Ingegneria genetica mediata da Agrobacterium tumefaciens di microalghe verdi, Chlorella vulgaris

Riepilogo

Questo protocollo delinea l'utilizzo della trasformazione mediata da Agrobacterium tumefaciens (AMT) per l'integrazione di geni di interesse nel genoma nucleare della microalga verde Chlorella vulgaris, portando alla produzione di trasformanti stabili.

Abstract

La trasformazione mediata dall'Agrobacterium tumefaciens (AMT) funge da strumento ampiamente utilizzato per manipolare i genomi delle piante. Tuttavia, A. tumefaciens mostra la capacità di trasferimento genico a una vasta gamma di specie. Numerose specie di microalghe non dispongono di metodi consolidati per integrare in modo affidabile i geni di interesse nel loro genoma nucleare. Per sfruttare i potenziali benefici della biotecnologia delle microalghe, sono fondamentali strumenti di manipolazione del genoma semplici ed efficienti. In questo articolo, viene presentato un protocollo AMT ottimizzato per la specie di microalghe industriali Chlorella vulgaris, utilizzando la proteina fluorescente verde reporter (mGFP5) e il marcatore di resistenza agli antibiotici per l'igromicina B. I mutanti sono selezionati attraverso la placcatura su terreni Tris-Acetato-Fosfato (TAP) contenenti igromicina B e cefotaxima. L'espressione di mGFP5 è quantificata tramite fluorescenza dopo oltre dieci generazioni di subcoltura, indicando la trasformazione stabile della cassetta T-DNA. Questo protocollo consente la generazione affidabile di più colonie transgeniche di C. vulgaris in meno di due settimane, impiegando il vettore di espressione vegetale pCAMBIA1302 disponibile in commercio.

Introduzione

L'Agrobacterium tumefaciens, un batterio gram-negativo trasmesso dal suolo, possiede una capacità unica di trasferimento genico tra regni, che gli è valsa il titolo di "ingegnere genetico naturale"¹. Questo batterio può trasferire il DNA (T-DNA) da un plasmide che induce il tumore (Ti-Plasmide) nelle cellule ospiti attraverso un sistema di secrezione di tipo IV, con conseguente integrazione ed espressione del T-DNA all'interno del genoma ospite 1,2,3,4. Nell'ambiente naturale, questo processo porta alla forma....

Protocollo

Tutti i terreni e le soluzioni devono essere sterilizzati in autoclave prima dell'uso, salvo diversa indicazione. Tutte le provette da centrifuga, i puntali delle pipette, ecc., devono essere sterili o sterilizzati in autoclave prima dell'uso. Per una facile consultazione, le ricette dei terreni utilizzati in questo protocollo sono elencate nella Tabella 1.

1. Preparazione di cellule elettrocompetenti di A. tumefaciens

1. Inoculare Agrobacterium (AGL-1) in un matraccio sterile da 25 mL di terreno LB (integrato con rifampicina, 20 mg/L-1) da una scorta di glicerolo congelato e far c....

Discussione

L'efficienza della trasformazione è associata a diversi parametri. La scelta dei ceppi di A. tumefaciens utilizzati per l'AMT è fondamentale. AGL-1 è uno dei ceppi più invasivi scoperti e, per questo motivo, è stato utilizzato abitualmente nell'AMT vegetale. Anche l'integrazione del mezzo di induzione con glucosio (15-20 mM) è importante per l'efficienza dell'AMT. Considerando che C. vulgaris può crescere sia in condizioni fototrofiche che eterotrofe, il glucosio o altre fonti di carbonio vengono.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 Kb Plus DNA ladder	FroggaBio	DM015
Acetosyringone	Fisher Scientific	D26665G
Agrobacterium tumefaciens	Gold Biotechnologies	Strain: AGL-1; Gift from Prof. Paul Hooykaas	Genotype: C58 RecA (RifR/CarbR) pTiBo542DT-DNA
Biotin	Enzo Life Sciences	89151-400
CaCl2·2H2O	VWR	BDH9224-1KG
Cefotaxime	AK Scientific	J90010
Chlorella vulgaris	University of Texas at Austin Culture Collection of Algae	Strain: UTEX 395	Wildtype strain
CoCl2·6H2O	Sigma Aldrich	C8661-25G
CuSO4·5H2O	EMD Millipore	CX2185-1
FeCl3·6H2O	VWR	BDH9234-500G
Gene Pulser Xcell Electroporator	Bio-Rad	1652662	Main unit equipped with PC module.
GeneJET Plant Genome Purification Kit	Thermo Scientific	K0791
Glacial acetic acid	VWR	CABDH3093-2.2P
Glycerol	BioBasic	GB0232
HEPES Buffer	Sigma Aldrich	H-3375
Hygromycin B	Fisher Scientific	AAJ6068103
K2HPO4	VWR	BDH9266-500G
Kanamycin	Gold Biotechnologies	K-250-25
KH2PO4	VWR	BDH9268-500G
MgSO4·7H2O	VWR	97062-134
MnCl2·4H2O	JT Baker	BAKR2540-01
Na2CO3	VWR	BDH7971-1
Na2EDTA·2H2O	JT Baker	8993-01
Na2MoO4·2H2O	JT Baker	BAKR3764-01
NaCl	VWR	BDH7257-7
NaH2PO4 H2O	Millipore Sigma	CA80058-650
NaNO3	VWR	BDH4574-500G
NEBExpress Ni Resin	NewEngland BioLabs	NEB #S1427
NH4Cl	VWR	BDH9208-500G
pCAMBIA1302	Leiden University	Gift from Prof. Paul Hooykaas	pBR322, KanR, pVS1, T-DNA(CaMV 35S/HygR/CaMV polyA, CaMV 35S promoter/mgpf5-6xhis/NOS terminator)
Polypropylene Columns (5 mL)	QIAGEN	34964
Precision Plus Protein Unstained Protein Standards, Strep-tagged recombinant, 1 mL	Bio-Rad	1610363
Rifampicin	Millipore Sigma	R3501-1G
SunBlaster LED Strip Light 48 Inch	SunBlaster	210000000906
Synergy 4 Microplate UV/Vis spectrometer	BioTEK	S4MLFPTA
Tetracycline	Thermo Scientific Chemicals	CAAAJ61714-14
TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 12%	Bio-Rad	1610185
Thiamine	TCI America	T0181-100G
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-500
Tryptone	BioBasic	TG217(G211)
Vitamin B12 (cyanocobalamin)	Enzo Life Sciences	89151-436
Yeast Extract	BioBasic	G0961
ZnSO4·7H2O	JT Baker	4382-01