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Resumo

Este protocolo descreve a utilização da transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens (AMT) para integrar gene(s) de interesse no genoma nuclear da microalga verde Chlorella vulgaris, levando à produção de transformantes estáveis.

Resumo

A transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens (AMT) serve como uma ferramenta amplamente empregada para manipular genomas de plantas. No entanto, A. tumefaciens exibe a capacidade de transferência gênica para diversas espécies. Numerosas espécies de microalgas carecem de métodos bem estabelecidos para integrar de forma confiável genes de interesse em seu genoma nuclear. Para aproveitar os benefícios potenciais da biotecnologia de microalgas, ferramentas simples e eficientes de manipulação do genoma são cruciais. Neste trabalho, um protocolo AMT otimizado é apresentado para a espécie de microalgas industriais Chlorella vulgaris, utilizando a proteína fluorescente verde repórter (mGFP5) e o marcador de resistência a antibióticos para Hygromycin B. Os mutantes são selecionados através de plaqueamento em meio Tris-Acetato-Fosfato (TAP) contendo Higromicina B e cefotaxima. A expressão de mGFP5 é quantificada via fluorescência após mais de dez gerações de subcultivo, indicando a transformação estável do de T-DNA. Este protocolo permite a geração confiável de múltiplas colônias transgênicas de C. vulgaris em menos de duas semanas, empregando o vetor de expressão vegetal pCAMBIA1302 comercialmente disponível.

Introdução

Agrobacterium tumefaciens, uma bactéria gram-negativa transmitida pelo solo, possui uma capacidade única de transferência de genes entre reinos, o que lhe rendeu o título de "engenheiro genético natural"1. Essa bactéria pode transferir DNA (T-DNA) de um plasmídeo indutor de tumor (Ti-Plasmid) para as células hospedeiras através de um sistema de secreção Tipo IV, resultando na integração e expressão do DNA-T no genoma do hospedeiro1,2,3,4. No ambiente natural, esse processo leva à formação de tumores em plantas, comumente conhecida como doença da galha da coroa. No entanto, a Agrobacterium também pode transferir o DNA-T para vários outros organismos, incluindo leveduras, fungos, algas, embriões de ouriço-do-mar e até mesmo células humanas em condições de laboratório 5,6,7,8.

Explorando este sistema natural, a transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens (AMT) permite a integração aleatória de gene(s) de interesse no genoma nuclear de uma célula hospedeira, modificando a região T-DNA do plasmídeo Ti. Para isso, um vetor de expressão de plantas AMT amplamente utilizado é o pCAMBIA13029. Os pesquisadores podem empregar fluxos de trabalho de clonagem simples em E. coli antes de transferir o vetor desejado para A. tumefaciens para posterior transferência para o hospedeiro de interesse.

As microalgas verdes são eucariotos que compartilham muitas semelhanças com as plantas terrestres, mas são altamente recalcitrantes à modificação genética. No entanto, a transformação genética desempenha um papel crucial na pesquisa fundamental e biotecnológica de microalgas. Em várias espécies de microalgas, particularmente Chlamydomonas reinhardtii, a transformação genética via AMT introduziu com sucesso transgenes como a interleucina-2 humana (hIL-2), o domínio de ligação ao receptor 2 da síndrome respiratória aguda grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2 RBD) e dois peptídeos antimicrobianos (AMPs)10,11,12,13. Dentre estas, Chlorella vulgaris, uma espécie de alga verde menos fastidiosa e de crescimento rápido, possui significativo potencial para a produção sustentável de carboidratos, proteínas, nutracêuticos, pigmentos e outros compostos de alto valor14. No entanto, a falta de ferramentas confiáveis para a criação de cepas transgênicas de C. vulgaris dificulta seu progresso comercial. Uma vez que há apenas um número limitado de trabalhos publicados utilizando AMT em C. vulgaris15, e dadas as diferenças consideráveis entre o cultivo de plantas e microalgas, a otimização do protocolo AMT torna-se essencial.

Neste estudo, os pesquisadores inseriram a proteína fluorescente verde (mGFP5) a jusante do promotor 35S do Cauliflower Mosaic Virus (CamV) e adicionaram uma etiqueta de histidina para usá-la como um gene repórter para a expressão da proteína. Os transformantes foram selecionados usando higromicina B e, após subcultivo por mais de vinte gerações, a transformação permaneceu estável. O plasmídeo pCAMBIA1302 empregado neste trabalho pode ser facilmente adaptado para conter qualquer gene de interesse. Além disso, o método e os materiais apresentados podem ser ajustados para outras espécies de algas verdes com um promotor CamV35S ativo, uma vez que este promotor é usado para a seleção de higromicina.

