגימה של 300 מיקרוליטר ולמדוד את הספיגה והפלואורסצנטיות (עירור 488 ננומטר, פליטה 526 ננומטר) בקורא לוחות 96 בארות או ספקטרומטר UV/Vis ופלואורומטר (ראה טבלת חומרים). השתמש בלוח שחור עם תחתית שקופה למדידות בו-זמנית.

6. מיצוי חלבון גולמי, טיהור חלבונים ואלקטרופורזה SDS-PAGE

  1. חסן טרנספורמנט (#50) מתרבית תחזוקה בשלב היומן לתוך 300 מ"ל של TAP בתוספת 200 מ"ג / L-1 cefotaxime ו 25 מ"ג / L-1 Hygromycin B כדי להגיע OD680 = 0.1. חסן תרבית אחת עם סוג פראי C. vulgaris ורק 200 מ"ג / L-1 cefotaxime כמו הביקורת השלילית. דגירה ב-25°C ב-150 סל"ד עם 150 μmol/m,2שניות של אור פעיל פוטוסינתטי.
  2. חלצו את דגימת החלבון הגולמי מזני הטרנספורמנט (#50) והפרא באמצעות חיץ ליזה של 5 מ"ל (ראו טבלה 1), ולאחר מכן סוניקציה למשך 4 דקות.
  3. יש לטהר דגימת חלבון גולמי עם שרף Ni-NTA דרך עמודי פוליפרופילן בנפח 5 מ"ל (ראו טבלת חומרים).
  4. Lyophilize דגימות חלבון מטוהר 15 מ"ל להשעות אותם מחדש 1 מ"ל חיץ ליזה עבור ניתוח SDS-PAGE17.

תוצאות

כדי להראות טרנספורמציה מוצלחת באמצעות השיטה לעיל, C. vulgaris עבר תרבית משותפת עם AGL-1 שהכיל את הפלסמיד pCAMBIA1302 או ללא הפלסמיד (מסוג פראי ומצופה על אגר TAP בתוספת Hygromycin B ו-cefotaxime (איור 1A). הלוח השמאלי ביותר מראה את המושבות שעברו טרנספורמציה המסוגלות לצמוח על לוחות היגרומיצין B/cefot...

Discussion

יעילות הטרנספורמציה קשורה למספר פרמטרים שונים. הבחירה בזני A. tumefaciens המשמשים ל- AMT היא קריטית. AGL-1 הוא אחד הזנים הפולשים ביותר שהתגלו, ומסיבה זו נעשה בו שימוש שגרתי ב-AMT צמחי. תוספת של גלוקוז (15-20 מילימול) חשובה גם היא ליעילות AMT. בהתחשב בכך ש-C. vulgaris יכול לגדול הן בתנאים פוטוטרופיים והן ...

Disclosures

לא הוכרז על ניגוד עניינים.

Acknowledgements

המחברים רוצים להודות לפרופ' פול הויקאס על שסיפק באדיבותו את וקטור pCAMBIA1302 ואת Agrobacterium tumefaciens AGL1 מהמכון לביולוגיה בליידן, אוניברסיטת ליידן, הולנד. המחברים רוצים גם להודות לאווה קוליק על עזרתה בגידול טרנספורמטורים פלואורסצנטיים. עבודה זו מומנה על ידי מועצת המחקר למדעי הטבע וההנדסה של קנדה ותוכנית Mitacs Accelerate.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1 Kb Plus DNA ladderFroggaBioDM015
AcetosyringoneFisher ScientificD26665G
Agrobacterium tumefaciensGold BiotechnologiesStrain: AGL-1; Gift from Prof. Paul HooykaasGenotype: C58 RecA (RifR/CarbR) pTiBo542DT-DNA
BiotinEnzo Life Sciences89151-400
CaCl2·2H2OVWRBDH9224-1KG
CefotaximeAK ScientificJ90010
Chlorella vulgarisUniversity of Texas at Austin Culture Collection of AlgaeStrain: UTEX 395Wildtype strain
CoCl2·6H2OSigma AldrichC8661-25G
CuSO4·5H2OEMD MilliporeCX2185-1
FeCl3·6H2OVWRBDH9234-500G
Gene Pulser Xcell ElectroporatorBio-Rad1652662Main unit equipped with PC module.
GeneJET Plant Genome Purification KitThermo ScientificK0791
Glacial acetic acidVWRCABDH3093-2.2P
GlycerolBioBasicGB0232
HEPES BufferSigma AldrichH-3375
Hygromycin BFisher ScientificAAJ6068103
K2HPO4VWRBDH9266-500G
KanamycinGold BiotechnologiesK-250-25
KH2PO4VWRBDH9268-500G
MgSO4·7H2OVWR97062-134
MnCl2·4H2OJT BakerBAKR2540-01
Na2CO3VWRBDH7971-1
Na2EDTA·2H2OJT Baker8993-01
Na2MoO4·2H2OJT BakerBAKR3764-01
NaClVWRBDH7257-7
NaH2PO4 H2OMillipore SigmaCA80058-650
NaNO3 VWRBDH4574-500G
NEBExpress Ni ResinNewEngland BioLabsNEB #S1427
NH4ClVWRBDH9208-500G
pCAMBIA1302Leiden UniversityGift from Prof. Paul HooykaaspBR322, KanR, pVS1, T-DNA(CaMV 35S/HygR/CaMV polyA, CaMV 35S promoter/mgpf5-6xhis/NOS terminator)
Polypropylene Columns (5 mL)QIAGEN34964
Precision Plus Protein Unstained Protein Standards, Strep-tagged recombinant, 1 mLBio-Rad1610363
RifampicinMillipore SigmaR3501-1G
SunBlaster LED Strip Light 48 Inch SunBlaster210000000906
Synergy 4 Microplate UV/Vis spectrometer BioTEKS4MLFPTA
TetracyclineThermo Scientific ChemicalsCAAAJ61714-14
TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 12%Bio-Rad1610185
ThiamineTCI AmericaT0181-100G
Tris BaseFisher ScientificBP152-500
TryptoneBioBasicTG217(G211)
Vitamin B12 (cyanocobalamin)Enzo Life Sciences89151-436
Yeast ExtractBioBasicG0961
ZnSO4·7H2OJT Baker4382-01

