Identificación del tipo de fibra del músculo esquelético humano

Resumen

Este protocolo demuestra el aislamiento de una sola fibra del músculo esquelético humano liofilizado y la clasificación del tipo de fibra de acuerdo con la isoforma de la cadena pesada de miosina (MHC) utilizando la técnica de transferencia de puntos. Las muestras de fibra MHC I y II identificadas se pueden analizar más a fondo para detectar diferencias específicas del tipo de fibra en la expresión de proteínas mediante Western blot.

Resumen

La técnica descrita aquí se puede utilizar para identificar isoformas específicas de la cadena pesada de miosina (MHC) en segmentos de fibras musculares individuales mediante transferencia de puntos, en lo sucesivo denominada detección de la cadena pesada de la osina mediante laasignación de Dot Bpara la entificación de IDdel tipo de fibra muscular (MyDoBID). Este protocolo describe el proceso de liofilización del músculo esquelético humano y el aislamiento de segmentos de fibras musculares individuales. Con MyDoBID, las fibras de tipo I y II se clasifican con anticuerpos específicos de MHCI y IIa, respectivamente. Luego, las fibras clasificadas se combinan en muestras específicas para cada tipo de fibra para cada biopsia.

La proteína total en cada muestra se determina mediante electroforesis en gel de poliacrilamida de dodecil-sulfato de sodio (SDS-PAGE) y tecnología de gel activado por UV. El tipo de fibra de las muestras se valida mediante Western blot. También se describe la importancia de realizar la normalización de la carga de proteínas para mejorar la detección de proteínas diana a través de múltiples Western blots. Los beneficios de consolidar las fibras clasificadas en muestras específicas del tipo de fibra en comparación con las Western blots de una sola fibra, incluyen la versatilidad de la muestra, el aumento del rendimiento de la muestra, la menor inversión de tiempo y las medidas de ahorro de costos, todo mientras se conserva la valiosa información específica del tipo de fibra que con frecuencia se pasa por alto utilizando muestras musculares homogeneizadas. El propósito del protocolo es lograr una identificación precisa y eficiente de las fibras de tipo I y tipo II aisladas de muestras de músculo esquelético humano liofilizado.

Estas fibras individuales se combinan posteriormente para crear muestras específicas de tipo de fibra de tipo I y tipo II. Además, el protocolo se amplía para incluir la identificación de fibras de tipo IIx, utilizando Actina como marcador de fibras que fueron negativas para MHCI y MHCIIa, que se confirman como fibras IIx por Western blot. A continuación, se utiliza cada muestra específica de tipo de fibra para cuantificar la expresión de varias proteínas diana mediante técnicas de Western blot.

Introducción

El músculo esquelético es un tejido heterogéneo, con distintas propiedades celulares metabólicas y contráctiles que dependen de si la célula (fibra) es de contracción lenta (tipo I) o de contracción rápida (tipo II). El tipo de fibra se puede identificar examinando las isoformas de la cadena pesada de miosina (MHC), que difieren entre sí de varias maneras, incluido el tiempo de contracción, la velocidad de acortamiento y la resistencia a la fatiga¹. Las principales isoformas del MHC incluyen el tipo I, el tipo IIa, el tipo IIb y el tipo IIx, y sus perfiles metabólicos son oxidativos (tipo I y IIa) o glucolíticos (IIx, IIb)¹. La proporción de estos tipos de fibra varía según el tipo de músculo y entre especies. El tipo IIb se encuentra ampliamente en el músculo de los roedores. Los músculos humanos no contienen fibras de tipo IIb y consisten predominantemente en isoformas MHC de fibras de tipo I y IIa, con una pequeña proporción de fibras IIx². Los perfiles de expresión de proteínas varían entre los diferentes tipos de fibra y pueden alterarse con el envejecimiento³, el ejercicio ^4,5 y la enfermedad 6.