Protocolo

Todos os suportes e soluções devem ser autoclavados antes da utilização, salvo indicação em contrário. Todos os tubos de centrífuga, pontas de pipeta, etc., devem ser estéreis ou autoclavados antes do uso. Para facilitar a consulta, as receitas de mídia utilizadas neste protocolo estão listadas na Tabela 1.

1. Preparação de células eletrocompetentes de A. tumefaciens

  1. Inocular Agrobacterium (AGL-1) em um frasco de 25 mL de agitador estéril de meio LB (suplementado com rifampicina, 20 mg/L-1) a partir de um estoque congelado de glicerol e crescer durante a noite a 28-30 °C e 150 rpm.
    NOTA: A estirpe Agrobacterium AGL-1 é (ver Tabela de Materiais) resistente à rifampicina, ampicilina, cloranfenicol e estreptomicina e pode ser obtida de vários fornecedores.
  2. No dia seguinte, diluir a cultura em 1.00.000 vezes adicionando 0,5 μL da cultura noturna a 50 mL de água ultrapura autoclavada e espalhar 10 μL dessa cultura diluída em uma placa LB e, em seguida, incubar a 28-30 °C por 1-3 dias.
  3. Escolher uma colônia e iniciar uma cultura noturna de 20 mL em LB com rifampicina a 28-30 °C.
  4. No dia seguinte, inocular 500 mL de LB (sem antibiótico) em um frasco agitador com 9 mL da cultura noturna e crescer a 28-30 °C até que o OD600 atinja 0,5.
  5. Divida a cultura uniformemente em dez tubos de centrífuga de 50 mL e resfrie no gelo por 30 min. Pré-resfriar a centrífuga a 4 °C.
  6. Centrifugar os tubos a 4 °C e 4000 x g durante 15 min. Em seguida, remova o sobrenadante possível usando uma pipeta e ressuspenda o pellet em cada tubo em 50 mL de água gelada.
  7. Centrifugar as células a 4 °C e 4000 x g durante 15 min. Retire o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 25 mL de água gelada em cada tubo.
  8. Centrifugar as células a 4 °C e 4000 x g durante 15 min. Retire o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 1 mL de glicerol gelado a 10% (p/v) em cada tubo.
  9. Juntar todos os tubos num tubo de 50 ml e centrifugar as células a 4 °C e 4000 x g durante 15 minutos. Retire o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 400 μL de glicerol gelado a 10% (p/v). A concentração celular deve ser de cerca de 1-3 x 1010 células/mL.
  10. Distribuir as células como alíquotas de 50 μL em microtubos pré-resfriados estéreis. Congelar em azoto líquido e conservar num congelador de -80 °C.

2. Eletroporação de A. tumefaciens

  1. Adicionar 50 μL de células eletrocompetentes de AGL-1 A. tumefaciens a uma cubeta pré-refrigerada de 0,1 mm e adicionar 2 μL de pCAMBIA1302 ou plasmídeo similar (conc 15 ng/μL) (ver Tabela de Materiais).
  2. Electroporato a 2400 V utilizando um electroporator (200 Ω, extensor de capacitância 250 μFD, capacitância 25 μFD, decaimento exponencial, ver Tabela de Materiais). A constante de tempo deve ser de >4,5 ms para eletroporação bem-sucedida com decaimento exponencial.
  3. Adicione imediatamente 1 ml de meio LB à cubeta e pipete suavemente para cima e para baixo para misturar. Transfira o 1 mL de células ressuspensas para um microtubo de 1,5 mL e incube-o a 28-30 °C por pelo menos 1 h para se recuperar.
  4. Plaquear as células em ágar LB contendo o antibiótico apropriado (ou seja, 50 mg/L de canamicina para pCAMBIA1302 para seleção procariótica).
  5. Incubar a 28-30 °C durante 2-3 dias.
  6. Selecionar uma colônia, crescer durante a noite em LB com a seleção apropriada (50 mg/L de canamicina para pCAMBIA1302) e criopreservar a cepa contendo plasmídeo usando glicerol a 50% a -80 °C para uso futuro.

3. AMT de C. vulgaris

NOTA: Preparar as culturas de C. vulgaris (UTEX 395, ver Tabela de Materiais) e A. tumefaciens em paralelo para co-cultivo. As culturas de C. vulgaridevem ser iniciadas 3 dias antes do preparo das culturas de A. tumefaciens. O protocolo foi modificado com base no publicado por Kumar et al.7.

