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要約

このプロトコルは安定した形質転換剤の生産をもたらす緑の微細藻類Chlorella vulgarisの核ゲノムに興味の遺伝子を統合するためのアグロバクテリウムのtumefaciens仲介された変形(AMT)の利用を輪郭を描く。

要約

アグロバクテリウム・ツメファシエンスを介した形質転換(AMT)は、植物ゲノムを操作するための広く採用されているツールとして機能します。しかし、 A. tumefaciensは 、多様な種への遺伝子導入能力を示します。多くの微細藻類種は、目的の遺伝子を核ゲノムに確実に組み込むための確立された方法を欠いています。微細藻類バイオテクノロジーの潜在的な利点を利用するには、シンプルで効率的なゲノム操作ツールが不可欠です。本明細書では、ハイグロマイシンBおよびセフォタキシムを含むトリスアセテートリン酸(TAP)培地へのめっきによって、レポーター緑色蛍光タンパク質(mGFP5)およびハイグロマイシンBの抗生物質耐性マーカーを利用して、工業用微細藻類種 クロレラ・ブルガリスに最適化されたAMTプロトコルが提示されます。mGFP5の発現は、継代培養の10世代以上後に蛍光 によって 定量され、T-DNAカセットの安定した形質転換を示しています。このプロトコルは市販のpCAMBIA1302植物の表現のベクトルを用いる2週以下で多数のtransgenic C. vulgaris のコロニーの信頼できる生成を可能にする。

概要

アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)は、グラム陰性土壌伝染性細菌であり、独自の王国間遺伝子導入能力を有しており、「天然遺伝子工学者」1の称号を得ています。この細菌は、腫瘍誘導プラスミド(Ti-プラスミド)からIV型分泌系を介して宿主細胞にDNA(T-DNA)を移し、宿主ゲノム1,2,3,4内にT-DNAを統合して発現させることができます。自然界では、このプロセスは植物の腫瘍形成につながり、一般にクラウンゴール病として知られています。しかし、アグロバクテリウムは、実験室条件下で酵母、真菌、藻類、ウニ胚、さらにはヒト細胞など、他のさまざまな生物にT-DNAを転写することもできます5,6,7,8。

この自然システムを利用して、アグロバクテリウム・ツメファシエンスを介した形質転換(AMT)は、TiプラスミドのT-DNA領域を修飾することにより、目的の遺伝子を宿主細胞の核ゲノムにランダムに組み込むことができます。この目的のために、広く用いられているAMT植物発現ベクターは、pCAMBIA13029である。研究者は、目的のベクターをA. tumefaciensに移植し、その後目的の宿主に移植する前に、大腸菌で簡単なクローニングワークフローを採用することができます。

緑色微細藻類は、陸上植物と多くの類似点を共有する真核生物ですが、遺伝子組み換えに対して非常に抵抗性があります。しかし、遺伝子組み換えは、微細藻類の基礎研究とバイオテクノロジー研究の両方において重要な役割を果たしています。いくつかの微細藻類種、特にクラミドモナス・ラインハルトティでは、AMTによる遺伝子組み換えにより、ヒトインターロイキン-2(hIL-2)、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2受容体結合ドメイン(SARS-CoV-2 RBD)、および2つの抗菌ペプチド(AMP)などの導入遺伝子の導入に成功しています10,11,12,13。これらのうち、尋常性クロレラ(Chlorella vulgaris)は、あまり気難しくなく、成長の早い緑藻類種であり、炭水化物、タンパク質、栄養補助食品、色素、およびその他の高価値化合物の持続可能な生産に大きな可能性を秘めています14。しかし、C. vulgarisのトランスジェニック株を作製するための信頼できるツールの欠如が、その商業的進歩を妨げている。C. vulgaris15 で AMT を利用した研究が発表されているのは限られているため、植物と微細藻類の培養には大きな違いがあるため、AMT プロトコルの最適化が不可欠になります。

この研究では、研究者らは、カリフラワーモザイクウイルス(CamV)35Sプロモーターの下流に緑色蛍光タンパク質(mGFP5)を挿入し、ヒスチジンタグを付加して、タンパク質発現のレポーター遺伝子として使用しました。形質転換体はハイグロマイシンBを用いて選別され、20世代以上にわたって継代培養された後、形質転換は安定していました。この研究で用いたpCAMBIA1302プラスミドは、任意の目的遺伝子を含むように容易に適合させることができます。さらに、提示された方法および材料は、活性CamV35Sプロモーターを有する他の緑藻種について調整することができ、このプロモーターはハイグロマイシンの選択に使用される。

