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요약

이 프로토콜은 녹색 미세조류 클로렐라 심가리스(Chlorella vulgaris)의 핵 게놈에 관심 유전자를 통합하기 위한 Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation(AMT)의 활용을 간략하게 설명하여 안정적인 형질전환체를 생산합니다.

초록

Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation(AMT)은 식물 게놈을 조작하는 데 널리 사용되는 도구 역할을 합니다. 그러나 A. tumefaciens 는 다양한 종으로 유전자를 전달하는 능력을 나타냅니다. 수많은 미세조류 종은 관심 유전자를 핵 게놈에 안정적으로 통합하기 위한 잘 확립된 방법이 부족합니다. 미세조류 생명공학의 잠재적 이점을 활용하려면 간단하고 효율적인 게놈 조작 도구가 중요합니다. 본 명세서에서는 리포터 그린 형광 단백질(mGFP5) 및 히그로마이신 B에 대한 항생제 내성 마커를 이용하는 산업용 미세조류 종인 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris)에 대해 최적화된 AMT 프로토콜이 제시된다. 돌연변이체는 하이그로마이신 B 및 세포탁심(cefotaxime)을 함유하는 트리스-아세테이트-포스페이트(TAP) 배지 상의 도금을 통해 선택된다. mGFP5의 발현은 10세대 이상의 과배양 후 형광을 통해 정량화되며, 이는 T-DNA 카세트의 안정적인 형질전환을 나타냅니다. 이 프로토콜은 상업적으로 이용 가능한 pCAMBIA1302 식물 발현 벡터를 사용하여 2주 이내에 여러 형질전환 C. vulgaris 콜로니를 안정적으로 생성할 수 있습니다.

서문

그람 음성 토양 매개 박테리아인 Agrobacterium tumefaciens는 독특한 왕국 간 유전자 전달 능력을 가지고 있어 "자연 유전 공학자"라는 칭호를 얻었습니다.1 이 박테리아는 종양 유도 플라스미드(Ti-Plasmid)에서 Type IV 분비 시스템을 통해 숙주 세포로 DNA(T-DNA)를 전달하여 숙주 게놈 1,2,3,4 내에서 T-DNA의 통합 및 발현을 유도할 수 있습니다. 자연 환경에서 이 과정은 일반적으로 크라운 담즙 질환으로 알려진 식물의 종양 형성으로 이어집니다. 그러나 아그로박테리움은 T-DNA를 효모, 균류, 조류, 성게 배아, 심지어 실험실 조건 하에서 인간 세포를 포함한 다양한 다른 유기체로 옮길 수도 있다 5,6,7,8.

이러한 자연 시스템을 이용하여, 아그로박테리움 투메파시엔스 매개 형질전환(AMT)은 Ti-플라스미드의 T-DNA 영역을 변형시킴으로써 관심 유전자를 숙주 세포의 핵 게놈에 무작위로 통합할 수 있습니다. 이를 위해 널리 사용되는 AMT 식물 발현 벡터는 pCAMBIA13029입니다. 연구자들은 원하는 벡터를 A. tumefaciens로 전송하기 전에 E. coli에서 간단한 클로닝 워크플로우를 사용하여 관심 호스트로 후속 전송할 수 있습니다.

녹조류는 육상 식물과 많은 유사점을 공유하지만 유전자 변형에 매우 난해한 진핵생물입니다. 그러나 유전자 형질전환은 미세조류의 기초 및 생명공학 연구에서 중요한 역할을 합니다. 여러 미세조류 종, 특히 클라미도모나스 라인하르트티(Chlamydomonas reinhardtii)에서 AMT를 통한 유전자 변형은 인간 인터루킨-2(hIL-2), 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2 수용체 결합 도메인(SARS-CoV-2 RBD) 및 두 가지 항균 펩타이드(AMP)10,11,12,13과 같은 전이유전자를 성공적으로 도입했습니다. 이 중 덜 까다롭고 빠르게 성장하는 녹조류 종인 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris)는 탄수화물, 단백질, 기능 식품, 안료 및 기타 고부가가치 화합물의 지속 가능한 생산에 상당한 잠재력을 가지고 있습니다14. 그러나 C. vulgaris의 형질전환 균주를 만들기 위한 신뢰할 수 있는 도구의 부족은 상업적 발전을 방해합니다. C. vulgaris15에서 AMT를 활용한 발표된 연구의 수가 제한되어 있고 식물과 미세조류 재배 간의 상당한 차이를 감안할 때 AMT 프로토콜을 최적화하는 것이 필수적입니다.

