Agrobacterium tumefaciens-Médié par le génie génétique des microalgues vertes, Chlorella vulgaris

Résumé

Ce protocole décrit l’utilisation de la transformation médiée par Agrobacterium tumefaciens (AMT) pour intégrer le(s) gène(s) d’intérêt dans le génome nucléaire de la microalgue verte Chlorella vulgaris, conduisant à la production de transformants stables.

Résumé

La transformation médiée par Agrobacterium tumefaciens (AMT) est un outil largement utilisé pour manipuler les génomes des plantes. Cependant, A. tumefaciens présente la capacité de transférer des gènes à un large éventail d’espèces. De nombreuses espèces de microalgues ne disposent pas de méthodes bien établies pour intégrer de manière fiable les gènes d’intérêt dans leur génome nucléaire. Pour exploiter les avantages potentiels de la biotechnologie des microalgues, des outils de manipulation du génome simples et efficaces sont essentiels. Dans ce document, un protocole AMT optimisé est présenté pour l’espèce de microalgue industrielle Chlorella vulgaris, en utilisant la protéine fluorescente verte rapporteuse (mGFP5) et le marqueur de résistance aux antibiotiques pour l’hygromycine B. Les mutants sont sélectionnés par placage sur un milieu de tris-acétate-phosphate (TAP) contenant de l’hygromycine B et du céfotaxime. L’expression de mGFP5 est quantifiée par fluorescence après plus de dix générations de sous-culture, ce qui indique la transformation stable de la cassette d’ADN-T. Ce protocole permet de générer de manière fiable plusieurs colonies transgéniques de C. vulgaris en moins de deux semaines, en utilisant le vecteur d’expression végétale pCAMBIA1302 disponible dans le commerce.

Introduction

Agrobacterium tumefaciens, une bactérie à Gram négatif transmise par le sol, possède une capacité unique de transfert de gènes entre règnes, ce qui lui a valu le titre d'« ingénieur génétique naturel »¹. Cette bactérie peut transférer l’ADN (ADN-T) d’un plasmide inducteur de tumeur (Ti-Plasmide) dans les cellules hôtes par le biais d’un système de sécrétion de type IV, ce qui entraîne l’intégration et l’expression de l’ADN-T dans le génome de l’hôte 1,2,3,4. Dans le cadre naturel, ce processus conduit à la formation de tumeurs chez les plantes, communément appelée maladie de la galle du collet. Cependant, Agrobacterium peut également transférer l’ADN-T dans divers autres organismes, y compris les levures, les champignons, les algues, les embryons d’oursins et même les cellules humaines dans des conditions de laboratoire 5,6,7,8.

Exploitant ce système naturel, la transformation médiée par Agrobacterium tumefaciens (AMT) permet l’intégration aléatoire de gènes d’intérêt dans le génome nucléaire d’une cellule hôte en modifiant la région de l’ADN-T du plasmide Ti. À cette fin, un vecteur d’expression de l’AMT largement utilisé est pCAMBIA1302⁹. Les chercheurs peuvent utiliser des processus de clonage simples chez E. coli avant de transférer le vecteur souhaité dans A. tumefaciens pour un transfert ultérieur à l’hôte d’intérêt.

Les microalgues vertes sont des eucaryotes qui partagent de nombreuses similitudes avec les plantes terrestres mais qui sont très récalcitrantes aux modifications génétiques. Cependant, la transformation génétique joue un rôle crucial dans la recherche fondamentale et biotechnologique sur les microalgues. Chez plusieurs espèces de microalgues, en particulier Chlamydomonas reinhardtii, la transformation génétique via l’AMT a permis d’introduire avec succès des transgènes tels que l’interleukine-2 humaine (hIL-2), le domaine de liaison au récepteur du coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SARS-CoV-2 RBD) et deux peptides antimicrobiens (AMP)^10,11,12,13. Parmi celles-ci, Chlorella vulgaris, une espèce d’algue verte moins exigeante et à croissance rapide, présente un potentiel important pour la production durable de glucides, de protéines, de nutraceutiques, de pigments et d’autres composés de grande valeur¹⁴. Cependant, le manque d’outils fiables pour créer des souches transgéniques de C. vulgaris entrave son progrès commercial. Étant donné qu’il n’y a eu qu’un nombre limité de travaux publiés utilisant l’AMT chez C. vulgaris¹⁵, et compte tenu des différences considérables entre la culture des plantes et celle des microalgues, l’optimisation du protocole AMT devient essentielle.