プロトコル

すべての培地および溶液は、特に明記されていない限り、使用前にオートクレーブ滅菌する必要があります。すべての遠心分離管、ピペットチップなどは、使用前に滅菌またはオートクレーブ滅菌する必要があります。簡単に参照できるように、このプロトコルで使用される培地レシピを 表1にリストします。

1. A. tumefaciensの 電気コンピテントセルの作製

  1. アグロバクテリウム(AGL-1)を凍結グリセロールストックからLB培地(リファンピシン、20 mg/L-1を添加)の25 mL滅菌シェーカーフラスコに接種し、28〜30°C、150rpmで一晩増殖させます。
    注: アグロバクテリウム 株AGL-1は、リファンピシン、アンピシリン、クロラムフェニコール、およびストレプトマイシンに耐性があり( 材料表を参照)、いくつかのサプライヤーから入手できます。
  2. 翌日、オートクレーブ滅菌した超純水50mLに一晩培養液0.5μLを加えて培養液を1,00,000倍に希釈し、この希釈培養液10μLをLBプレート上に広げた後、28〜30°Cで1〜3日間インキュベートします。
  3. コロニーを選び、28〜30°Cのリファンピシンを含むLBで20 mLの一晩培養を開始します。
  4. 翌日、シェーカーフラスコに500 mLのLB培地(抗生物質なし)に9 mLの一晩培養液を接種し、OD600 が0.5に達するまで28〜30°Cで増殖させます。
  5. 培養液を10本の50 mL遠心チューブに均等に分割し、氷上で30分間冷却します。遠心分離機を4°Cに予冷します。
  6. チューブを4°C、4000 x g で15分間遠心分離します。続いて、ピペットを使用してできるだけ多くの上清を除去し、各チューブ内のペレットを50 mLの氷冷水に再懸濁します。
  7. 細胞を4°C、4000 x g で15分間遠心分離します。上清を取り除き、各チューブの25 mLの氷冷水にペレットを再懸濁します。
  8. 細胞を4°C、4000 x g で15分間遠心分離します。上清を除去し、ペレットを氷冷10%(w/v)グリセロール1 mLに再懸濁します。
  9. すべてのチューブを1本の50 mLチューブに混ぜ合わせ、細胞を4°C、4000 x g で15分間遠心分離します。上清を除去し、ペレットを氷冷10%(w/v)グリセロール400 μLに再懸濁します。細胞濃度は約1-3 x 1010 cells/mLです。
  10. 細胞を50 μLのアリコートとして、滅菌済みの冷却済みマイクロチューブに分配します。液体窒素で凍結し、-80°Cの冷凍庫で保存してください。

2. A. tumefaciensのエレクトロポレーション

  1. 50 μLのAGL-1 A. tumefaciens電気 コンピテントセルをプレチルドした0.1 mmキュベットに加え、2 μLのpCAMBIA1302または類似のプラスミド(濃度15 ng/μL)を加えます( 材料表を参照)。
  2. エレクトロポレーター(200 Ω、静電容量エクステンダー250 μFD、静電容量25 μFD、指数関数的減衰、 材料表を参照)を使用して2400 Vでエレクトロポレーションします。指数関数的減衰を伴うエレクトロポレーションを成功させるには、時定数を >4.5 ミリ秒にする必要があります。
  3. ただちに1 mLのLB培地をキュベットに加え、ピペットで静かに上下させて混合します。再懸濁した細胞1mLを1.5mLのマイクロチューブに移し、28〜30°Cで少なくとも1時間インキュベートして回収します。
  4. 適切な抗生物質(すなわち、原核生物選択のためのpCAMBIA1302に対して50 mg/Lのカナマイシン)を含むLB寒天培地に細胞をプレーティングします。
  5. 28〜30°Cで2〜3日間インキュベートします。
  6. コロニーを1つ選択し、適切な選択(pCAMBIA1302では50 mg/Lのカナマイシン)を使用してLBで一晩増殖させ、将来の使用のために50%グリセロールを使用してプラスミド含有株を-80°Cで凍結保存します。