La medición de las respuestas celulares en diferentes tipos de fibras musculares esqueléticas a menudo se pasa por alto o no es posible debido al examen de los homogeneizados musculares (una mezcla de todos los tipos de fibras). El Western blot de una sola fibra permite la investigación de múltiples proteínas en fibras musculares individuales⁷. Esta metodología se ha utilizado previamente para producir características novedosas e informativas de una sola fibra que no eran posibles de obtener utilizando preparaciones homogeneizadas. Sin embargo, existen algunas limitaciones de la metodología original de Western blot de una sola fibra, incluida la naturaleza que consume mucho tiempo, la incapacidad de generar réplicas de muestras y el uso de reactivos de quimioluminiscencia mejorada (ECL) costosos y sensibles. Si se utiliza tejido fresco, este método se limita aún más debido a las limitaciones de tiempo de la necesidad de aislar fibras individuales dentro de un período de tiempo limitado (es decir, 1-2 h). Afortunadamente, esta restricción se mitiga aislando segmentos de una sola fibra del tejido liofilizado⁸. Sin embargo, la recolección de fibras de muestras liofilizadas está limitada por el tamaño y la calidad del tejido biopsiado.

La identificación del tipo de fibra mediante el método de transferencia de puntos⁹ se ha desarrollado y ampliado significativamente en este protocolo integral. Anteriormente, se ha demostrado que tan solo ~ 2-10 mg de tejido muscular de peso húmedo es adecuado para la liofilización y el análisis de proteínas isoformadas de MHC de fibra^{única 9}. Christensen et ^al.9 utilizaron el 30% de un segmento de fibra de ~1 mm para detectar la isoforma MHC presente por transferencia de puntos, lo que se confirmó mediante Western blot. Este trabajo mostró que al sustituir la Western blot por la transferencia de puntos, los costos generales se redujeron en ~ 40 veces (para 50 segmentos de fibra). A continuación, las fibras se "agruparon" en muestras de tipo I y II, lo que permitió la replicación experimental⁹. Sin embargo, una limitación fue que solo se obtuvieron dos muestras específicas para cada tipo de fibra: tipo I (fibras MHCI positivas) y tipo II (fibras MHCII positivas), con muestras de tipo II que contenían una mezcla de MHCIIa y MHCIIx ^6,10. En particular, el protocolo actual demuestra cómo se pueden identificar las fibras puras de tipo IIx y proporciona un flujo de trabajo muy detallado (resumido en la Figura 1), incluidas las estrategias de solución de problemas para problemas comunes del protocolo.

Protocolo

Se obtuvieron muestras de músculo humano del vasto lateral de n = 3 (2 machos, 1 hembra), con edades comprendidas entre 70 y 74 años, en condiciones estériles, utilizando anestesia local (xilocaína) y aguja de Bergstrom modificada para aspiración manual^11,12. Las muestras fueron un subconjunto de un estudio previo aprobado por el Comité de Ética de Investigación en Seres Humanos de la Universidad de Victoria (HRETH11/221) y realizado de acuerdo con la Declaración de Helsinki¹³. Los participantes dieron su consentimiento informado por escrito para participar en este estudio. Los detalles completos de todos los materiales necesarios para este protocolo se muestran en la Tabla de Materiales. Además, en la Tabla 1 se proporciona una lista de estrategias de solución de problemas que abordan problemas comunes de protocolo.

1. Liofilización

1. Mientras mantiene las muestras de músculo biopsiadas congeladas en hielo seco, pesa y tara un tubo congelado vacío en la báscula.
2. Pese rápidamente un mínimo de 10 mg de tejido congelado con peso húmedo. Registre el peso con un decimal.
3. Deposite el tejido en el tubo de microcentrífuga preenfriado al que se le han perforado 3-4 agujeros en la tapa y colóquelo en un vaso de precipitados pequeño con 2-3 gránulos de hielo seco.
4. Siga las instrucciones de funcionamiento del fabricante de la liofilizadora.
5. Asegúrese de que todas las válvulas del liofilizador estén cerradas y encienda el liofilizador.
6. Utilice el panel de control para comprobar que el punto de ajuste de vacío está programado para condiciones óptimas de liofilización para tejido humano, 0,12 milibares (mBar) (Figura 2).
7. Presione manual en el liofilizador y espere hasta que la cámara se haya enfriado a -40 ^oC.
8. Una vez que la cámara haya alcanzado esa temperatura, retire la tapa, luego la cámara de vidrio y coloque el vaso de precipitados (con muestra muscular) en la platina de metal.
9. Vuelva a colocar la cámara de vidrio y la tapa. Cierre la válvula de liberación de vacío en la tapa y espere hasta que la luz de la báscula de vacío se vuelva verde para asegurarse de que la secadora esté sellada al vacío.
10. Liofilizar las muestras musculares durante 48 h. Una vez que se complete la liofilización, apague la bomba de vacío presionando el botón de vacío y abra la válvula de liberación de vacío en la tapa.
11. Retire la tapa de la cámara y recoja la muestra liofilizada. Pesa el pañuelo y registra el peso con un decimal.
12. Calcular el porcentaje de pérdida de peso; ~ 75% de disminución en el peso indica que el tejido se ha liofilizado con éxito (en este trabajo, media ± DE, 76 ± 9%, n = 11 muestras musculares).
13. Presione AUTO para apagar la bomba de vacío y el congelador. Deje que la unidad alcance la temperatura ambiente.
14. Limpie los serpentines de enfriamiento de acuerdo con las instrucciones del fabricante y drene el líquido acumulado del colector.
    NOTA: La recolección de fibra puede comenzar de inmediato. Cuando no se utilice tejido para el aislamiento de fibras, mantenga la muestra liofilizada a -80 °C en un recipiente sellado con perlas de desecación.  PRECAUCIÓN: El hielo seco es peligroso (Clase 9); consulte la MSDS para conocer el manejo seguro recomendado.