Dans cette étude, les chercheurs ont inséré une protéine fluorescente verte (mGFP5) en aval du promoteur 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur (CamV) et ont ajouté un marqueur d’histidine pour l’utiliser comme gène rapporteur pour l’expression des protéines. Les transformants ont été sélectionnés à l’aide de l’hygromycine B, et après une sous-culture pendant plus de vingt générations, la transformation est restée stable. Le plasmide pCAMBIA1302 utilisé dans ce travail peut être facilement adapté pour contenir n’importe quel gène d’intérêt. De plus, la méthode et les matériaux présentés peuvent être ajustés pour d’autres espèces d’algues vertes avec un promoteur actif CamV35S, car ce promoteur est utilisé pour la sélection de l’hygromycine.

Protocole

Tous les milieux et solutions doivent être autoclavés avant utilisation, sauf indication contraire. Tous les tubes à centrifuger, les pointes de pipette, etc., doivent être stériles ou autoclavés avant utilisation. Pour faciliter la consultation, les recettes de médias utilisées dans ce protocole sont répertoriées dans le tableau 1.

1. Préparation des cellules électrocompétentes d’A. tumefaciens

1. Inoculer Agrobacterium (AGL-1) dans un flacon agitateur stérile de 25 mL de milieu LB (supplémenté en rifampicine, 20 mg/L-1) à partir d’un stock de glycérol congelé et cultiver pendant la nuit à ^28-30 °C et 150 tr/min.
   REMARQUE : La souche AGL-1 d’Agrobacterium est (voir le tableau des matériaux) résistante à la rifampicine, à l’ampicilline, au chloramphénicol et à la streptomycine et peut être obtenue auprès de plusieurs fournisseurs.
2. Le lendemain, diluez la culture 1 00 000 fois en ajoutant 0,5 μL de la culture de nuit à 50 mL d’eau ultra-pure autoclavée et étalez 10 μL de cette culture diluée sur une plaque LB, puis incubez à 28-30 °C pendant 1 à 3 jours.
3. Choisissez une colonie et commencez une culture de nuit de 20 ml dans LB avec de la rifampicine à 28-30 °C.
4. Le lendemain, inoculer 500 mL de milieu LB (sans antibiotique) dans un flacon shaker avec 9 mL de culture de nuit et cultiver à 28-30 °C jusqu’à ce que la OD₆₀₀ atteigne 0,5.
5. Répartir la culture uniformément dans dix tubes à centrifuger de 50 ml et laisser refroidir sur de la glace pendant 30 minutes. Pré-refroidir la centrifugeuse à 4 °C.
6. Centrifuger les tubes à 4 °C et 4000 x g pendant 15 min. Par la suite, retirez le plus de surnageant possible à l’aide d’une pipette et remettez en suspension la pastille dans chaque tube dans 50 ml d’eau glacée.
7. Centrifuger les cellules à 4 °C et 4000 x g pendant 15 min. Retirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 25 mL d’eau glacée dans chaque tube.
8. Centrifuger les cellules à 4 °C et 4000 x g pendant 15 min. Retirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 1 mL de glycérol glacé à 10 % (p/v) dans chaque tube.
9. Combinez tous les tubes en un tube de 50 mL et centrifugez les cellules à 4 °C et 4000 x g pendant 15 min. Retirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 400 μL de glycérol glacé à 10 % (p/v). La concentration cellulaire doit être d’environ 1-3 x^{10 10} cellules/mL.
10. Répartir les cellules sous forme d’aliquotes de 50 μL dans des microtubes stériles préréfrigérés. Congeler dans de l’azote liquide et conserver au congélateur à -80 °C.

