Identificación del tipo de fibra del músculo esquelético humano

Resumen

Este protocolo demuestra el aislamiento de una sola fibra del músculo esquelético humano liofilizado y la clasificación del tipo de fibra de acuerdo con la isoforma de la cadena pesada de miosina (MHC) utilizando la técnica de transferencia de puntos. Las muestras de fibra MHC I y II identificadas se pueden analizar más a fondo para detectar diferencias específicas del tipo de fibra en la expresión de proteínas mediante Western blot.

Resumen

La técnica descrita aquí se puede utilizar para identificar isoformas específicas de la cadena pesada de miosina (MHC) en segmentos de fibras musculares individuales mediante transferencia de puntos, en lo sucesivo denominada detección de la cadena pesada de la osina mediante laasignación de Dot Bpara la entificación de IDdel tipo de fibra muscular (MyDoBID). Este protocolo describe el proceso de liofilización del músculo esquelético humano y el aislamiento de segmentos de fibras musculares individuales. Con MyDoBID, las fibras de tipo I y II se clasifican con anticuerpos específicos de MHCI y IIa, respectivamente. Luego, las fibras clasificadas se combinan en muestras específicas para cada tipo de fibra para cada biopsia.

La proteína total en cada muestra se determina mediante electroforesis en gel de poliacrilamida de dodecil-sulfato de sodio (SDS-PAGE) y tecnología de gel activado por UV. El tipo de fibra de las muestras se valida mediante Western blot. También se describe la importancia de realizar la normalización de la carga de proteínas para mejorar la detección de proteínas diana a través de múltiples Western blots. Los beneficios de consolidar las fibras clasificadas en muestras específicas del tipo de fibra en comparación con las Western blots de una sola fibra, incluyen la versatilidad de la muestra, el aumento del rendimiento de la muestra, la menor inversión de tiempo y las medidas de ahorro de costos, todo mientras se conserva la valiosa información específica del tipo de fibra que con frecuencia se pasa por alto utilizando muestras musculares homogeneizadas. El propósito del protocolo es lograr una identificación precisa y eficiente de las fibras de tipo I y tipo II aisladas de muestras de músculo esquelético humano liofilizado.

Estas fibras individuales se combinan posteriormente para crear muestras específicas de tipo de fibra de tipo I y tipo II. Además, el protocolo se amplía para incluir la identificación de fibras de tipo IIx, utilizando Actina como marcador de fibras que fueron negativas para MHCI y MHCIIa, que se confirman como fibras IIx por Western blot. A continuación, se utiliza cada muestra específica de tipo de fibra para cuantificar la expresión de varias proteínas diana mediante técnicas de Western blot.

Introducción

El músculo esquelético es un tejido heterogéneo, con distintas propiedades celulares metabólicas y contráctiles que dependen de si la célula (fibra) es de contracción lenta (tipo I) o de contracción rápida (tipo II). El tipo de fibra se puede identificar examinando las isoformas de la cadena pesada de miosina (MHC), que difieren entre sí de varias maneras, incluido el tiempo de contracción, la velocidad de acortamiento y la resistencia a la fatiga¹. Las principales isoformas del MHC incluyen el tipo I, el tipo IIa, el tipo IIb y el tipo IIx, y sus perfiles metabólicos son oxidativos (tipo I y IIa) o glucolíticos (IIx, IIb)¹

Protocolo

Se obtuvieron muestras de músculo humano del vasto lateral de n = 3 (2 machos, 1 hembra), con edades comprendidas entre 70 y 74 años, en condiciones estériles, utilizando anestesia local (xilocaína) y aguja de Bergstrom modificada para aspiración manual^11,12. Las muestras fueron un subconjunto de un estudio previo aprobado por el Comité de Ética de Investigación en Seres Humanos de la Universidad de Victoria (HRETH11/221) y realizado de acuerdo con la Declaración de Helsinki¹³. Los participantes dieron su consentimiento informado por escrito para participar en este estudio. Los....