2. Recolección de fibra

1. Preparación de la recolección de fibras
   1. Etiquete un mínimo de 50 tubos de microfuga (fibra de 1 a 50) y pipetee 10 μL de tampón desnaturalizante en cada tubo.
   2. Prepare el área de recolección con dos pares de pinzas de disección de tejido fino, pañuelo sin pelusa, una lámpara de sobremesa, un microscopio estereoscópico (con la platina negra levantada), un vórtice y una centrífuga de sobremesa.
   3. Coloque la muestra de músculo liofilizado en la tapa de una placa de Petri. Coloque la tapa en la platina del microscopio de disección.
   4. Vea el video de la disección de una sola fibra. Practique el protocolo completo, desde la recolección de fibras hasta la identificación del tipo de fibra única, al menos dos veces antes de comenzar un estudio.
   5. Antes de la recolección de fibras, calcule el volumen total requerido para una muestra de tipo de fibra de cada biopsia de la siguiente manera. Por ejemplo, si el volumen inicial de 1 fibra = 10 μL y el volumen restante después de MyDoBID es (1 fibra × 10 μL) - 1 μL utilizado para la transferencia de puntos = 9 μL (volumen de la muestra), calcule el volumen total de la muestra requerido multiplicando el volumen de la muestra (μL) por el número total de Western blots que se ejecutarán y duplique esta cantidad para tener en cuenta la redundancia: (9 μL × 4 Western blots) × 2 = 72 μL. Calcule el número de fibras requeridas por muestra tipificada dividiendo el volumen final de muestra requerido (μL) por el volumen de muestra por muestra específica del tipo de fibra (p. ej., 72 μL ÷ 9 μL = 8 fibras por muestra específica del tipo de fibra). Para que esto se logre, recoja un total de 50 fibras.
      NOTA: El volumen de muestra requerido es la concentración mínima de proteína requerida para ejecutar tanto MyDoBID como Western blot si la cantidad de proteína cargada es equivalente a una fibra de ~3 mm (~12 μg de peso húmedo) para cada muestra (consulte el Archivo Suplementario 1 para obtener más detalles). Sin embargo, este volumen no tiene en cuenta si se requieren geles repetidos para una proteína determinada.  PRECAUCIÓN: Las pinzas son afiladas; Manéjelos con cuidado para evitar el riesgo de punción en la piel.
2. Aislamiento de una sola fibra
   1. En una hoja de papel pequeña de 5 cm x 1 cm, usa una regla para dibujar una línea de 1 cm. Marque cada 1 mm en esa línea.
   2. Insértelo debajo de la tapa de la placa de Petri como guía para estimar la longitud de las fibras recolectadas.
   3. Coloque la muestra de músculo liofilizado bajo el microscopio estereoscópico con un aumento bajo (x 7,5). Use un par de pinzas de disección de tejido fino para mantener el músculo liofilizado en su lugar y con el otro comience a separar pequeños haces de fibras (como se ve en el video).
   4. Aísle un haz de fibras y continúe separando hasta que los segmentos de fibra individuales estén aislados del paquete.
   5. Recoja un mínimo de 50 fibras que tengan al menos ~ 1 mm de longitud.
   6. Mueva la fibra a un espacio vacío en la placa de Petri. Inspeccione los segmentos de una sola fibra con un aumento mayor (x 50). Asegúrese de que sea una sola fibra separando aún más la fibra en el extremo. Si la fibra se rompe en lugar de separarse, es una sola fibra.
3. Desnaturalización de las fibras
   1. Con unas pinzas, recoja suavemente la fibra y colóquela directamente en el tampón desnaturalizante alícuota (no deje que las pinzas entren en contacto con el tampón).
   2. Revise las pinzas bajo el microscopio para asegurarse de que la fibra se haya extraído con éxito. Cierre el tubo y golpee la parte inferior del tubo firmemente en el banco tres veces para asegurarse de que la fibra se mueva hacia el tampón.
   3. Limpie las pinzas con un pañuelo sin pelusa antes de pasar a la siguiente fibra. Repita este proceso hasta que se recojan todas las fibras.
   4. Agite las muestras de fibra y centrifuga brevemente durante 5 s a 2.500 × g para extraer la muestra hasta el fondo del tubo.
      NOTA: La duración de la centrifugación (5 s) se cronometra desde el inicio (0 × g) hasta que la velocidad alcanza ~2.500 × g.
   5. Deje las muestras a temperatura ambiente durante 1 h. Almacenar a -80 °C para su uso futuro. Congele y luego descongele las muestras antes de usarlas.