이 연구에서 연구원들은 콜리플라워 모자이크 바이러스(CamV) 35S 프로모터의 다운스트림에 녹색 형광 단백질(mGFP5)을 삽입하고 히스티딘 태그를 추가하여 단백질 발현을 위한 리포터 유전자로 사용했습니다. 형질전환체는 Hygromycin B를 사용하여 선택하였고, 20세대 이상 과배양 후에, 형질전환은 안정적으로 유지되었다. 이 연구에 사용된 pCAMBIA1302 플라스미드는 관심 유전자를 포함하도록 쉽게 적응할 수 있습니다. 또한, 제시된 방법 및 물질은 활성 CamV35S 프로모터를 갖는 다른 녹조류 종에 대해 조정할 수 있는데, 이 프로모터는 Hygromycin 선택에 사용되기 때문입니다.

프로토콜

달리 명시되지 않는 한 모든 매체와 용액은 사용하기 전에 고압멸균해야 합니다. 모든 원심분리기 튜브, 피펫 팁 등은 사용하기 전에 멸균 또는 고압멸균해야 합니다. 쉽게 참조할 수 있도록 이 프로토콜에 사용된 미디어 레시피는 표 1에 나열되어 있습니다.

1. A. tumefaciens 전기 능력 세포의 제조

  1. 냉동 글리세롤 스톡에서 추출한 LB 배지(리팜피신 20mg/L-1 보충)가 담긴 25mL 멸균 셰이커 플라스크에 아그로박테리움(AGL-1)을 접종하고 28-30°C 및 150rpm에서 밤새 성장시킵니다.
    참고: Agrobacterium 균주 AGL-1은 리팜피신, 암피실린, 클로람페니콜 및 스트렙토마이신에 내성이 있으며 여러 공급업체에서 얻을 수 있습니다.
  2. 다음날 50mL 오토클레이브 초순수에 야간 배양액 0.5μL를 첨가하여 배양액을 1,00,000배 희석하고 이 희석된 배양액 10μL를 LB 플레이트에 뿌린 다음 28-30°C에서 1-3일 동안 배양합니다.
  3. 콜로니를 선택하고 28-30°C에서 리팜피신을 사용하여 LB에서 20mL의 야간 배양을 시작합니다.
  4. 다음날 셰이커 플라스크에 500mL LB 배지(항생제 없음)를 하룻밤 배양 9mL와 함께 접종하고 OD600 이 0.5에 도달할 때까지 28-30°C에서 성장시킵니다.
  5. 배양액을 10개의 50mL 원심분리기 튜브에 균등하게 나누고 얼음 위에서 30분 동안 식힙니다. 원심분리기를 4°C로 사전 냉각합니다.
  6. 4°C 및 4000 x g 에서 15분 동안 튜브를 원심분리합니다. 그런 다음 피펫을 사용하여 가능한 한 많은 상층액을 제거하고 펠릿을 얼음처럼 차가운 물 50mL에 각 튜브에 재현탁시킵니다.
  7. 4°C 및 4000 x g 에서 15분 동안 세포를 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 각 튜브의 얼음처럼 차가운 물 25mL에 펠릿을 재현탁시킵니다.
  8. 4°C 및 4000 x g 에서 15분 동안 세포를 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 각 튜브의 얼음처럼 차가운 10%(w/v) 글리세롤 1mL에 펠릿을 재현탁시킵니다.
  9. 모든 튜브를 하나의 50mL 튜브에 결합하고 4°C 및 4000 x g 에서 15분 동안 세포를 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 펠릿을 400μL의 얼음처럼 차가운 10%(w/v) 글리세롤에 재현탁시킵니다. 세포 농도는 약 1-3 x 1010 cells/mL여야 합니다.
  10. 세포를 50μL 분취액으로 멸균 사전 냉각된 마이크로튜브에 분배합니다. 액체 질소에서 얼린 후 -80°C 냉동실에 보관합니다.

