Agrobacterium tumefaciens-Medited Genetic Engineering of Green Microalgae, Chlorella vulgaris (녹색 미세 조류, 클로렐라 심가리스의 Agrobacterium tumefaciens-Mediated Genetic Engineering of Green Microalgae, Chlorella vulgaris)

요약

이 프로토콜은 녹색 미세조류 클로렐라 심가리스(Chlorella vulgaris)의 핵 게놈에 관심 유전자를 통합하기 위한 Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation(AMT)의 활용을 간략하게 설명하여 안정적인 형질전환체를 생산합니다.

초록

Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation(AMT)은 식물 게놈을 조작하는 데 널리 사용되는 도구 역할을 합니다. 그러나 A. tumefaciens 는 다양한 종으로 유전자를 전달하는 능력을 나타냅니다. 수많은 미세조류 종은 관심 유전자를 핵 게놈에 안정적으로 통합하기 위한 잘 확립된 방법이 부족합니다. 미세조류 생명공학의 잠재적 이점을 활용하려면 간단하고 효율적인 게놈 조작 도구가 중요합니다. 본 명세서에서는 리포터 그린 형광 단백질(mGFP5) 및 히그로마이신 B에 대한 항생제 내성 마커를 이용하는 산업용 미세조류 종인 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris)에 대해 최적화된 AMT 프로토콜이 제시된다. 돌연변이체는 하이그로마이신 B 및 세포탁심(cefotaxime)을 함유하는 트리스-아세테이트-포스페이트(TAP) 배지 상의 도금을 통해 선택된다. mGFP5의 발현은 10세대 이상의 과배양 후 형광을 통해 정량화되며, 이는 T-DNA 카세트의 안정적인 형질전환을 나타냅니다. 이 프로토콜은 상업적으로 이용 가능한 pCAMBIA1302 식물 발현 벡터를 사용하여 2주 이내에 여러 형질전환 C. vulgaris 콜로니를 안정적으로 생성할 수 있습니다.

서문

그람 음성 토양 매개 박테리아인 Agrobacterium tumefaciens는 독특한 왕국 간 유전자 전달 능력을 가지고 있어 "자연 유전 공학자"라는 칭호를 얻었습니다.¹ 이 박테리아는 종양 유도 플라스미드(Ti-Plasmid)에서 Type IV 분비 시스템을 통해 숙주 세포로 DNA(T-DNA)를 전달하여 숙주 게놈 1,2,3,4 내에서 T-DNA의 통합 및 발현을 유도할 수 있습니다. 자연 환경에서 이 과정은 일반적으로 크라운 담즙 질환으로 알려진 식물의 종양 형성으로 이어집니다. 그러나 아그로박테리움은 T-DNA를 효모, 균류, 조류, 성게 배아, 심지어 실험실 조건 하에서 인간 세포를 포함한 다양한 다른 유기체로 옮길 수도 있다 5,6,7,8.

<....

프로토콜

달리 명시되지 않는 한 모든 매체와 용액은 사용하기 전에 고압멸균해야 합니다. 모든 원심분리기 튜브, 피펫 팁 등은 사용하기 전에 멸균 또는 고압멸균해야 합니다. 쉽게 참조할 수 있도록 이 프로토콜에 사용된 미디어 레시피는 표 1에 나열되어 있습니다.

1. A. tumefaciens 전기 능력 세포의 제조

1. 냉동 글리세롤 스톡에서 추출한 LB 배지(리팜피신 20mg/L-1 보충)가 담긴 25mL 멸균 셰이커 플라스크에 아그로박테리움(AGL-1)을 접종하고 28-30°C 및 150rpm에서 밤새 성장시킵니다.
   참고: Agrobacterium 균주 AGL-1은 리팜피신, 암피실린, 클로람페니콜 및 스트렙토마이신에 내성이 있으며 여러 공급업체에서 얻을 수 있습니다.
2. 다음날 50mL 오토클레이브 초순수에 야간 배양액 0.5μL를 첨가하여 배양액을 1,00,000배 희석하고 이 희석된 배양액 10μL를 LB 플레이트에 뿌린 다음 28-30°C에서 1-3일 동안 배양합니다.
3. 콜로니를 선택하고 28-30°C에서 리팜피신을 사용하여 LB에서 ....