3. Transferencia de puntos

1. Preparación y activación de membranas
   1. Mida, etiquete y corte a medida una membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF) (tamaño de poro de 0,2 μm) para que quepa 50 muestras (~10,5 cm x 5,5 cm).
   2. Marque el borde izquierdo numéricamente de arriba a abajo (1 a 10) y el borde superior alfabéticamente de izquierda a derecha (A a E) espaciados 1 cm de distancia.
   3. Prepara cuatro hojas de papel de filtro con unas dimensiones de 12,5 cm x 7,5 cm.
   4. Apila dos hojas juntas para formar una pila. Remoje previamente la pila de papel de filtro en 1x tampón de transferencia.
   5. Coloque la membrana en un recipiente. Vierta etanol al 95% sobre la membrana, con suficiente volumen para sumergir completamente la membrana (10-15 ml). Agite en el balancín durante 1 min.
   6. Recoja el etanol, sumerja la membrana en 1x tampón de transferencia (~ 15 ml) y cocine durante 2 minutos más.
      NOTA: Tanto el etanol como el tampón de transferencia se pueden reutilizar para futuros experimentos de transferencia de puntos hasta que se forme sedimentación (cambie después de seis usos).
   7. Coloque la pila de papel de filtro empapada en tampón de transferencia sobre una superficie móvil plana, como una tapa grande, y aplánela con el rodillo. Coloque la membrana de PVDF en la pila con un liberador de gel o pinzas.
   8. Coloque una sola hoja de papel de filtro seco en la parte superior de la membrana y mueva el rodillo sobre el papel de filtro para absorber el exceso de tampón en la superficie de la membrana. Retire el papel de filtro superior sin frotar la membrana.
      PRECAUCIÓN: El metanol (Clase 3, subriesgo 6.1) y el etanol (Clase 3) son peligrosos. Consulte la hoja de datos de seguridad del material (MSDS) para obtener recomendaciones de manejo seguro.
2. Absorción de la muestra a la membrana
   1. Descongele las muestras de fibra, realice una breve centrifugación (5 s) a temperatura ambiente como en el paso 2.3.4 y mezcle bien la muestra.
   2. Sin tocar la membrana con la punta de la pipeta, deposite lentamente una gota de ~1 μL de cada muestra sobre la membrana en el área designada. Las dimensiones del área designada por muestra de fibra son ~1 cm x 1 cm. Trata de detectar la muestra en el centro de esta área.
   3. Deje que las gotas de muestra penetren a través de la membrana durante al menos 15 minutos. Asegúrese de que no quede ningún tampón de muestra y que se absorba por completo.
   4. Con unas pinzas de plástico, levante con cuidado la membrana de la pila de papel de filtro húmedo, colóquela sobre una sola hoja seca de papel de filtro y deshidrate la membrana durante al menos 5 minutos.
   5. Una vez que las manchas de muestra se vuelvan completamente blancas, reactive la membrana.
3. Reactivación y bloqueo de membranas
   1. Reactive la membrana repitiendo los pasos 3.1.5 y 3.1.6.
   2. Coloque la membrana en el tampón de lavado y enjuague durante 5 minutos con balanceo. Deseche el tampón de lavado.
   3. Incubar la membrana en un tampón de bloqueo durante 30 minutos mientras se balancea.
   4. Enjuague la membrana 3 veces con tampón de lavado hasta que el tampón ya no esté turbio.
   5. Deje la membrana en el lavado final en el balancín.

