Agrobacterium tumefaciens-vermittelte Gentechnik von Grünen Mikroalgen, Chlorella vulgaris

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Nutzung der Agrobacterium tumefaciens-vermittelten Transformation (AMT) zur Integration von Genen von Interesse in das Kerngenom der grünen Mikroalge Chlorella vulgaris, was zur Produktion stabiler Transformanten führt.

Zusammenfassung

Die Agrobacterium tumefaciens-vermittelte Transformation (AMT) dient als weit verbreitetes Werkzeug zur Manipulation von Pflanzengenomen. A. tumefaciens weist jedoch die Fähigkeit auf, Gene auf eine Vielzahl von Arten zu übertragen. Zahlreichen Mikroalgenarten fehlen etablierte Methoden, um interessante Gene zuverlässig in ihr Kerngenom zu integrieren. Um die potenziellen Vorteile der Mikroalgenbiotechnologie zu nutzen, sind einfache und effiziente Werkzeuge zur Genommanipulation von entscheidender Bedeutung. In dieser Arbeit wird ein optimiertes AMT-Protokoll für die industrielle Mikroalgenart Chlorella vulgaris vorgestellt, das das grün fluoreszierende Reporterprotein (mGFP5) und den Antibiotikaresistenzmarker für Hygromycin B verwendet. Mutanten werden durch Plattierung auf Tris-Acetat-Phosphat (TAP)-Medien ausgewählt, die Hygromycin B und Cefotaxim enthalten. Die Expression von mGFP5 wird nach über zehn Generationen der Subkultivierung mittels Fluoreszenz quantifiziert, was auf eine stabile Transformation der T-DNA-Kassette hinweist. Dieses Protokoll ermöglicht die zuverlässige Generierung mehrerer transgener C. vulgaris-Kolonien in weniger als zwei Wochen unter Verwendung des kommerziell erhältlichen Pflanzenexpressionsvektors pCAMBIA1302.

Einleitung

Agrobacterium tumefaciens, ein gramnegatives bodenbürtiges Bakterium, besitzt eine einzigartige Fähigkeit zum Gentransfer zwischen den Königreichen, was ihm den Titel "natürlicher Gentechniker"¹ eingebracht hat. Dieses Bakterium kann DNA (T-DNA) von einem tumorinduzierenden Plasmid (Ti-Plasmid) über ein Typ-IV-Sekretionssystem in Wirtszellen übertragen, was zur Integration und Expression der T-DNA in das Wirtsgenom führt 1,2,3,4. In der Natur führt dieser Prozess bei Pflanzen zur Tumorbildung, die allgemein a....

Protokoll

Alle Medien und Lösungen müssen vor der Verwendung autoklaviert werden, sofern nicht anders angegeben. Alle Zentrifugenröhrchen, Pipettenspitzen usw. sollten vor Gebrauch steril oder autoklaviert sein. Zur leichteren Referenz sind die in diesem Protokoll verwendeten Medienrezepte in Tabelle 1 aufgeführt.

1. Herstellung von elektrokompetenten Zellen von A. tumefaciens

1. Inimpfen Sie Agrobacterium (AGL-1) in einen sterilen 25-ml-Schüttelkolben mit LB-Medien (ergänzt mit Rifampicin, 20 mg/L-1) aus einem gefrorenen Glycerin-Vorrat und lassen Sie es über Nacht bei ^28-30 °C u....

Diskussion

Die Effizienz der Transformation ist mit mehreren verschiedenen Parametern verbunden. Die Wahl der A. tumefaciens-Stämme, die für AMT verwendet werden, ist entscheidend. AGL-1 ist einer der invasivsten Stämme, die entdeckt wurden, und wird aus diesem Grund routinemäßig in pflanzlichen AMT eingesetzt. Die Ergänzung des Induktionsmediums mit Glukose (15-20 mM) ist ebenfalls wichtig für die AMT-Effizienz. In Anbetracht der Tatsache, dass C. vulgaris sowohl unter phototrophen als auch unter heterotro.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 Kb Plus DNA ladder	FroggaBio	DM015
Acetosyringone	Fisher Scientific	D26665G
Agrobacterium tumefaciens	Gold Biotechnologies	Strain: AGL-1; Gift from Prof. Paul Hooykaas	Genotype: C58 RecA (RifR/CarbR) pTiBo542DT-DNA
Biotin	Enzo Life Sciences	89151-400
CaCl2·2H2O	VWR	BDH9224-1KG
Cefotaxime	AK Scientific	J90010
Chlorella vulgaris	University of Texas at Austin Culture Collection of Algae	Strain: UTEX 395	Wildtype strain
CoCl2·6H2O	Sigma Aldrich	C8661-25G
CuSO4·5H2O	EMD Millipore	CX2185-1
FeCl3·6H2O	VWR	BDH9234-500G
Gene Pulser Xcell Electroporator	Bio-Rad	1652662	Main unit equipped with PC module.
GeneJET Plant Genome Purification Kit	Thermo Scientific	K0791
Glacial acetic acid	VWR	CABDH3093-2.2P
Glycerol	BioBasic	GB0232
HEPES Buffer	Sigma Aldrich	H-3375
Hygromycin B	Fisher Scientific	AAJ6068103
K2HPO4	VWR	BDH9266-500G
Kanamycin	Gold Biotechnologies	K-250-25
KH2PO4	VWR	BDH9268-500G
MgSO4·7H2O	VWR	97062-134
MnCl2·4H2O	JT Baker	BAKR2540-01
Na2CO3	VWR	BDH7971-1
Na2EDTA·2H2O	JT Baker	8993-01
Na2MoO4·2H2O	JT Baker	BAKR3764-01
NaCl	VWR	BDH7257-7
NaH2PO4 H2O	Millipore Sigma	CA80058-650
NaNO3	VWR	BDH4574-500G
NEBExpress Ni Resin	NewEngland BioLabs	NEB #S1427
NH4Cl	VWR	BDH9208-500G
pCAMBIA1302	Leiden University	Gift from Prof. Paul Hooykaas	pBR322, KanR, pVS1, T-DNA(CaMV 35S/HygR/CaMV polyA, CaMV 35S promoter/mgpf5-6xhis/NOS terminator)
Polypropylene Columns (5 mL)	QIAGEN	34964
Precision Plus Protein Unstained Protein Standards, Strep-tagged recombinant, 1 mL	Bio-Rad	1610363
Rifampicin	Millipore Sigma	R3501-1G
SunBlaster LED Strip Light 48 Inch	SunBlaster	210000000906
Synergy 4 Microplate UV/Vis spectrometer	BioTEK	S4MLFPTA
Tetracycline	Thermo Scientific Chemicals	CAAAJ61714-14
TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 12%	Bio-Rad	1610185
Thiamine	TCI America	T0181-100G
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-500
Tryptone	BioBasic	TG217(G211)
Vitamin B12 (cyanocobalamin)	Enzo Life Sciences	89151-436
Yeast Extract	BioBasic	G0961
ZnSO4·7H2O	JT Baker	4382-01