3. C. vulgarisのAMT

注:C. vulgaris(UTEX 395、材料表を参照)とA. tumefaciensの培養を並行して調製し、共同培養を行います。C. vulgariの培養は、A. tumefaciens の培養を調製する 3 日前に開始する必要があります。プロトコルは、Kumarらによって公開されたプロトコルに基づいて修正されました7。

  1. C. vulgaris 培養の準備
    1. C. vulgaris は、伝統的に斜めに保管されるか、照明条件で対数相培養に維持されます。OD600 = 1.0 の対数相培養から、0.5 mL を Tris-Acetate-Phosphate (TAP、表 1 を参照) 寒天プレート ( 1.2% w/v 寒天 A) に広げ、照明 (50 μE/m2s) で 25 °C で 5 日間増殖させます。これにより、約 5 x 106 個のセルが生成されます。
  2. A. tumefaciens培養の準備
    1. 15 mMグルコース、20 mg/Lのリファンピシン、および50 mg/Lのカナマイシン(材料表を参照)を添加したLB培地10 mLをグリセロールストックを用いて接種することにより、シェーカーフラスコ内でA. tumefaciens AGL-1 pCAMBIA1302株を増殖させます。28〜30°C、250rpmで一晩インキュベートします。
    2. 15 mMグルコース、20 mg/Lリファンピシン、および50 mg/Lカナマイシンを含む50 mLのLBに1 mLの一晩培養を接種し、OD600 が1.0に達するまで28〜30°Cおよび250rpmでインキュベートします。
  3. C. vulgaris と A. tumefaciens を共培養する
    1. A. tumefaciens培養物を共培養用に調製するには、増殖させた培養物を50 mLチューブに移し、室温で4000 x gで30分間遠心分離します。ピペットを使用して上清を除去し、誘導培地で細胞を2回洗浄します。
      注:使用する誘導担体は、pH 5.5 に調整された TAP 培地で、F/2 培地微量金属およびビタミンと 200 μM アセトシリンゴン(AS、 材料表を参照)を添加しています。細胞を誘導媒体に再懸濁し、OD600 = 0.5 になるようにします。
    2. C. vulgaris 培養物を共培養用に調製するには、25 mL の誘導培地を C. vulgaris プレートに添加し、~5 x 106 個の細胞を含有します。50 mLチューブに移します。細胞を室温で4000 x gで15分間遠心分離し、上清を廃棄します。
    3. 藻類細胞ペレットを200μLの細菌懸濁液(OD600:0.5)と混合し、ロータリーシェーカーで21〜25°C、150rpmで1時間インキュベートします。
    4. 混合培養液(200 μL)を15 mMグルコースを添加した誘導培地プレートに広げ、暗所で21〜25°Cで3日間インキュベートします。
    5. 3日後、400 mg/Lのセフォタキシムまたは20 mg/Lのテトラサイクリン( 材料表を参照)を添加した10 mLのTAP培地を使用して微細藻類を採取し、21〜25°Cの暗所で2日間インキュベートして、 A. tumefaciensを 培養物から除去します。
    6. 20-70 mg/LのハイグロマイシンB(pCAMBIA1302使用時)および400 mg/L-1 セフォタキシムまたは20 mg/Lのテトラサイクリンを添加したTAP培地など、選択的培地に培養物500 μLを播種します。暗所で21〜25°Cで2日間インキュベートしてから、照明付きのチャンバーに入れます。
      注:耐性コロニーは、光曝露の5〜7日後に現れます。
    7. 形質転換プレートから単一のコロニーを選択し、400 mg / Lのセフォタキシムまたは20 mg / Lのテトラサイクリンと20〜70 mg / LのハイグロマイシンBを添加したTAP寒天プレートでそれらを再ストリークします。