  1. Preparar a cultura de C. vulgaris
    1. C. vulgaris é tradicionalmente armazenada em inclinações ou mantida em culturas de fase logarítmica em condições iluminadas. A partir de uma cultura em fase logarítmica a OD600 = 1,0, espalhe 0,5 mL em placas de ágar Tris-Acetato-Fosfato (TAP, ver Tabela 1) ( 1,2% p/v ágar A) e cresça por 5 dias a 25 °C com iluminação (50 μE/m2s). Isso produzirá aproximadamente 5 x 106 células.
  2. Preparar a cultura de A. tumefaciens
    1. Cultivar A. tumefaciens AGL-1 pCAMBIA1302 em um frasco agitador inoculando 10 mL de meio LB suplementado com 15 mM de glicose, 20 mg/L de rifampicina e 50 mg/L de canamicina (ver Tabela de Materiais) usando o estoque de glicerol. Incubar a 28-30 °C e 250 rpm durante a noite.
    2. Inocular 1 mL de cultura noturna em 50 mL de LB com 15 mM de glicose, 20 mg/L de rifampicina e 50 mg/L de canamicina e incubar a 28-30 °C e 250 rpm até que o OD600 atinja 1,0.
  3. Cocultivar C. vulgaris e A. tumefaciens
    1. Para preparar a cultura de A. tumefaciens para o co-cultivo, transferir a cultura cultivada para um tubo de 50 mL e centrifugar a 4000 x g por 30 min à temperatura ambiente. Retire o sobrenadante com pipeta e lave as células duas vezes com o meio de indução.
      NOTA: O meio de indução utilizado é o meio TAP ajustado para pH 5,5 e suplementado com metais traços do meio F/2 e vitaminas com 200 μM de acetosirona (AS, ver Tabela de Materiais). Ressuspender as células em meios de indução de forma que OD600 = 0,5.
    2. Para preparar a cultura de C. vulgaris para co-cultivo, adicionar 25 mL de meio de indução à placa de C. vulgaris contendo ~ 5 x 106 células. Transfira para um tubo de 50 mL. Centrifugar as células a 4000 x g durante 15 min à temperatura ambiente e eliminar o sobrenadante.
    3. Misturar o pellet de células algais com 200 μL da suspensão bacteriana (OD600: 0,5) e incubá-los num agitador rotativo a 21-25 °C a 150 rpm durante 1 h.
    4. Espalhar a cultura mista (200 μL) em placas de indução suplementadas com 15 mM de glicose e incubar a 21-25 °C no escuro por 3 dias.
    5. Após 3 dias, utilizar 10 mL de meio TAP suplementado com 400 mg/L de cefotaxima ou 20 mg/L de tetraciclina (ver Tabela de Materiais) para coletar as microalgas e incubar no escuro a 21-25 °C por 2 dias para eliminar A. tumefaciens da cultura.
    6. Placa de 500 μL da cultura em meio seletivo, por exemplo, meio TAP suplementado com 20-70 mg/L de higromicina B (quando usando pCAMBIA1302) e 400 mg/L-1 de cefotaxima ou 20 mg/L de tetraciclina. Incubar 21-25 °C no escuro por 2 dias antes de colocá-los em uma câmara iluminada.
      NOTA: Colônias resistentes aparecerão 5-7 dias após a exposição à luz.
    7. Escolher colônias únicas da placa de transformação e re-estriá-las em placas de ágar TAP suplementadas com 400 mg/L de cefotaxima ou 20 mg/L de tetraciclina e 20-70 mg/L de higromicina B.