2. Électroporation d’A. tumefaciens

1. Ajouter 50 μL de cellules électrocompétentes AGL-1 A. tumefaciens dans une cuvette prérefroidie de 0,1 mm et ajouter 2 μL de pCAMBIA1302 ou de plasmide similaire (conc 15 ng/μL) (voir le tableau des matériaux).
2. Électroporer à 2400 V à l’aide d’un électroporateur (200 Ω, prolongateur de capacité 250 μFD, capacité 25 μFD, décroissance exponentielle, voir tableau des matériaux). La constante de temps doit être de >4,5 ms pour une électroporation réussie avec une décroissance exponentielle.
3. Ajouter immédiatement 1 mL de milieu LB dans la cuvette et pipeter doucement de haut en bas pour mélanger. Transférez 1 mL de cellules remises en suspension dans un microtube de 1,5 mL et incubez-le à 28-30 °C pendant au moins 1 h pour qu’il se rétablisse.
4. Plaquer les cellules sur de la gélose LB contenant l’antibiotique approprié (c.-à-d. 50 mg/L de kanamycine pour la pCAMBIA1302 pour la sélection procaryote).
5. Incuber à 28-30 °C pendant 2-3 jours.
6. Sélectionner une colonie, la cultiver pendant la nuit en LB avec la sélection appropriée (50 mg/L de kanamycine pour pCAMBIA1302) et cryoconserver la souche contenant le plasmide en utilisant 50 % de glycérol à -80 °C pour une utilisation future.

3. AMT de C. vulgaris

NOTE : Préparer les cultures de C. vulgaris (UTEX 395, voir le tableau des matériaux) et d’A. tumefaciens en parallèle pour la coculture. Les cultures de C. vulgaridoivent être commencées 3 jours avant la préparation des cultures d’A. tumefaciens. Le protocole a été modifié sur la base de celui publié par Kumar et ^al.7.