2. A. tumefaciens의 전기천공법

  1. 50 μL의 AGL-1 A. tumefaciens electrocompetent cell을 사전 냉각된 0.1 mm 큐벳에 넣고 2 μL의 pCAMBIA1302 또는 유사한 플라스미드(conc 15 ng/μL)를 추가합니다( 재료 표 참조).
  2. electroporator(200 Ω, 커패시턴스 익스텐더 250μFD, 커패시턴스 25μFD, 지수 감쇠, 재료 표 참조)를 사용하여 2400V에서 전기포레이트. 시간 상수는 지수 감쇠로 성공적인 electroporation을 위해 >4.5ms여야 합니다.
  3. 즉시 1mL의 LB 배지를 큐벳에 추가하고 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 혼합합니다. 재현탁 세포 1mL를 1.5mL 마이크로튜브에 옮기고 28-30°C에서 최소 1시간 동안 배양하여 회수합니다.
  4. 적절한 항생제(즉, 원핵생물 선택을 위한 pCAMBIA1302에 대한 카나마이신 50mg/L)를 포함하는 LB 한천에 세포를 플레이트화합니다.
  5. 28-30 °C에서 2-3일 동안 배양합니다.
  6. 하나의 콜로니를 선택하고 적절한 선택(pCAMBIA1302에 대한 카나마이신 50mg/L)으로 LB에서 하룻밤 동안 성장시킨 다음 향후 사용을 위해 -80°C에서 50% 글리세롤을 사용하여 플라스미드 함유 균주를 냉동 보존합니다.

3. C. vulgaris의 AMT

참고: 공동 재배를 위해 C. vulgaris (UTEX 395, 재료 표 참조) 및 A. tumefaciens 배양을 병렬로 준비합니다. C. vulgari의 배양은 A. tumefaciens 배양을 준비하기 3일 전에 시작해야 합니다. 프로토콜은 Kumar et al.7에 의해 발표된 것을 기반으로 수정되었습니다.