Discusión

Recolección de fibra
Sobre la base de varios años de experiencia, la mayoría de los investigadores pueden dominar esta técnica; Sin embargo, la práctica conduce a una recolección de fibra más rápida y eficiente para los análisis posteriores. Para poder aislar 30 segmentos de fibra individuales de una calidad para agrupar, se recomienda recolectar 50 segmentos de fibra por muestra. Se recomienda estudiar cuidadosamente el video de recolección de fibras y después de realizar dos sesiones de p.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x Denaturing buffer	Make according to recipe	Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributing companies	1x denaturing buffer is made by diluting 3x denaturing buffer 1 in 3 v/v with 1X Tris-HCl (pH 6.8). Store at -20 °C.
3x Denaturing buffer	Make according to recipe	Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributors	3x denaturing buffer contains: 0.125M Tris-HCI, 10% glycerol, 4% SDS, 4 M urea, 10% 2-mercaptoethanol, and 0.001% bromophenol blue, pH 6.8.  Store at -20 °C.
95% Ethanol	N/A	100% ethanol can be sourced from any company	Diluted to 95% with ultra-pure H2O.
Actin rabbit polyclonal antibody	Sigma-Aldrich	A2066	Dilute 1 in 1,000 with BSA buffer.
Analytical scales	Mettler Toledo	Model number: MSZ042101
Antibody enhancer	Thermo Fischer Scientific	32110	Product name is Miser Antibody Extender Solution NC.
Beaker (100 mL)	N/A	N/A
Benchtop centrifuge	Eppendorf	5452	Model name: Mini Spin.
Blocking buffer: 5% Skim milk in Wash buffer.	Diploma	Store bought
BSA buffer: 1 % BSA/PBST, 0.02 % NaN3	BSA: Sigma-Aldrich              PBS: Bio-Rad Laboratories. NaN3 : Sigma-Aldrich	BSA: A6003-25G                         10x PBS: 1610780                       NaN3: S2002	Bovine serum albumin (BSA), Phosphate-buffered saline (PBS), and Sodium azide (NaN3). Store at 4 °C.
Cassette opening lever	Bio-Rad Laboratories	4560000	Used to open the precast gel cassettes.
Chemidoc MP Imager	Bio-Rad Laboratories	Model number: Universal hood III	Any imaging system with Stain-Free gel imaging capabilities.
Criterion blotter	Bio-Rad Laboratories	1704070	Includes ice pack, transfer tray, roller, 2 cassette holders, filter paper, foam pads and lid with cables.
Criterion Cell (Bio-Rad)	Bio-Rad Laboratories	1656001
ECL (enhanced chemiluminescence)	Bio-Rad Laboratories	1705062	Product name: Clarity Max Western ECL Substrate.
Electrophoresis buffer 1x Tris Glycine SDS (TGS)	Bio-Rad Laboratories	1610772	Dilute 10x TGS 1 in 10 with ultra-pure H2O.
Filter paper, 0.34 mm thick	Whatmann	3030917	Bulk size 3 MM, pack 100 sheets, 315 x 335 mm.
Fine tissue dissecting forceps	Dumont	F6521-1EA	Jeweller’s forceps no. 5.
Flat plastic tray/lid	N/A	N/A	Large enough to place the membrane on. Ensure the surface is completely flat.
Freeze-drying System	Labconco	7750030	Freezone 4.5 L with glass chamber sample stage.
Freezer -80 oC	N/A	N/A	Any freezer with a constant temperature of -80 °C is suitable.
Gel releasers	1653320	Bio-Rad	Slide under the membrane to gather or move the membrane.
Grey lead pencil	N/A	N/A
Image lab software	Bio-Rad Laboratories	N/A	Figures refers to software version 5.2.1 but other versions can used.
Incubator	Bio-Rad Laboratories	1660521	Any incubator that can be set to 37 °C would suffice.
Lamp	N/A	N/A
Magnetic stirrer with flea	N/A	N/A
Membrane roller	Bio-Rad Laboratories	1651279	Can be purchased in the Transfer bundle pack. However, if this product is not available, any smooth surface cylindrical tube long enough to roll over the membrane would suffice.
Microcentrifuge tubes  (0.6 mL)	N/A	N/A
Mouse IgG HRP secondary	Thermo Fisher Scientific	31430	Goat anti-Mouse IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilute at 1 in 20,000 in blocking buffer.
Mouse IgM HRP secondary	Abcam	ab97230	Goat Anti-Mouse IgM mu chain. Use at the same dilution as mouse IgG.
Myosin Heavy Chain I (MHCI) primary antibody	DSHB	A4.840	Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.
Myosin Heavy Chain IIa (MHCIIa) primary antibody	DSHB	A4.74	Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.
Myosin Heavy Chain IIx (MHCIIx) primary antibody	DSHB	6H1	Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.
Nitrocellulose Membrane 0.45 µm	Bio-Rad Laboratories	1620115	For Western blotting.
Petri dish lid	N/A	N/A
Plastic tweezers	N/A	N/A
Power Pack	Bio-Rad Laboratories	164-5050	Product name: Basic power supply.
Protein ladder	Thermo Fisher Scientific	26616	PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa.
PVDF Membrane 0.2 µm	Bio-Rad Laboratories	1620177
Rabbit HRP secondary	Thermo Fisher Scientific	31460	Goat anti-Rabbit IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilution same as mouse secondary antibodies.
Rocker	N/A	N/A
Ruler	N/A	N/A
Scissors	N/A	N/A
Stereomicroscope	Motic	SMZ-168
Stripping buffer	Thermo Fisher Scientific	21059	Product name: Restore Western Blot Stripping Buffer.
Tissue (lint free)	Kimberly-Clark professional	34120	Product name: Kimwipe.
Transfer buffer (1x Tris Glycine buffer (TG), 20% Methanol)	TG: Bio-Rad Laboratories   Methanol: Merck	TG buffer: 1610771           Methanol: 1.06018	dilute 10x TG buffer with ultra-pure H2O to 1x. Add 100% Methanol to a final concentration of 20% Methanol. Store at 4 °C.
Transfer tray	Bio-Rad Laboratories	1704089
UV-activation precast gel	Bio-Rad Laboratories	5678085	Gel type: 4–15% Criterion TGX Stain-Free Protein Gel, 26 well, 15 µL.
Vortex	N/A	N/A
Wash buffer (1x TBST)	10x TBS: Astral Scientific  Tween 20: Sigma	BIOA0027-4L	1x TBST recipe: 10x Tris-buffered saline (TBS) is diluted down to 1x with ultra-pure H2O, Tween 20 is added to a final concentration of 0.1%. Store buffer at 4 °C.
Wash containers	Sistema	Store bought	Any tupperware container, that suits the approximate dimensions of the membrane would suffice.