1. Préparer la culture de C. vulgaris
   1. C. vulgaris est traditionnellement entreposé en biais ou maintenu dans des cultures en phase logarithmique dans des conditions éclairées. À partir d’une culture en phase logarithmique à_{OD 600} = 1,0, étaler 0,5 mL sur une gélose au tris-acétate-phosphate (TAP, voir tableau 1) ( 1,2 % p/v gélose A) et laisser pousser pendant 5 jours à 25 °C avec éclairage (50 μE/m²s). Cela donnera environ 5 x 10⁶ cellules.
2. Préparer la culture d’A. tumefaciens
   1. Cultiver la souche AGL-1 pCAMBIA1302 d’A. tumefaciens dans un ballon agitateur en inoculant 10 mL de milieu LB additionné de 15 mM de glucose, 20 mg/L de rifampicine et 50 mg/L de kanamycine (voir le tableau des matériaux) à l’aide du stock de glycérol. Incuber à 28-30 °C et 250 tr/min pendant la nuit.
   2. Inoculer 1 mL de culture de nuit dans 50 mL de LB avec 15 mM de glucose, 20 mg/L de rifampicine et 50 mg/L de kanamycine et incuber à 28-30 °C et 250 tr/min jusqu’à ce que la DO₆₀₀ atteigne 1,0.
3. Cocultiver C. vulgaris et A. tumefaciens
   1. Pour préparer la culture d’A. tumefaciens à la co-culture, transvaser la culture cultivée dans un tube de 50 mL et centrifuger à 4000 x g pendant 30 min à température ambiante. Retirez le surnageant à l’aide d’une pipette et lavez les cellules deux fois avec le milieu d’induction.
      REMARQUE : Le milieu d’induction utilisé est un milieu TAP ajusté à un pH de 5,5 et complété par des métaux traces moyens F/2 et des vitamines avec 200 μM d’acétosyringone (AS, voir le tableau des matériaux). Remettre les cellules en suspension dans un milieu d’induction tel que OD₆₀₀ = 0,5.
   2. Pour préparer la culture de C. vulgaris en vue de la coculture, ajouter 25 mL de milieu d’induction dans la plaque de C. vulgaris contenant ~ 5 x 10⁶ cellules. Transférer dans un tube de 50 ml. Centrifuger les cellules à 4000 x g pendant 15 min à température ambiante et jeter le surnageant.
   3. Mélanger la pastille de cellules d’algues avec 200 μL de suspension bactérienne (OD₆₀₀ : 0,5) et les incuber dans un agitateur rotatif à 21-25 °C à 150 tr/min pendant 1 h.
   4. Étaler la culture mixte (200 μL) sur des plaques de milieu d’induction additionnées de 15 mM de glucose et incuber à 21-25 °C dans l’obscurité pendant 3 jours.
   5. Après 3 jours, utiliser 10 mL de milieu TAP additionné de 400 mg/L de céfotaxime ou de 20 mg/L de tétracycline (voir le tableau des matériaux) pour recueillir les microalgues et incuber dans l’obscurité à 21-25 °C pendant 2 jours afin d’éliminer A. tumefaciens de la culture.
   6. Plaquer 500 μL de la culture sur un milieu sélectif, par exemple un milieu TAP complété par 20 à 70 mg/L d’hygromycine B (en cas d’utilisation de pCAMBIA1302) et 400 mg^/L-1 de céfotaxime ou 20 mg/L de tétracycline. Incubez-les à 21-25 °C dans l’obscurité pendant 2 jours avant de les placer dans une chambre éclairée.
      REMARQUE : Les colonies résistantes apparaîtront 5 à 7 jours après l’exposition à la lumière.
   7. Prélever des colonies individuelles dans la plaque de transformation et les rééstrier sur des plaques de gélose TAP additionnées de 400 mg/L de céfotaxime ou de 20 mg/L de tétracycline et de 20 à 70 mg/L d’hygromycine B.

4. PCR de colonie (cPCR) pour confirmer l’intégration des gènes chez les transformants de C. vulgaris

1. Extraire l’ADN génomique d’un transformant de C. vulgaris après avoir été sous-cultivé au moins deux fois à partir d’une seule colonie à l’aide d’une trousse d’extraction d’ADN génomique végétal (voir le tableau des matériaux). À l’aide de ce modèle pour la PCR, concevez des amorces pour la région mgfp5 de l’ADN-T (mgfp5-Fwd : 5' CCCATCTCATAAATAACGTC 3' et M13-Rev : 5' CAGGAAACAGCTATGAC 3').
   1. À l’aide d’un kit de mélange maître d’ADN polymérase haute fidélité Q5 (voir le tableau des matériaux), effectuer une réaction en chaîne par polymérase (PCR) pour valider l’intégration du transgène.
      NOTE : Les conditions suivantes ont été utilisées pour la présente étude : 98 °C pendant 3 min ; 35 cycles (98 °C pendant 10 s, 57 °C pendant 30 s, 72 °C pendant 1 min) ; 72 °C pendant 5min. Utiliser pCAMBIA1302 comme témoin positif et l’ADN génomique de C. vulgaris de type sauvage comme témoin négatif.
2. Pour confirmer qu’il n’y a pas de pCAMBIA1302 présent dans l’échantillon en raison d’une contamination résiduelle par A. tumefaciens, utiliser la PCR de colonie. Ajouter une petite quantité de cellules transformantes à 10 μL d’eau stérile et faire bouillir à 98 °C pendant 15 min. Utilisez-le comme modèle pour la PCR.
   1. Amorces de conception pour une région à l’extérieur de l’ADN-T sur pCAMBIA1302 (B1-Fwd : 5'AGTAAAGGAGAAGAACTTTTC 3' et B1-Rev : 5'CCTGATGCGGTATTTTCTC 3').
      NOTE : Les conditions suivantes ont été utilisées pour la présente étude : 94 °C pendant 3 min ; 30 cycles (94 °C pendant 30 s, 48 °C pendant 30 s, 68 °C pendant 5 min) ; 68 °C pendant 7 min. Utiliser une colonie bouillie d’A. tumefaciens AGL-1 (pCAMBIA1302) comme témoin positif et une colonie bouillie de C. vulgaris de type sauvage comme témoin négatif.
3. Pour confirmer qu’il n’y a pas de contamination par A. tumerfaciens dans l’échantillon, utilisez la PCR de la colonie. Ajouter une petite quantité de cellules transformantes à 10 μL d’eau stérile et faire bouillir à 98 °C pendant 15 min. Utilisez-le comme modèle pour la PCR.
   1. Amorces de conception pour le gène virE2 contenu sur le plasmide de virulence AGL-1 (virE2-Fwd : 5' AGGGAGCCCTACCCG 3' et virE2-Rev : 5' GAACCAGCCTGGAGTTCG 3').
      NOTE : Les conditions suivantes ont été utilisées pour la présente étude : 94 °C pendant 3 min ; 30 cycles (94 °C pendant 30 s, 53 °C pendant 30 s, 68 °C pendant 3 min) ; 68 °C pendant 7 min. Utiliser une colonie bouillie d’A. tumefaciens AGL-1 (pCAMBIA1302) comme témoin positif et une colonie bouillie de C. vulgaris de type sauvage comme témoin négatif.
4. Effectuer des prélèvements PCR sur un gel d’ADN d’agarose avec une échelle (échelle d’ADN de 1 Kbp, voir le tableau des matériaux) pour confirmer la taille des fragments obtenus¹⁶.