4. PCR de colônia (cPCR) para confirmar a integração gênica em transformadores de C. vulgaris

  1. Extrair DNA genômico de um transformador de C. vulgaris após subcultivo de pelo menos duas vezes de uma única colônia usando um kit de extração de DNA genômico vegetal (ver Tabela de Materiais). Usando isso como um modelo para PCR, projetam primers para a região mgfp5 do T-DNA (mgfp5-Fwd: 5' CCCATCTCATAAATAACGTC 3', e M13-Rev: 5' CAGGAAACAGCTATGAC 3').
    1. Usando um kit mestre de mistura de DNA polimerase de alta fidelidade Q5 (consulte Tabela de Materiais), realize a reação em cadeia da polimerase (PCR) para validar a integração transgênica.
      OBS: As seguintes condições foram utilizadas para o presente estudo: 98 °C por 3 min; 35 ciclos (98 °C por 10 s, 57 °C por 30 s, 72 °C por 1 min); 72 °C por 5min. Utilizar o pCAMBIA1302 como controle positivo e o DNA genômico selvagem de C. vulgaris como controle negativo.
  2. Para confirmar que não há pCAMBIA1302 presente na amostra devido à contaminação residual por A. tumefaciens, utilizar PCR de colônia. Adicionar uma pequena quantidade de células transformantes a 10 μL de água estéril e ferver a 98 °C durante 15 minutos. Use isso como um modelo para PCR.
    1. Primers de projeto para uma região fora do T-DNA em pCAMBIA1302 (B1-Fwd: 5'AGTAAAGGAGAAGAACTTTTC 3' e B1-Rev: 5'CCTGATGCGGTATTTTCTC 3').
      LEGENDA: As seguintes condições foram utilizadas para o presente estudo: 94 °C por 3 min; 30 ciclos (94 °C por 30 s, 48 °C por 30 s, 68 °C por 5 min); 68 °C por 7 min. Utilizar uma colônia fervida de A. tumefaciens AGL-1 (pCAMBIA1302) como controle positivo e uma colônia fervida de C. vulgaris selvagem como controle negativo.
  3. Para confirmar que não há contaminação por A. tumerfaciens presente na amostra, use PCR de colônia. Adicionar uma pequena quantidade de células transformantes a 10 μL de água estéril e ferver a 98 °C durante 15 minutos. Use isso como um modelo para PCR.
    1. Iniciar o projeto do gene virE2 contido no plasmídeo de virulência AGL-1 (virE2-Fwd: 5' AGGGAGCCCTACCCG 3' e virE2-Rev: 5' GAACCAGCCTGGAGTTCG 3').
      LEGENDA: As seguintes condições foram utilizadas para o presente estudo: 94 °C por 3 min; 30 ciclos (94 °C por 30 s, 53 °C por 30 s, 68 °C por 3 min); 68 °C por 7 min. Utilizar uma colônia fervida de A. tumefaciens AGL-1 (pCAMBIA1302) como controle positivo e uma colônia fervida de C. vulgaris selvagem como controle negativo.
  4. Executar amostras de PCR em um gel de DNA agarose juntamente com uma escada (escada de DNA de 1 Kbp, ver Tabela de Materiais) para confirmar o tamanho dos fragmentos resultantes16.

5. Medição da fluorescência de transformantes

  1. Inocular cada transformador a partir de uma cultura de manutenção log-fase ou ágar TAP inclinado em 50 mL de TAP suplementado com 200 mg/L-1 de cefotaxima e 25 mg/L-1 de higromicina B de tal forma que o OD inicialseja de 600 = 0,1. Inocular uma cultura com C. vulgaris selvagem e apenas 200 mg/L-1 de cefotaxima como controle negativo. Incubar a 25 °C a 150 rpm com 150 μmol/m2s de luz fotossinteticamente activa (ver Tabela de Materiais).
  2. A cada 24 h, pegue 300 μL de amostra e meça a absorbância e fluorescência (excitação 488 nm, emissão 526 nm) em um leitor de placas de 96 poços ou espectrômetro e fluorômetro UV/Vis (ver Tabela de Materiais). Use uma placa preta com fundo transparente para medições simultâneas.

6. Extração de proteína bruta, purificação de proteínas e eletroforese em SDS-PAGE

  1. Inocular o transformador (#50) de uma cultura de manutenção log-fase em 300 mL de TAP suplementado com 200 mg/L-1 de cefotaxima e 25 mg/L-1 de higromicina B para atingir o OD680 = 0,1. Inocular uma cultura com C. vulgaris selvagem e apenas 200 mg/L-1 de cefotaxima como controle negativo. Incubar a 25 °C a 150 rpm com 150 μmol/m2s de luz fotossinteticamente ativa.
  2. Extrair a amostra de proteína bruta do transformador (#50) e das estirpes selvagens utilizando 5 ml de tampão de lise (ver Tabela 1), seguido de sonicação durante 4 minutos.
  3. Purificar a amostra de proteína bruta com uma resina Ni-NTA através de colunas de polipropileno de 5 ml (ver Tabela de Materiais).
  4. Liofilizar as amostras de proteína purificada de 15 mL e ressuspendê-las em tampão de lise de 1 mL para análise de SDS-PAGE17.