4. Inmunomarcaje

1. Detección de MHCIIa
   1. Diluir el anticuerpo primario MHCIIa a 1 en 200 en 10 mL de tampón de albúmina sérica bovina (BSA).
   2. Deseche el tampón de lavado de la membrana y luego vierta el anticuerpo MHCIIa diluido en la membrana.
   3. Coloque el recipiente (con la membrana en MHCIIa) sobre el balancín a temperatura ambiente durante 2 h o a 4 °C durante la noche.
   4. Recoger el anticuerpo MHCIIa y almacenarlo a 4 °C. Lave la membrana con un tampón de bloqueo durante 2 minutos en el balancín.
      NOTA: Todos los anticuerpos primarios se pueden reutilizar hasta cinco veces siempre que el tampón permanezca limpio.
   5. Enjuague dos veces más; 5 minutos cada vez; Tres lavados en total.
   6. Diluir el anticuerpo secundario de inmunoglobulina G peroxidasa de rábano picante (IgG-HRP) de ratón a 1 en 20.000 en 10 ml de tampón de bloqueo y añadirlo a la membrana.
   7. Deseche el tampón de lavado e incube la membrana en IgG-HRP de ratón secundario con balanceo durante 1 h.
   8. Deseche el secundario y lave la membrana en tampón de lavado (2, 5, 5 min).
   9. Deje la membrana en remojo en el lavado final hasta que esté lista para la obtención de imágenes.
   10. Encienda el generador de imágenes en gel, espere 15 minutos para que el generador de imágenes alcance la temperatura de funcionamiento requerida y, a continuación, abra el software de adquisición de imágenes (consulte la Tabla de materiales).
   11. En la ventana de software, haga clic en Nuevo protocolo de canal único (Figura 3A). Para obtener una imagen de luz blanca de la membrana, en Aplicaciones | Manchas | haga clic en Colorimétrico (Figura 3B).
   12. Haga clic en el área del gel; Cada opción está programada para dimensiones específicas para adaptarse al tamaño de varios tipos de gel. Seleccione la opción adecuada que mejor se ajuste a las dimensiones de la membrana (Figura 3C).
   13. Prepare el ECL combinando reactivos de luminol y peroxidasa en una proporción de 1:1. Prepare un volumen suficiente de mezcla de ECL para cubrir toda la membrana, normalmente se requiere un volumen total de 800-1.000 μL.
   14. Coloque la membrana en una bandeja grande de plástico transparente y disperse la mezcla de ECL sobre la membrana.
   15. Coloque la membrana en la placa de imágenes.
   16. Haga clic en Position Gel (botón amarillo) para ver la cámara en vivo. Haga clic en mantener presionado y arrastre el botón de zoom para maximizar el área de imagen de la membrana. En este punto, enderece la posición de la membrana si es necesario.
   17. Haga clic en Ejecutar protocolo (botón verde) y espere a que se produzca una imagen colorimétrica de la membrana. Guarde esta imagen para ayudar a hacer coincidir los puntos con la muestra de fibra correspondiente.
   18. Sin mover la membrana, cambie la aplicación en el software haciendo clic en la opción de agrupación de 2 x 2 (Chemi High Resolution) (Figura 3D).
   19. En Exposición de imagen y software, optimice el tiempo de exposición, haga clic en Bandas tenues (Figura 3E) | Modo de acumulación de señal.
   20. En Configuración, escriba 1 s para la primera imagen, 30 s para la última imagen y 30 imágenes en total (Figura 3F).
   21. Haga clic en Ejecutar protocolo.
   22. Guarde una imagen en las siguientes etapas: antes de la saturación de la señal (todos los puntos visibles son negros), la saturación inicial de la señal (algunos puntos comienzan a saturarse) y los puntos sobresaturados (todos los puntos con una señal fuerte detectada están saturados).
   23. Guarde todas las imágenes necesarias antes de finalizar la acumulación de señal. Saque la membrana del generador de imágenes.
   24. Con el liberador de gel, vuelva a colocar la membrana en el recipiente con el tampón de lavado.
2. Detección de MHCI
   1. Vierta el tampón de lavado y trate la membrana con un tampón de extracción durante 30 minutos a 37 °C (asegúrese de que la membrana esté completamente sumergida).
   2. Recoja el tampón de decapado y enjuague la membrana en el tampón de lavado durante 5 minutos con balanceo.
      NOTA: El búfer de extracción se puede reutilizar 10 veces antes de desecharlo.
   3. Vierta el tampón de lavado y esta vez aplique el anticuerpo primario MHCI diluido a una concentración inicial de 1 en 200 (rango: 1 en 200 a 1 en 500). Agite la membrana a temperatura ambiente durante 1 h.
   4. Después de incubar en el anticuerpo primario MHCI, recoja el anticuerpo y lave la membrana como en los pasos 4.1.4 y 4.1.5.
   5. Diluir el anticuerpo secundario IgM HRP de ratón en tampón de bloqueo a 1 de cada 20.000. Verter el tampón de bloqueo de la membrana e incubar en el ratón IgM secundaria como en el paso 4.1.7.
   6. El lavado y la captura de imágenes detectaron MHCI como en los pasos 4.1.8 a 4.1.24.
      PRECAUCIÓN: El tampón de extracción contiene Organofosfina 3-5% (Clase 8). Consulte la MSDS para obtener recomendaciones de manejo seguro.
3. Detección de MHCIIx potencial mediante actina
   1. Pelar la membrana una vez más (pasos 4.2.1 y 4.2.2).
   2. Repita la sección 4.1, esta vez aplicando el anticuerpo primario de actina diluido a 1 en 500 en tampón BSA y luego el anticuerpo secundario HRP de conejo diluido a 1 en 20.000 en tampón de bloqueo.