  1. C. vulgaris 문화 준비
    1. C. vulgaris 는 전통적으로 비스듬히 보관되거나 조명 조건에서 로그 상 배양으로 유지됩니다. OD600 = 1.0의 log 상 배양에서 0.5mL를 Tris-Acetate-Phosphate(TAP, 표 1 참조) 한천 플레이트( 1.2% w/v 한천 A)에 퍼뜨리고 조명(50μE/m2초)으로 25°C에서 5일 동안 성장시킵니다. 이렇게 하면 약 5 x 106 개의 셀이 생성됩니다.
  2. A. tumefaciens 배양 준비
    1. 글리세롤 스톡을 사용하여 15mM 포도당, 20mg/L 리팜피신 및 50mg/L 카나마이신(재료 표 참조)이 보충된 LB 배지 10mL를 접종하여 셰이커 플라스크에서 A. tumefaciens AGL-1 pCAMBIA1302 균주를 성장시킵니다. 28-30 °C 및 250 rpm에서 밤새 배양합니다.
    2. 15mM 포도당, 20mg/L 리팜피신 및 50mg/L 카나마이신과 함께 50mL의 LB에 1mL의 야간 배양액을 접종하고 OD600 이 1.0에 도달할 때까지 28-30°C 및 250rpm에서 배양합니다.
  3. C. vulgaris 및 A. tumefaciens 공동 재배
    1. 공동 배양을 위해 A. tumefaciens 배양을 준비하려면 배양액을 50mL 튜브에 옮기고 실온에서 30분 동안 4000 x g 으로 원심분리합니다. 피펫을 사용하여 상층액을 제거하고 유도 매체로 세포를 두 번 세척합니다.
      참고: 사용되는 유도 매체는 pH 5.5로 조정되고 F/2 중간 미량 금속 및 200μM 아세토시링곤이 포함된 비타민으로 보충된 TAP 배지입니다(AS, 재료 표 참조). OD600 = 0.5가 되도록 유도 매체에 세포를 재현탁시킵니다.
    2. 공동 배양을 위해 C. vulgaris 배양을 준비하려면 ~ 5 x 106 세포를 포함하는 C. vulgaris 플레이트에 25mL의 유도 배지를 추가합니다. 50mL 튜브로 옮깁니다. 실온에서 4000 x g에서 15분 동안 세포를 원심분리하고 상층액을 버립니다.
    3. 조류 세포 펠릿을 200μL의 박테리아 현탁액(OD600: 0.5)과 혼합하고 21-25°C, 150rpm의 회전식 셰이커에서 1시간 동안 배양합니다.
    4. 혼합 배양액(200μL)을 15mM 글루코스가 보충된 유도 배지 플레이트에 펴 바르고 어두운 곳에서 21-25°C에서 3일 동안 배양합니다.
    5. 3일 후, 400mg/L 세포탁심 또는 20mg/L의 테트라사이클린( 재료 표 참조)이 보충된 TAP 배지 10mL를 사용하여 미세조류를 수집하고 21-25°C의 어두운 곳에서 2일 동안 배양하여 배양액에서 A. tumefaciens 를 제거합니다.
    6. 배양액 500μL를 선택적 배지(예: 20-70mg/L의 Hygromycin B(pCAMBIA1302 사용 시) 및 400mg/L-1 세포탁심 또는 20mg/L의 테트라사이클린이 보충된 TAP 배지에 플레이트합니다. 어두운 곳에서 21-25 °C에서 2 일 동안 배양한 후 조명이 켜진 챔버에 넣습니다.
      알림: 저항성 콜로니는 빛에 노출된 후 5-7일 후에 나타납니다.
    7. 형질전환 플레이트에서 단일 콜로니를 선택하고 400mg/L의 세포탁심 또는 20mg/L의 테트라사이클린 및 20-70mg/L의 Hygromycin B가 보충된 TAP 한천 플레이트에서 다시 줄무늬를 만듭니다.

4. C. vulgaris 형질전환체에서 유전자 통합을 확인하기 위한 콜로니 PCR(cPCR)

  1. 식물 게놈 DNA 추출 키트를 사용하여 단일 콜로니에서 최소 2회 과배양한 후 C. vulgaris 형질전환체에서 게놈 DNA를 추출합니다(재료 표 참조). 이를 PCR용 템플릿으로 사용하여 T-DNA의 mgfp5 영역(mgfp5-Fwd: 5' CCCATCTCATAAATAACGTC 3' 및 M13-Rev: 5' CAGGAAACAGCTATGAC 3')에 대한 프라이머를 설계합니다.
    1. Q5 high-fidelity DNA polymerase master mix kit( 재료 표 참조)를 사용하여 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 수행하여 전이유전자 통합을 검증합니다.
      참고: 본 연구에는 다음 조건이 사용되었습니다: 98분 동안 3°C; 35 사이클(98초 동안 10°C, 57초 동안 30°C, 72분 동안 1°C); 72분 동안 5°C pCAMBIA1302를 양성 대조군으로, 야생형 C. vulgaris 게놈 DNA를 음성 대조군으로 사용합니다.
  2. A. tumefaciens에 의한 잔류 오염으로 인해 샘플에 pCAMBIA1302가 존재하지 않는지 확인하려면 콜로니 PCR을 사용하십시오. 10μL의 멸균수에 소량의 형질전환체 세포를 첨가하고 98°C에서 15분 동안 끓입니다. PCR용 템플릿으로 사용합니다.
    1. pCAMBIA1302(B1-Fwd: 5'AGTAAAGGAGAACTTTTC 3' 및 B1-Rev: 5'CCTGATGCGGTATTTTCTC 3')에서 T-DNA 외부 영역에 대한 프라이머를 설계합니다.
      참고: 본 연구에는 다음 조건이 사용되었습니다: 94분 동안 3°C; 30 사이클(94초 동안 30°C, 48초 동안 30°C, 68분 동안 5°C); 68 ° C에서 7 분 동안 A. tumefaciens AGL-1 (pCAMBIA1302)의 삶은 콜로니를 양성 대조군으로 사용하고 야생형 C. vulgaris 의 삶은 콜로니를 음성 대조군으로 사용하십시오.
  3. 검체에 A. tumerfaciens 오염이 없는지 확인하려면 콜로니 PCR을 사용하십시오. 10μL의 멸균수에 소량의 형질전환체 세포를 첨가하고 98°C에서 15분 동안 끓입니다. PCR용 템플릿으로 사용합니다.
    1. AGL-1 독성 플라스미드(virE2-Fwd: 5' AGGGAGCCCTACCCG 3' 및 virE2-Rev: 5' GAACCAGCCTGGAGTTCG 3')에 포함된 virE2 유전자에 대한 프라이머를 설계합니다.
      참고: 본 연구에는 다음 조건이 사용되었습니다: 94분 동안 3°C; 30 사이클(94초 동안 30°C, 53초 동안 30°C, 68분 동안 3°C); 68 ° C에서 7 분 동안 A. tumefaciens AGL-1 (pCAMBIA1302)의 삶은 콜로니를 양성 대조군으로 사용하고 야생형 C. vulgaris 의 삶은 콜로니를 음성 대조군으로 사용하십시오.
  4. 생성된 단편16의 크기를 확인하기 위해 사다리(1Kbp DNA ladder, 재료 표 참조)와 함께 DNA 아가로스 겔 상에서 PCR 샘플을 실행한다.