Resultados

Para mostrar sucesso na transformação usando o método acima, C. vulgaris foi cocultivada com AGL-1 contendo o plasmídeo pCAMBIA1302 ou sem o plasmídeo (selvagem e plaqueado em ágar TAP suplementado com higromicina B e cefotaxima (Figura 1A). A placa mais à esquerda mostra as colônias transformadas capazes de crescer nas placas de higromicina B/cefotaxima, e a placa do meio mostra que a AGL-1 selvagem não pode crescer nas placas de higromicina B/cefotaxima. A placa mais à d...

Discussão

A eficiência da transformação está associada a vários parâmetros diferentes. A escolha das cepas de A. tumefaciens utilizadas para TMA é crucial. A AGL-1 é uma das cepas mais invasivas descobertas e, por esse motivo, tem sido rotineiramente utilizada em plantas AMT. A suplementação do meio de indução com glicose (15-20 mM) também é importante para a eficiência da AMT. Considerando que C. vulgaris pode crescer em condições fototróficas e heterotróficas, glicose ou outras fontes de carb...

Divulgações

Não foram declarados conflitos de interesse.

Agradecimentos

Os autores gostariam de agradecer ao Prof. Paul Hooykaas por gentilmente fornecer o vetor pCAMBIA1302 e Agrobacterium tumefaciens AGL1 do Instituto de Biologia de Leiden, Universidade de Leiden, Holanda. Os autores também gostariam de agradecer a Eva Colic por sua ajuda no crescimento dos transformantes fluorescentes. Este trabalho foi financiado pelo Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá e pelo programa Mitacs Acelerar.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
1 Kb Plus DNA ladderFroggaBioDM015
AcetosyringoneFisher ScientificD26665G
Agrobacterium tumefaciensGold BiotechnologiesStrain: AGL-1; Gift from Prof. Paul HooykaasGenotype: C58 RecA (RifR/CarbR) pTiBo542DT-DNA
BiotinEnzo Life Sciences89151-400
CaCl2·2H2OVWRBDH9224-1KG
CefotaximeAK ScientificJ90010
Chlorella vulgarisUniversity of Texas at Austin Culture Collection of AlgaeStrain: UTEX 395Wildtype strain
CoCl2·6H2OSigma AldrichC8661-25G
CuSO4·5H2OEMD MilliporeCX2185-1
FeCl3·6H2OVWRBDH9234-500G
Gene Pulser Xcell ElectroporatorBio-Rad1652662Main unit equipped with PC module.
GeneJET Plant Genome Purification KitThermo ScientificK0791
Glacial acetic acidVWRCABDH3093-2.2P
GlycerolBioBasicGB0232
HEPES BufferSigma AldrichH-3375
Hygromycin BFisher ScientificAAJ6068103
K2HPO4VWRBDH9266-500G
KanamycinGold BiotechnologiesK-250-25
KH2PO4VWRBDH9268-500G
MgSO4·7H2OVWR97062-134
MnCl2·4H2OJT BakerBAKR2540-01
Na2CO3VWRBDH7971-1
Na2EDTA·2H2OJT Baker8993-01
Na2MoO4·2H2OJT BakerBAKR3764-01
NaClVWRBDH7257-7
NaH2PO4 H2OMillipore SigmaCA80058-650
NaNO3 VWRBDH4574-500G
NEBExpress Ni ResinNewEngland BioLabsNEB #S1427
NH4ClVWRBDH9208-500G
pCAMBIA1302Leiden UniversityGift from Prof. Paul HooykaaspBR322, KanR, pVS1, T-DNA(CaMV 35S/HygR/CaMV polyA, CaMV 35S promoter/mgpf5-6xhis/NOS terminator)
Polypropylene Columns (5 mL)QIAGEN34964
Precision Plus Protein Unstained Protein Standards, Strep-tagged recombinant, 1 mLBio-Rad1610363
RifampicinMillipore SigmaR3501-1G
SunBlaster LED Strip Light 48 Inch SunBlaster210000000906
Synergy 4 Microplate UV/Vis spectrometer BioTEKS4MLFPTA
TetracyclineThermo Scientific ChemicalsCAAAJ61714-14
TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 12%Bio-Rad1610185
ThiamineTCI AmericaT0181-100G
Tris BaseFisher ScientificBP152-500
TryptoneBioBasicTG217(G211)
Vitamin B12 (cyanocobalamin)Enzo Life Sciences89151-436
Yeast ExtractBioBasicG0961
ZnSO4·7H2OJT Baker4382-01

Referências

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