5. Identificación del tipo de fibra

1. Análisis de señales MHCI, MHCIIa y actina
   1. Familiarícese con el panel de intensidad de la señal (Figura 4A). Tome nota de los pasos 5.1.2 a 5.1.4.
   2. Una intensidad de señal saturada indica cualitativamente que la detección de proteínas es fuerte.
   3. Un moderado indica que la proteína diana está presente en un nivel medio.
   4. Una señal débil indica que hay poca proteína objetivo presente.
   5. Utilice el panel de intensidad de señal para clasificar las fibras con una intensidad de señal "saturada", "moderada" o "débil" (Figura 4A).
   6. Lleve a cabo la identificación del tipo de fibra comparando primero los resultados de MHCIIa y MHCI (Figura 4B, manchas izquierda y media).
   7. Registre fibras con una intensidad de señal saturada o moderada de una sola isoforma MHC.
   8. Si la señal de la isoforma MHC es "débil", deje la fibra sin marcar (consulte la Figura 4B).
   9. Por último, cuando se observe actina (intensidad de señal moderada o saturada) en las fibras sin MHCI o IIa detectada, regístrela como una fibra potencial de tipo IIx (Figura 4B, transferencia derecha).
   10. Registre las fibras con una débil señal de isoforma MHC pero la actina detectada (intensidad moderada o saturada) como no identificada.
   11. Deseche las muestras con detección débil o nula (no se ha recogido fibra) para las tres proteínas diana (Figura 4C).
   12. Grabe cualquier fibra en la que se detecten señales MHCI y MHCII con una señal "saturada" o moderada. Estas muestras no deben usarse en la preparación específica del tipo de fibra.
2. Preparación de muestras específicas para cada tipo de fibra
   1. Prepare una muestra separada de tipo I y tipo II para cada biopsia. Para una muestra de tipo II, combine el número mínimo requerido de fibras (calculado en el paso 2.1.5) en el que se detecta MHCIIa a niveles saturados o moderados.
   2. En un tubo separado etiquetado como tipo I, repita este proceso para las fibras en las que se detecta MHCI (Figura 4D).
   3. Utilice fibras con una intensidad de señal moderada si no hay suficientes fibras con señales saturadas.
   4. Combine cualquier fibra IIx potencial.
   5. Utilice inmediatamente muestras específicas del tipo de fibra para la transferencia occidental o guárdelas a -80 °C para su uso futuro.