5. 형질전환체의 형광 측정

  1. 200 mg/L-1 세포탁심 및 25 mg/L-1 히그로마이신 B가 보충된 50 mL의 TAP에 로그-상 유지 배양 또는 TAP 한천 경사로부터 각 형질전환체를 접종하여 시작 OD600 = 0.1이 되도록 한다. 야생형 C. vulgaris와 200mg/L-1 세포탁심만 음성 대조군으로 한 배양균을 접종합니다. 25°C에서 150 μmol/m2s의 광합성 활성 광을 사용하여 150 rpm에서 배양합니다(재료 표 참조).
  2. 24시간마다 300μL의 시료를 채취하여 96웰 플레이트 리더 또는 UV/Vis 분광계 및 형광계에서 흡광도 및 형광(여기 488nm, 방출 526nm)을 측정합니다( 재료 표 참조). 동시 측정을 위해 바닥이 투명한 검은색 플레이트를 사용하십시오.

6. 조단백질 추출, 단백질 정제 및 SDS-PAGE 전기영동

  1. 200mg/L-1 세포탁심 및 25mg/L-1 Hygromycin B가 보충된 300mL의 TAP에 log-phase 유지 배양액(#50)을 접종하여 OD680 = 0.1에 도달합니다. 야생형 C. vulgaris 와 200mg/L-1 세포탁심만 음성 대조군으로 한 배양균을 접종합니다. 25°C에서 150 rpm에서 150 μmol/m2s의 광합성 활성 광으로 배양합니다.
  2. 5mL 용해 완충액( 표 1 참조)을 사용하여 형질전환체(#50) 및 야생형 균주에서 조단백질 샘플을 추출한 후 4분 동안 초음파 처리를 수행합니다.
  3. 5mL 폴리프로필렌 컬럼을 통해 Ni-NTA 수지로 조단백질 시료를 정제합니다( 재료 표 참조).
  4. 15mL 정제된 단백질 샘플을 동결건조하고 SDS-PAGE 분석을 위해 1mL 용해 완충액에 재현탁시킵니다17.

결과

상기 방법을 사용하여 성공적인 형질전환을 보여주기 위해, C. vulgaris 는 pCAMBIA1302 플라스미드를 함유한 AGL-1 또는 플라스미드 없이 공동 배양하였다(야생형으로 Hygromycin B 및 cefotaxime이 보충된 TAP 한천에 도말하였다(그림 1A). 가장 왼쪽 플레이트는 Hygromycin B/cefotaxime 플레이트에서 성장할 수 있는 형질전환된 콜로니를 보여주고, 중간 플레이트는 야생형 AGL-1이 Hygromycin B/...