토론

변환의 효율성은 여러 가지 매개 변수와 관련이 있습니다. AMT에 사용되는 A. tumefaciens 균주의 선택은 매우 중요합니다. AGL-1은 발견된 가장 침습적인 균주 중 하나이며, 이러한 이유로 식물 AMT에서 일상적으로 사용되어 왔습니다. 유도 매체에 포도당(15-20mM)을 보충하는 것도 AMT 효율에 중요합니다. C. vulgaris 는 광영양 및 종속영양 조건 모두에서 자랄 수 있다는 점을 고려할 때, 포도당 ?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 Kb Plus DNA ladder	FroggaBio	DM015
Acetosyringone	Fisher Scientific	D26665G
Agrobacterium tumefaciens	Gold Biotechnologies	Strain: AGL-1; Gift from Prof. Paul Hooykaas	Genotype: C58 RecA (RifR/CarbR) pTiBo542DT-DNA
Biotin	Enzo Life Sciences	89151-400
CaCl2·2H2O	VWR	BDH9224-1KG
Cefotaxime	AK Scientific	J90010
Chlorella vulgaris	University of Texas at Austin Culture Collection of Algae	Strain: UTEX 395	Wildtype strain
CoCl2·6H2O	Sigma Aldrich	C8661-25G
CuSO4·5H2O	EMD Millipore	CX2185-1
FeCl3·6H2O	VWR	BDH9234-500G
Gene Pulser Xcell Electroporator	Bio-Rad	1652662	Main unit equipped with PC module.
GeneJET Plant Genome Purification Kit	Thermo Scientific	K0791
Glacial acetic acid	VWR	CABDH3093-2.2P
Glycerol	BioBasic	GB0232
HEPES Buffer	Sigma Aldrich	H-3375
Hygromycin B	Fisher Scientific	AAJ6068103
K2HPO4	VWR	BDH9266-500G
Kanamycin	Gold Biotechnologies	K-250-25
KH2PO4	VWR	BDH9268-500G
MgSO4·7H2O	VWR	97062-134
MnCl2·4H2O	JT Baker	BAKR2540-01
Na2CO3	VWR	BDH7971-1
Na2EDTA·2H2O	JT Baker	8993-01
Na2MoO4·2H2O	JT Baker	BAKR3764-01
NaCl	VWR	BDH7257-7
NaH2PO4 H2O	Millipore Sigma	CA80058-650
NaNO3	VWR	BDH4574-500G
NEBExpress Ni Resin	NewEngland BioLabs	NEB #S1427
NH4Cl	VWR	BDH9208-500G
pCAMBIA1302	Leiden University	Gift from Prof. Paul Hooykaas	pBR322, KanR, pVS1, T-DNA(CaMV 35S/HygR/CaMV polyA, CaMV 35S promoter/mgpf5-6xhis/NOS terminator)
Polypropylene Columns (5 mL)	QIAGEN	34964
Precision Plus Protein Unstained Protein Standards, Strep-tagged recombinant, 1 mL	Bio-Rad	1610363
Rifampicin	Millipore Sigma	R3501-1G
SunBlaster LED Strip Light 48 Inch	SunBlaster	210000000906
Synergy 4 Microplate UV/Vis spectrometer	BioTEK	S4MLFPTA
Tetracycline	Thermo Scientific Chemicals	CAAAJ61714-14
TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 12%	Bio-Rad	1610185
Thiamine	TCI America	T0181-100G
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-500
Tryptone	BioBasic	TG217(G211)
Vitamin B12 (cyanocobalamin)	Enzo Life Sciences	89151-436
Yeast Extract	BioBasic	G0961
ZnSO4·7H2O	JT Baker	4382-01