6. Confirmación del tipo de fibra Western blot

1. Utilice 10 μL de cada muestra específica del tipo de fibra (el volumen mínimo de muestra requerido, consulte el paso 2.1.5).
2. Separe las muestras utilizando el gel prefabricado especificado a través de SDS-PAGE de acuerdo con el protocolo del fabricante.
3. Use un generador de imágenes en gel para detectar la proteína en el gel de acuerdo con el protocolo del fabricante.
4. Coloque el gel en tampón de transferencia frío 1x durante 10 minutos.
5. Transferencia húmeda de las proteínas a una membrana de nitrocelulosa de 0,45 μm (9,5 cm x 13,5 cm) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
6. Después de la transferencia, enjuague brevemente la membrana con H₂O ultrapuro en un recipiente. Vierte el agua ultrapura.
7. Agregue 10 ml de solución potenciadora de la señal de anticuerpos a la membrana y balancee a temperatura ambiente durante 10 minutos.
8. Recupere la solución potenciadora de la señal de anticuerpos y lávese 5 veces (5 s por lavado) con H₂O ultrapuro.
   NOTA: La solución potenciadora de la señal de anticuerpos se puede usar 5 veces antes de desecharla.
9. Vierta el último lavado, agregue la solución de bloqueo y cocine a temperatura ambiente durante 1 h.
10. Use una hoja de bisturí limpia o unas tijeras para cortar horizontalmente a través de la membrana con un peso molecular que asegure que las proteínas de 180 kDa o más estén en la sección superior de la membrana.
11. Utilice esta sección superior para obtener más información sobre el tipo de fibra.
12. Utilice la porción por debajo de 180 kDa para detectar diferentes proteínas diana.
13. En la sección superior de la membrana, siga la sección 4.1 con MHCIIx primario y el anticuerpo secundario HRP de inmunoglobulina M (IgM) de ratón.
14. Extraer la membrana (como se describe en las secciones 4.2.1 y 4.2.2) antes de repetir el proceso con el anticuerpo primario IgG MHCIIa y el anticuerpo IgG HRP secundario de ratón.
15. Retirar una vez más y finalmente aplicar el anticuerpo primario MHCI IgM y el anticuerpo secundario HRP IgM de ratón.
    NOTA: Este paso es cualitativo, por lo que cualquier pérdida de proteínas debido a la extracción de la membrana no es una preocupación.
16. Compare la señal detectada en las diferentes isoformas MHC (como se ve en la Figura 5B). Cuando la intensidad de la señal se detecta a niveles moderados a saturados en la muestra esperada (MHCI - tipo I, MHCIIa - tipo II y MHCIIx - tipo IIx), las muestras específicas del tipo de fibra se registrarán como fiables para su uso en estudios futuros.
17. Registre la muestra como no fiable cuando se detecte por igual más de una isoforma MHC en una muestra.
    PRECAUCIÓN: La solución potenciadora de anticuerpos contiene hidróxido de sodio al 50%. Consulte MSDS para obtener recomendaciones de manejo seguro.

Resultados

Identificación de fibras musculares individuales MHCI, MHCIIa y MHCIIx mediante transferencia de puntos
Una característica de MyDoBID es la categorización de la intensidad variable de la señal MHC y Actina en una fibra determinada (Figura 4A). El tipo de fibra se identificó por la presencia o ausencia de isoformas MHCI e IIa (Figura 4B). Seis fibras no mostraron detección de MHC o actina, lo que indica que no se colectó fibra. Los resu...