4. C. vulgaris 形質転換体の遺伝子組み分入を確認するためのコロニーPCR(cPCR)

  1. 植物ゲノムDNA抽出キットを使用して、1つのコロニーから少なくとも2回継代培養した後、C. vulgaris形質転換体からゲノムDNAを抽出します(材料表を参照)。これをPCRの鋳型として用いて、T-DNAのmgfp5領域(mgfp5-Fwd:5' CCCATCTCATAAATAACGTC 3'、およびM13-Rev:5' CAGGAAACAGCTATGAC 3')のプライマーを設計します。
    1. Q5ハイフィデリティDNAポリメラーゼマスターミックスキット( 材料表を参照)を使用して、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行い、導入遺伝子の組み込みを検証します。
      注:本研究では、次の条件を使用しました:98°Cで3分間。35サイクル(98°Cで10秒、57°Cで30秒、72°Cで1分);72°Cで5分間pCAMBIA1302をポジティブコントロールとして使用し、野生型C .尋常性 ゲノムDNAをネガティブコントロールとして使用します。
  2. A. tumefaciensによる残留汚染により、サンプル中にpCAMBIA1302が存在しないことを確認するには、コロニーPCRを使用します。10μLの滅菌水に少量の形質転換細胞を加え、98°Cで15分間煮沸します。これをPCRのテンプレートとして使用してください。
    1. pCAMBIA1302(B1-Fwd:5'AGTAAAGGAGAAGAACTTTTC 3'およびB1-Rev:5'CCTGATGCGGTATTTTCTC 3')のT-DNA以外の領域のプライマーを設計します。
      注:本研究では、94°Cで3分間の条件を使用しました。30サイクル(94°Cで30秒、48°Cで30秒、68°Cで5分);68°Cで7分間ポジティブコントロールとして A. tumefaciens AGL-1 (pCAMBIA1302) のゆでコロニーを使用し、ネガティブコントロールとして野生型 C. vulgaris のゆでコロニーを使用します。
  3. サンプル中に A. tumerfaciens コンタミネーションがないことを確認するには、コロニー PCR を使用します。10μLの滅菌水に少量の形質転換細胞を加え、98°Cで15分間煮沸します。これをPCRのテンプレートとして使用してください。
    1. AGL-1病原性プラスミド(virE2-Fwd:5' AGGGAGCCCTACCCG 3'およびvirE2-Rev:5' GAACCAGCCTGGAGTTCG 3')に含まれるvirE2遺伝子のプライマーを設計します。
      注:本研究では、94°Cで3分間の条件を使用しました。30サイクル(94°Cで30秒、53°Cで30秒、68°Cで3分);68°Cで7分間ポジティブコントロールとして A. tumefaciens AGL-1 (pCAMBIA1302) のゆでコロニーを使用し、ネガティブコントロールとして野生型 C. vulgaris のゆでコロニーを使用します。
  4. ラダー(1 Kbp DNAラダー、 材料表を参照)とともにDNAアガロースゲル上でPCRサンプルを実行し、得られたフラグメントのサイズを確認します16。

5. 形質転換体の蛍光測定

  1. 対数相維持培養または TAP 寒天培地からの各形質転換体を、開始 OD 600 = 0.1 になるように、200 mg/L-1 セフォタキシムと 25 mg/L-1 ハイグロマイシン B を添加した 50 mL の TAP に接種します。1つの培養物に野生型C.尋常性菌を接種し、ネガティブコントロールとして200 mg/L-1セフォタキシムのみを接種します。25°C、150rpm、150μmol/m2sの光合成活性光でインキュベートします(材料表を参照)。
  2. 24時間ごとに300 μLのサンプルを採取し、96ウェルプレートリーダーまたはUV/Vis分光計および蛍光光度計で吸光度と蛍光(励起488 nm、発光526 nm)を測定します( 材料表を参照)。同時測定には底が透明な黒いプレートを使用してください。

6. 粗タンパク質抽出、タンパク質精製、SDS-PAGE電気泳動

  1. 形質転換体(#50)を対数相維持培養から 300 mL の TAP に接種し、200 mg/L-1 セフォタキシムと 25 mg/L-1 ハイグロマイシン B を添加して、OD680 = 0.1 にします。1つの培養物に野生型C.尋常性菌を接種し、ネガティブコントロールとして200 mg/L-1セフォタキシムのみを接種します。25°C、150rpm、150μmol/m2sの光合成活性光でインキュベートします。
  2. 5 mLの溶解緩衝液( 表1を参照)を使用して形質転換体(#50)および野生型株から粗タンパク質サンプルを抽出し、続いて4分間超音波処理します。
  3. 粗タンパク質サンプルを Ni-NTA 樹脂で 5 mL ポリプロピレンカラムで精製します( 材料表を参照)。
  4. 15 mLの精製タンパク質サンプルを凍結乾燥し、SDS-PAGE分析のために1 mLの溶解バッファーに再懸濁します17。

結果

上記の方法を用いて形質転換の成功を示すために、 C. vulgaris をpCAMBIA1302プラスミドを含むAGL-1と共培養するか、プラスミドを含まない(野生型で、ハイグロマイシンBとセフォタキシムを添加したTAP寒天培地に播種した)(図1A)。左端のプレートは、ハイグロマイシンB/セフォタキシムプレート上で増殖可能な形質転換コロニーを示し、中央のプレートは、野生型AGL-1が...

ディスカッション

変換の効率は、いくつかの異なるパラメータに関連しています。AMTに使用される A.tumefaciens 株の選択は重要です。AGL-1は、発見された最も侵襲性の高い菌株の1つであり、このため、植物AMTで日常的に使用されています。 誘導媒体にグルコース(15〜20 mM)を補給することも、AMTの効率にとって重要です。 C. vulgaris は光栄養条件と従属栄養条件の両方で増殖できることを考慮すると?...

開示事項

利益相反は宣言されていません。

謝辞

著者らは、オランダのライデン大学ライデン生物学研究所からpCAMBIA1302ベクターと アグロバクテリウム・ツメファシエンス AGL1を提供してくださったPaul Hooykaas教授に感謝します。また、著者らは、蛍光形質転換体の培養に協力してくれたEva Colic氏にも感謝の意を表したい。この研究は、カナダ自然科学・工学研究評議会(Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada)とMitacs Accelerateプログラムから資金提供を受けました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
1 Kb Plus DNA ladderFroggaBioDM015
AcetosyringoneFisher ScientificD26665G
Agrobacterium tumefaciensGold BiotechnologiesStrain: AGL-1; Gift from Prof. Paul HooykaasGenotype: C58 RecA (RifR/CarbR) pTiBo542DT-DNA
BiotinEnzo Life Sciences89151-400
CaCl2·2H2OVWRBDH9224-1KG
CefotaximeAK ScientificJ90010
Chlorella vulgarisUniversity of Texas at Austin Culture Collection of AlgaeStrain: UTEX 395Wildtype strain
CoCl2·6H2OSigma AldrichC8661-25G
CuSO4·5H2OEMD MilliporeCX2185-1
FeCl3·6H2OVWRBDH9234-500G
Gene Pulser Xcell ElectroporatorBio-Rad1652662Main unit equipped with PC module.
GeneJET Plant Genome Purification KitThermo ScientificK0791
Glacial acetic acidVWRCABDH3093-2.2P
GlycerolBioBasicGB0232
HEPES BufferSigma AldrichH-3375
Hygromycin BFisher ScientificAAJ6068103
K2HPO4VWRBDH9266-500G
KanamycinGold BiotechnologiesK-250-25
KH2PO4VWRBDH9268-500G
MgSO4·7H2OVWR97062-134
MnCl2·4H2OJT BakerBAKR2540-01
Na2CO3VWRBDH7971-1
Na2EDTA·2H2OJT Baker8993-01
Na2MoO4·2H2OJT BakerBAKR3764-01
NaClVWRBDH7257-7
NaH2PO4 H2OMillipore SigmaCA80058-650
NaNO3 VWRBDH4574-500G
NEBExpress Ni ResinNewEngland BioLabsNEB #S1427
NH4ClVWRBDH9208-500G
pCAMBIA1302Leiden UniversityGift from Prof. Paul HooykaaspBR322, KanR, pVS1, T-DNA(CaMV 35S/HygR/CaMV polyA, CaMV 35S promoter/mgpf5-6xhis/NOS terminator)
Polypropylene Columns (5 mL)QIAGEN34964
Precision Plus Protein Unstained Protein Standards, Strep-tagged recombinant, 1 mLBio-Rad1610363
RifampicinMillipore SigmaR3501-1G
SunBlaster LED Strip Light 48 Inch SunBlaster210000000906
Synergy 4 Microplate UV/Vis spectrometer BioTEKS4MLFPTA
TetracyclineThermo Scientific ChemicalsCAAAJ61714-14
TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 12%Bio-Rad1610185
ThiamineTCI AmericaT0181-100G
Tris BaseFisher ScientificBP152-500
TryptoneBioBasicTG217(G211)
Vitamin B12 (cyanocobalamin)Enzo Life Sciences89151-436
Yeast ExtractBioBasicG0961
ZnSO4·7H2OJT Baker4382-01

参考文献

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Tumefaciens AMT mGFP5 B TAP T DNA PCAMBIA1302

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