References

  1. Smith, E. F., Townsend, C. O. A plant tumor of bacterial origin. Science. 25 (643), 671-673 (1907).
  2. Chilton, M. D., et al. Stable incorporation of plasmid DNA into higher plant cells: The molecular basis of tumorigenesis. Cell. 11 (2), 263-271 (1977).
  3. De Cleene, M., De Ley, J. The host range of crown gall. The Botanical Review. 42, 389-466 (1976).
  4. Hooykaas, P. J., Schilperoort, R. A. Agrobacterium and plant genetic engineering. Plant Molecular Biology. 19, 15-38 (1992).
  5. Bundock, P., den Dulk-Ras, A., Beijersbergen, A., Hooykaas, P. J. J. Transkingdom T-DNA transfer from Agrobacterium tumefaciens to Saccharomyces cerevisiae. The European Molecular Biology Organization. 14 (13), 3206-3214 (1995).
  6. Piers, K. L., Heath, J. D., Liang, X., Stephens, K. M., Nester, E. W. Agrobacteriumtumefaciens-mediated transformation of yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (4), 1613-1618 (1996).
  7. Kumar, S. V., Misquitta, R. W., Reddy, V. S., Rao, B. J., Rajam, M. V. Genetic transformation of the green alga-Chlamydomonas reinhardtii by Agrobacteriumtumefaciens. Plant Science. 166 (3), 731-738 (2004).
  8. de Groot, M. J., Bundock, P., Hooykaas, P. J., Beijersbergen, A. G. Agrobacteriumtumefaciens-mediated transformation of filamentous fungi. Nature Biotechnology. 16 (9), 839-842 (1998).
  9. Hajdukiewicz, P., Svab, Z., Maliga, P. The small, versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors for plant transformation. Plant Molecular Biology. 25 (6), 989-994 (1994).
  10. Dehghani, J., Adibkia, K., Movafeghi, A., Pourseif, M. M., Omidi, Y. Designing a new generation of expression toolkits for engineering of green microalgae; robust production of human interleukin-2. BioImpacts. 10 (4), 259-268 (2020).
  11. Berndt, A. J., Smalley, T. N., Ren, B., Simkovsky, R., Badary, A., Sproles, A. E., Fields, F. J., Torres-Tiji, Y., Heredia, V., Mayfield, S. P. Recombinant production of a functional SARS-CoV-2 spike receptor binding domain in the green algae Chlamydomonas reinhardtii. PLoS One. 16, 0257089 (2021).
  12. Li, A., Huang, R., Wang, C., Hu, Q., Li, H., Li, X. Expression of anti-lipopolysaccharide factor isoform 3 in Chlamydomonas reinhardtii showing high antimicrobial activity. Marine Drugs. 19 (5), 239 (2021).
  13. Xue, B., Dong, C. M., Hu, H. H., Dong, B., Fan, Z. C. Chlamydomonas reinhardtii-expressed multimer of ToAMP4 inhibits the growth of bacteria of both Gram-positive and Gram-negative. Process Biochemistry. 91, 311-318 (2020).
  14. Khan, M. I., Shin, J. H., Kim, J. D. The promising future of microalgae: current status, challenges, and optimization of a sustainable and renewable industry for biofuels, feed, and other products. Microbial Cell Factories. 17, 36 (2018).
  15. Cha, T. S., Yee, W., Aziz, A. Assessment of factors affecting Agrobacterium-mediated genetic transformation of the unicellular green alga, Chlorella vulgaris. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 28, 1771-1779 (2012).
  16. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. (62), e3923 (2012).
  17. Bio-Rad Laboratories Inc. A Guide to Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Detection. Bulletin 6040, Rev C. Bio-Rad Laboratories Inc. Accessed. , (2023).
  18. NEBExpress Ni Resin Gravity Flow Typical Protocol. New England Biolabs Inc Available from: https://international.neb.com/protocols/2019/09/10/nebexpress-ni-resin-gravity-flow-typical-protocol (2023)
  19. Ward, V. C. A., Rehmann, L. Fast media optimization for mixotrophic cultivation of Chlorella vulgaris. Scientific Reports. 9, 19262 (2019).
  20. Morton, E. R., Fuqua, C. Laboratory maintenance of Agrobacterium. Current Protocols in Microbiology. , (2012).
  21. Haddadi, F., Abd Aziz, M., Abdullah, S. N., Tan, S. G., Kamaladini, H. An efficient Agrobacterium-mediated transformation of strawberry cv. Camarosa by a dual plasmid system. Molecules. 20 (3), 3647-3666 (2015).
  22. Wang, X., Ryu, D., Houtkooper, R. H., Auwerx, J. Antibiotic use and abuse: a threat to mitochondria and chloroplasts with impact on research, health, and environment. Bioessays. 37 (10), 1045-1053 (2015).
  23. Gelvin, S. B. Plant DNA repair and Agrobacterium T-DNA integration. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 8458 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Agrobacterium tumefaciens mediated transformationChlorella vulgarisAMTmGFP5BTAPT DNAPCAMBIA1302

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved