Agrobacterium tumefaciens-緑色微細藻類Chlorella vulgarisの遺伝子工学

要約

このプロトコルは安定した形質転換剤の生産をもたらす緑の微細藻類Chlorella vulgarisの核ゲノムに興味の遺伝子を統合するためのアグロバクテリウムのtumefaciens仲介された変形(AMT)の利用を輪郭を描く。

要約

アグロバクテリウム・ツメファシエンスを介した形質転換(AMT)は、植物ゲノムを操作するための広く採用されているツールとして機能します。しかし、 A. tumefaciensは 、多様な種への遺伝子導入能力を示します。多くの微細藻類種は、目的の遺伝子を核ゲノムに確実に組み込むための確立された方法を欠いています。微細藻類バイオテクノロジーの潜在的な利点を利用するには、シンプルで効率的なゲノム操作ツールが不可欠です。本明細書では、ハイグロマイシンBおよびセフォタキシムを含むトリスアセテートリン酸(TAP)培地へのめっきによって、レポーター緑色蛍光タンパク質(mGFP5)およびハイグロマイシンBの抗生物質耐性マーカーを利用して、工業用微細藻類種 クロレラ・ブルガリスに最適化されたAMTプロトコルが提示されます。mGFP5の発現は、継代培養の10世代以上後に蛍光 によって 定量され、T-DNAカセットの安定した形質転換を示しています。このプロトコルは市販のpCAMBIA1302植物の表現のベクトルを用いる2週以下で多数のtransgenic C. vulgaris のコロニーの信頼できる生成を可能にする。

概要

アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)は、グラム陰性土壌伝染性細菌であり、独自の王国間遺伝子導入能力を有しており、「天然遺伝子工学者^」1の称号を得ています。この細菌は、腫瘍誘導プラスミド(Ti-プラスミド)からIV型分泌系を介して宿主細胞にDNA(T-DNA)を移し、宿主ゲノム1,2,3,4内にT-DNAを統合して発現させることができます。自然界では、このプロセスは植物の腫瘍形成につながり、一般にクラウンゴール病として知られています。しかし、アグロバクテリウムは、実験室条件下で酵母、真菌、藻類、ウニ胚、さらにはヒト細胞など、他のさまざまな生物にT-DNAを転写することもできます5,6,7,8。

この自然システムを利用して、アグロ....

プロトコル

すべての培地および溶液は、特に明記されていない限り、使用前にオートクレーブ滅菌する必要があります。すべての遠心分離管、ピペットチップなどは、使用前に滅菌またはオートクレーブ滅菌する必要があります。簡単に参照できるように、このプロトコルで使用される培地レシピを 表1にリストします。

1. A. tumefaciensの 電気コンピテントセルの作製

1. アグロバクテリウム(AGL-1)を凍結グリセロールストックからLB培地(リファンピシン、20 mg/^L-1を添加)の25 mL滅菌シェーカーフラスコに接種し、28〜30°C、150rpmで一晩増殖させます。
   注: アグロバクテリウム 株AGL-1は、リファンピシン、アンピシリン、クロラムフェニコール、およびストレプトマイシンに耐性があり( 材料表を参照)、いくつかのサプライヤーから入手できます。
2. 翌日、オートクレーブ滅菌した超純水50mLに一晩培養液0.5μLを加えて培養液を1,00,000倍に希釈し、この希釈培養液10μLをLBプレート上に広げた後、28〜30°Cで1〜3日間インキュベートします。
3. コロニーを選び、28〜30°Cのリファンピシンを含むLBで20 mLの一晩培養を開始します。<....

ディスカッション

変換の効率は、いくつかの異なるパラメータに関連しています。AMTに使用される A.tumefaciens 株の選択は重要です。AGL-1は、発見された最も侵襲性の高い菌株の1つであり、このため、植物AMTで日常的に使用されています。 誘導媒体にグルコース(15〜20 mM)を補給することも、AMTの効率にとって重要です。 C. vulgaris は光栄養条件と従属栄養条件の両方で増殖できることを考慮すると?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 Kb Plus DNA ladder	FroggaBio	DM015
Acetosyringone	Fisher Scientific	D26665G
Agrobacterium tumefaciens	Gold Biotechnologies	Strain: AGL-1; Gift from Prof. Paul Hooykaas	Genotype: C58 RecA (RifR/CarbR) pTiBo542DT-DNA
Biotin	Enzo Life Sciences	89151-400
CaCl2·2H2O	VWR	BDH9224-1KG
Cefotaxime	AK Scientific	J90010
Chlorella vulgaris	University of Texas at Austin Culture Collection of Algae	Strain: UTEX 395	Wildtype strain
CoCl2·6H2O	Sigma Aldrich	C8661-25G
CuSO4·5H2O	EMD Millipore	CX2185-1
FeCl3·6H2O	VWR	BDH9234-500G
Gene Pulser Xcell Electroporator	Bio-Rad	1652662	Main unit equipped with PC module.
GeneJET Plant Genome Purification Kit	Thermo Scientific	K0791
Glacial acetic acid	VWR	CABDH3093-2.2P
Glycerol	BioBasic	GB0232
HEPES Buffer	Sigma Aldrich	H-3375
Hygromycin B	Fisher Scientific	AAJ6068103
K2HPO4	VWR	BDH9266-500G
Kanamycin	Gold Biotechnologies	K-250-25
KH2PO4	VWR	BDH9268-500G
MgSO4·7H2O	VWR	97062-134
MnCl2·4H2O	JT Baker	BAKR2540-01
Na2CO3	VWR	BDH7971-1
Na2EDTA·2H2O	JT Baker	8993-01
Na2MoO4·2H2O	JT Baker	BAKR3764-01
NaCl	VWR	BDH7257-7
NaH2PO4 H2O	Millipore Sigma	CA80058-650
NaNO3	VWR	BDH4574-500G
NEBExpress Ni Resin	NewEngland BioLabs	NEB #S1427
NH4Cl	VWR	BDH9208-500G
pCAMBIA1302	Leiden University	Gift from Prof. Paul Hooykaas	pBR322, KanR, pVS1, T-DNA(CaMV 35S/HygR/CaMV polyA, CaMV 35S promoter/mgpf5-6xhis/NOS terminator)
Polypropylene Columns (5 mL)	QIAGEN	34964
Precision Plus Protein Unstained Protein Standards, Strep-tagged recombinant, 1 mL	Bio-Rad	1610363
Rifampicin	Millipore Sigma	R3501-1G
SunBlaster LED Strip Light 48 Inch	SunBlaster	210000000906
Synergy 4 Microplate UV/Vis spectrometer	BioTEK	S4MLFPTA
Tetracycline	Thermo Scientific Chemicals	CAAAJ61714-14
TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 12%	Bio-Rad	1610185
Thiamine	TCI America	T0181-100G
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-500
Tryptone	BioBasic	TG217(G211)
Vitamin B12 (cyanocobalamin)	Enzo Life Sciences	89151-436
Yeast Extract	BioBasic	G0961
ZnSO4·7H2O	JT Baker	4382-01