토론

변환의 효율성은 여러 가지 매개 변수와 관련이 있습니다. AMT에 사용되는 A. tumefaciens 균주의 선택은 매우 중요합니다. AGL-1은 발견된 가장 침습적인 균주 중 하나이며, 이러한 이유로 식물 AMT에서 일상적으로 사용되어 왔습니다. 유도 매체에 포도당(15-20mM)을 보충하는 것도 AMT 효율에 중요합니다. C. vulgaris 는 광영양 및 종속영양 조건 모두에서 자랄 수 있다는 점을 고려할 때, 포도당 ?...

공개

이해 상충은 선언되지 않았습니다.

감사의 말

저자들은 네덜란드 라이덴 대학교 라이덴 생물학 연구소(Institute of Biology Leiden, Leiden)에서 pCAMBIA1302 벡터와 Agrobacterium tumefaciens AGL1을 제공해준 Paul Hooykaas 교수에게 감사의 뜻을 전합니다. 저자들은 또한 형광 변환체를 성장시키는 데 도움을 준 Eva Colic에게 감사의 뜻을 전합니다. 이 연구는 캐나다 자연 과학 및 공학 연구 위원회(Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada)와 Mitacs Accelerate 프로그램의 지원을 받았습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
1 Kb Plus DNA ladderFroggaBioDM015
AcetosyringoneFisher ScientificD26665G
Agrobacterium tumefaciensGold BiotechnologiesStrain: AGL-1; Gift from Prof. Paul HooykaasGenotype: C58 RecA (RifR/CarbR) pTiBo542DT-DNA
BiotinEnzo Life Sciences89151-400
CaCl2·2H2OVWRBDH9224-1KG
CefotaximeAK ScientificJ90010
Chlorella vulgarisUniversity of Texas at Austin Culture Collection of AlgaeStrain: UTEX 395Wildtype strain
CoCl2·6H2OSigma AldrichC8661-25G
CuSO4·5H2OEMD MilliporeCX2185-1
FeCl3·6H2OVWRBDH9234-500G
Gene Pulser Xcell ElectroporatorBio-Rad1652662Main unit equipped with PC module.
GeneJET Plant Genome Purification KitThermo ScientificK0791
Glacial acetic acidVWRCABDH3093-2.2P
GlycerolBioBasicGB0232
HEPES BufferSigma AldrichH-3375
Hygromycin BFisher ScientificAAJ6068103
K2HPO4VWRBDH9266-500G
KanamycinGold BiotechnologiesK-250-25
KH2PO4VWRBDH9268-500G
MgSO4·7H2OVWR97062-134
MnCl2·4H2OJT BakerBAKR2540-01
Na2CO3VWRBDH7971-1
Na2EDTA·2H2OJT Baker8993-01
Na2MoO4·2H2OJT BakerBAKR3764-01
NaClVWRBDH7257-7
NaH2PO4 H2OMillipore SigmaCA80058-650
NaNO3 VWRBDH4574-500G
NEBExpress Ni ResinNewEngland BioLabsNEB #S1427
NH4ClVWRBDH9208-500G
pCAMBIA1302Leiden UniversityGift from Prof. Paul HooykaaspBR322, KanR, pVS1, T-DNA(CaMV 35S/HygR/CaMV polyA, CaMV 35S promoter/mgpf5-6xhis/NOS terminator)
Polypropylene Columns (5 mL)QIAGEN34964
Precision Plus Protein Unstained Protein Standards, Strep-tagged recombinant, 1 mLBio-Rad1610363
RifampicinMillipore SigmaR3501-1G
SunBlaster LED Strip Light 48 Inch SunBlaster210000000906
Synergy 4 Microplate UV/Vis spectrometer BioTEKS4MLFPTA
TetracyclineThermo Scientific ChemicalsCAAAJ61714-14
TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 12%Bio-Rad1610185
ThiamineTCI AmericaT0181-100G
Tris BaseFisher ScientificBP152-500
TryptoneBioBasicTG217(G211)
Vitamin B12 (cyanocobalamin)Enzo Life Sciences89151-436
Yeast ExtractBioBasicG0961
ZnSO4·7H2OJT Baker4382-01

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