Agrobacterium tumefaciens-Médié par le génie génétique des microalgues vertes, Chlorella vulgaris

Résumé

Ce protocole décrit l’utilisation de la transformation médiée par Agrobacterium tumefaciens (AMT) pour intégrer le(s) gène(s) d’intérêt dans le génome nucléaire de la microalgue verte Chlorella vulgaris, conduisant à la production de transformants stables.

Résumé

La transformation médiée par Agrobacterium tumefaciens (AMT) est un outil largement utilisé pour manipuler les génomes des plantes. Cependant, A. tumefaciens présente la capacité de transférer des gènes à un large éventail d’espèces. De nombreuses espèces de microalgues ne disposent pas de méthodes bien établies pour intégrer de manière fiable les gènes d’intérêt dans leur génome nucléaire. Pour exploiter les avantages potentiels de la biotechnologie des microalgues, des outils de manipulation du génome simples et efficaces sont essentiels. Dans ce document, un protocole AMT optimisé est présenté pour l’espèce de microalgue industrielle Chlorella vulgaris, en utilisant la protéine fluorescente verte rapporteuse (mGFP5) et le marqueur de résistance aux antibiotiques pour l’hygromycine B. Les mutants sont sélectionnés par placage sur un milieu de tris-acétate-phosphate (TAP) contenant de l’hygromycine B et du céfotaxime. L’expression de mGFP5 est quantifiée par fluorescence après plus de dix générations de sous-culture, ce qui indique la transformation stable de la cassette d’ADN-T. Ce protocole permet de générer de manière fiable plusieurs colonies transgéniques de C. vulgaris en moins de deux semaines, en utilisant le vecteur d’expression végétale pCAMBIA1302 disponible dans le commerce.

Introduction

Agrobacterium tumefaciens, une bactérie à Gram négatif transmise par le sol, possède une capacité unique de transfert de gènes entre règnes, ce qui lui a valu le titre d'« ingénieur génétique naturel »¹. Cette bactérie peut transférer l’ADN (ADN-T) d’un plasmide inducteur de tumeur (Ti-Plasmide) dans les cellules hôtes par le biais d’un système de sécrétion de type IV, ce qui entraîne l’intégration et l’expression de l’ADN-T dans le génome de l’hôte 1,2,3,4. Dans le cadre naturel, ce processus conduit à la fo....

Protocole

Tous les milieux et solutions doivent être autoclavés avant utilisation, sauf indication contraire. Tous les tubes à centrifuger, les pointes de pipette, etc., doivent être stériles ou autoclavés avant utilisation. Pour faciliter la consultation, les recettes de médias utilisées dans ce protocole sont répertoriées dans le tableau 1.

1. Préparation des cellules électrocompétentes d’A. tumefaciens

1. Inoculer Agrobacterium (AGL-1) dans un flacon agitateur stérile de 25 mL de milieu LB (supplémenté en rifampicine, 20 mg/L-1) à partir d’un stock de glycérol congelé et cultiver pendant ....

Discussion

L’efficacité de la transformation est associée à plusieurs paramètres différents. Le choix des souches d’A. tumefaciens utilisées pour l’AMT est crucial. L’AGL-1 est l’une des souches les plus invasives découvertes et, pour cette raison, a été couramment utilisée dans l’AMT des plantes. La supplémentation du milieu d’induction avec du glucose (15-20 mM) est également importante pour l’efficacité de l’AMT. Étant donné que C. vulgaris peut se développer dans des condition.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 Kb Plus DNA ladder	FroggaBio	DM015
Acetosyringone	Fisher Scientific	D26665G
Agrobacterium tumefaciens	Gold Biotechnologies	Strain: AGL-1; Gift from Prof. Paul Hooykaas	Genotype: C58 RecA (RifR/CarbR) pTiBo542DT-DNA
Biotin	Enzo Life Sciences	89151-400
CaCl2·2H2O	VWR	BDH9224-1KG
Cefotaxime	AK Scientific	J90010
Chlorella vulgaris	University of Texas at Austin Culture Collection of Algae	Strain: UTEX 395	Wildtype strain
CoCl2·6H2O	Sigma Aldrich	C8661-25G
CuSO4·5H2O	EMD Millipore	CX2185-1
FeCl3·6H2O	VWR	BDH9234-500G
Gene Pulser Xcell Electroporator	Bio-Rad	1652662	Main unit equipped with PC module.
GeneJET Plant Genome Purification Kit	Thermo Scientific	K0791
Glacial acetic acid	VWR	CABDH3093-2.2P
Glycerol	BioBasic	GB0232
HEPES Buffer	Sigma Aldrich	H-3375
Hygromycin B	Fisher Scientific	AAJ6068103
K2HPO4	VWR	BDH9266-500G
Kanamycin	Gold Biotechnologies	K-250-25
KH2PO4	VWR	BDH9268-500G
MgSO4·7H2O	VWR	97062-134
MnCl2·4H2O	JT Baker	BAKR2540-01
Na2CO3	VWR	BDH7971-1
Na2EDTA·2H2O	JT Baker	8993-01
Na2MoO4·2H2O	JT Baker	BAKR3764-01
NaCl	VWR	BDH7257-7
NaH2PO4 H2O	Millipore Sigma	CA80058-650
NaNO3	VWR	BDH4574-500G
NEBExpress Ni Resin	NewEngland BioLabs	NEB #S1427
NH4Cl	VWR	BDH9208-500G
pCAMBIA1302	Leiden University	Gift from Prof. Paul Hooykaas	pBR322, KanR, pVS1, T-DNA(CaMV 35S/HygR/CaMV polyA, CaMV 35S promoter/mgpf5-6xhis/NOS terminator)
Polypropylene Columns (5 mL)	QIAGEN	34964
Precision Plus Protein Unstained Protein Standards, Strep-tagged recombinant, 1 mL	Bio-Rad	1610363
Rifampicin	Millipore Sigma	R3501-1G
SunBlaster LED Strip Light 48 Inch	SunBlaster	210000000906
Synergy 4 Microplate UV/Vis spectrometer	BioTEK	S4MLFPTA
Tetracycline	Thermo Scientific Chemicals	CAAAJ61714-14
TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 12%	Bio-Rad	1610185
Thiamine	TCI America	T0181-100G
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-500
Tryptone	BioBasic	TG217(G211)
Vitamin B12 (cyanocobalamin)	Enzo Life Sciences	89151-436
Yeast Extract	BioBasic	G0961
ZnSO4·7H2O	JT Baker	4382-01