5. Mesure de la fluorescence des transformants

1. Inoculer chaque transformant à partir d’une culture d’entretien en phase logarithmique ou d’une gélose TAP oblique dans 50 mL de TAP additionné de 200 mg/L-1 de céfotaxime et de 25 mg^/L-1 d’hygromycine B de sorte que la DO de départ₆₀₀ = 0,1. Inoculer une culture avec le C. vulgaris de type sauvage et seulement 200 mg/^L-1 de céfotaxime comme témoin négatif. Incuber à 25 °C à 150 tr/min avec 150 μmol/m²s de lumière photosynthétiquement active (voir tableau des matériaux).
2. Toutes les 24 h, prélever un échantillon de 300 μL et mesurer l’absorbance et la fluorescence (excitation 488 nm, émission 526 nm) dans un lecteur de plaques à 96 puits ou un spectromètre UV/Vis et un fluorimètre (voir Tableau des matériaux). Utilisez une plaque noire avec un fond transparent pour des mesures simultanées.

6. Extraction de protéines brutes, purification de protéines et électrophorèse SDS-PAGE

1. Inoculer le transformant (#50) d’une culture d’entretien en phase logarithmique dans 300 mL de TAP additionné de 200 mg/L-1 de céfotaxime et de 25 mg^/L-1 d’hygromycine B pour atteindre la DO₆₈₀ = ^0,1. Inoculer une culture avec le C. vulgaris de type sauvage et seulement 200 mg/^L-1 de céfotaxime comme témoin négatif. Incuber à 25 °C à 150 tr/min avec 150 μmol/m²s de lumière photosynthétiquement active.
2. Extraire l’échantillon de protéines brutes des souches transformantes (#50) et sauvages à l’aide d’un tampon de lyse de 5 mL (voir le tableau 1), suivi d’une sonication pendant 4 minutes.
3. Purifier l’échantillon de protéines brutes à l’aide d’une résine Ni-NTA à travers des colonnes de polypropylène de 5 ml (voir le tableau des matériaux).
4. Lyophiliser les échantillons de protéines purifiées de 15 mL et les remettre en suspension dans un tampon de lyse de 1 mL pour l’analyse SDS-PAGE¹⁷.

Résultats

Pour montrer la réussite de la transformation à l’aide de la méthode ci-dessus, C. vulgaris a été cocultivé avec AGL-1 contenant le plasmide pCAMBIA1302 ou sans le plasmide (de type sauvage et plaqué sur gélose TAP complétée par de l’hygromycine B et du céfotaxime (Figure 1A). La plaque la plus à gauche montre les colonies transformées capables de se développer sur les plaques d’hygromycine B/céfotaxime, et la plaque du milieu montre que l’AGL-1 de type sauvag...

Discussion

L’efficacité de la transformation est associée à plusieurs paramètres différents. Le choix des souches d’A. tumefaciens utilisées pour l’AMT est crucial. L’AGL-1 est l’une des souches les plus invasives découvertes et, pour cette raison, a été couramment utilisée dans l’AMT des plantes. La supplémentation du milieu d’induction avec du glucose (15-20 mM) est également importante pour l’efficacité de l’AMT. Étant donné que C. vulgaris peut se développer dans des condition...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 Kb Plus DNA ladder	FroggaBio	DM015
Acetosyringone	Fisher Scientific	D26665G
Agrobacterium tumefaciens	Gold Biotechnologies	Strain: AGL-1; Gift from Prof. Paul Hooykaas	Genotype: C58 RecA (RifR/CarbR) pTiBo542DT-DNA
Biotin	Enzo Life Sciences	89151-400
CaCl2·2H2O	VWR	BDH9224-1KG
Cefotaxime	AK Scientific	J90010
Chlorella vulgaris	University of Texas at Austin Culture Collection of Algae	Strain: UTEX 395	Wildtype strain
CoCl2·6H2O	Sigma Aldrich	C8661-25G
CuSO4·5H2O	EMD Millipore	CX2185-1
FeCl3·6H2O	VWR	BDH9234-500G
Gene Pulser Xcell Electroporator	Bio-Rad	1652662	Main unit equipped with PC module.
GeneJET Plant Genome Purification Kit	Thermo Scientific	K0791
Glacial acetic acid	VWR	CABDH3093-2.2P
Glycerol	BioBasic	GB0232
HEPES Buffer	Sigma Aldrich	H-3375
Hygromycin B	Fisher Scientific	AAJ6068103
K2HPO4	VWR	BDH9266-500G
Kanamycin	Gold Biotechnologies	K-250-25
KH2PO4	VWR	BDH9268-500G
MgSO4·7H2O	VWR	97062-134
MnCl2·4H2O	JT Baker	BAKR2540-01
Na2CO3	VWR	BDH7971-1
Na2EDTA·2H2O	JT Baker	8993-01
Na2MoO4·2H2O	JT Baker	BAKR3764-01
NaCl	VWR	BDH7257-7
NaH2PO4 H2O	Millipore Sigma	CA80058-650
NaNO3	VWR	BDH4574-500G
NEBExpress Ni Resin	NewEngland BioLabs	NEB #S1427
NH4Cl	VWR	BDH9208-500G
pCAMBIA1302	Leiden University	Gift from Prof. Paul Hooykaas	pBR322, KanR, pVS1, T-DNA(CaMV 35S/HygR/CaMV polyA, CaMV 35S promoter/mgpf5-6xhis/NOS terminator)
Polypropylene Columns (5 mL)	QIAGEN	34964
Precision Plus Protein Unstained Protein Standards, Strep-tagged recombinant, 1 mL	Bio-Rad	1610363
Rifampicin	Millipore Sigma	R3501-1G
SunBlaster LED Strip Light 48 Inch	SunBlaster	210000000906
Synergy 4 Microplate UV/Vis spectrometer	BioTEK	S4MLFPTA
Tetracycline	Thermo Scientific Chemicals	CAAAJ61714-14
TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 12%	Bio-Rad	1610185
Thiamine	TCI America	T0181-100G
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-500
Tryptone	BioBasic	TG217(G211)
Vitamin B12 (cyanocobalamin)	Enzo Life Sciences	89151-436
Yeast Extract	BioBasic	G0961
ZnSO4·7H2O	JT Baker	4382-01