Discusión

Recolección de fibra
Sobre la base de varios años de experiencia, la mayoría de los investigadores pueden dominar esta técnica; Sin embargo, la práctica conduce a una recolección de fibra más rápida y eficiente para los análisis posteriores. Para poder aislar 30 segmentos de fibra individuales de una calidad para agrupar, se recomienda recolectar 50 segmentos de fibra por muestra. Se recomienda estudiar cuidadosamente el video de recolección de fibras y después de realizar dos sesiones de p...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x Denaturing buffer	Make according to recipe	Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributing companies	1x denaturing buffer is made by diluting 3x denaturing buffer 1 in 3 v/v with 1X Tris-HCl (pH 6.8). Store at -20 °C.
3x Denaturing buffer	Make according to recipe	Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributors	3x denaturing buffer contains: 0.125M Tris-HCI, 10% glycerol, 4% SDS, 4 M urea, 10% 2-mercaptoethanol, and 0.001% bromophenol blue, pH 6.8.  Store at -20 °C.
95% Ethanol	N/A	100% ethanol can be sourced from any company	Diluted to 95% with ultra-pure H2O.
Actin rabbit polyclonal antibody	Sigma-Aldrich	A2066	Dilute 1 in 1,000 with BSA buffer.
Analytical scales	Mettler Toledo	Model number: MSZ042101
Antibody enhancer	Thermo Fischer Scientific	32110	Product name is Miser Antibody Extender Solution NC.
Beaker (100 mL)	N/A	N/A
Benchtop centrifuge	Eppendorf	5452	Model name: Mini Spin.
Blocking buffer: 5% Skim milk in Wash buffer.	Diploma	Store bought
BSA buffer: 1 % BSA/PBST, 0.02 % NaN3	BSA: Sigma-Aldrich              PBS: Bio-Rad Laboratories. NaN3 : Sigma-Aldrich	BSA: A6003-25G                         10x PBS: 1610780                       NaN3: S2002	Bovine serum albumin (BSA), Phosphate-buffered saline (PBS), and Sodium azide (NaN3). Store at 4 °C.
Cassette opening lever	Bio-Rad Laboratories	4560000	Used to open the precast gel cassettes.
Chemidoc MP Imager	Bio-Rad Laboratories	Model number: Universal hood III	Any imaging system with Stain-Free gel imaging capabilities.
Criterion blotter	Bio-Rad Laboratories	1704070	Includes ice pack, transfer tray, roller, 2 cassette holders, filter paper, foam pads and lid with cables.
Criterion Cell (Bio-Rad)	Bio-Rad Laboratories	1656001
ECL (enhanced chemiluminescence)	Bio-Rad Laboratories	1705062	Product name: Clarity Max Western ECL Substrate.
Electrophoresis buffer 1x Tris Glycine SDS (TGS)	Bio-Rad Laboratories	1610772	Dilute 10x TGS 1 in 10 with ultra-pure H2O.
Filter paper, 0.34 mm thick	Whatmann	3030917	Bulk size 3 MM, pack 100 sheets, 315 x 335 mm.
Fine tissue dissecting forceps	Dumont	F6521-1EA	Jeweller’s forceps no. 5.
Flat plastic tray/lid	N/A	N/A	Large enough to place the membrane on. Ensure the surface is completely flat.
Freeze-drying System	Labconco	7750030	Freezone 4.5 L with glass chamber sample stage.
Freezer -80 oC	N/A	N/A	Any freezer with a constant temperature of -80 °C is suitable.
Gel releasers	1653320	Bio-Rad	Slide under the membrane to gather or move the membrane.
Grey lead pencil	N/A	N/A
Image lab software	Bio-Rad Laboratories	N/A	Figures refers to software version 5.2.1 but other versions can used.
Incubator	Bio-Rad Laboratories	1660521	Any incubator that can be set to 37 °C would suffice.
Lamp	N/A	N/A
Magnetic stirrer with flea	N/A	N/A
Membrane roller	Bio-Rad Laboratories	1651279	Can be purchased in the Transfer bundle pack. However, if this product is not available, any smooth surface cylindrical tube long enough to roll over the membrane would suffice.
Microcentrifuge tubes  (0.6 mL)	N/A	N/A
Mouse IgG HRP secondary	Thermo Fisher Scientific	31430	Goat anti-Mouse IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilute at 1 in 20,000 in blocking buffer.
Mouse IgM HRP secondary	Abcam	ab97230	Goat Anti-Mouse IgM mu chain. Use at the same dilution as mouse IgG.
Myosin Heavy Chain I (MHCI) primary antibody	DSHB	A4.840	Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.
Myosin Heavy Chain IIa (MHCIIa) primary antibody	DSHB	A4.74	Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.
Myosin Heavy Chain IIx (MHCIIx) primary antibody	DSHB	6H1	Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.
Nitrocellulose Membrane 0.45 µm	Bio-Rad Laboratories	1620115	For Western blotting.
Petri dish lid	N/A	N/A
Plastic tweezers	N/A	N/A
Power Pack	Bio-Rad Laboratories	164-5050	Product name: Basic power supply.
Protein ladder	Thermo Fisher Scientific	26616	PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa.
PVDF Membrane 0.2 µm	Bio-Rad Laboratories	1620177
Rabbit HRP secondary	Thermo Fisher Scientific	31460	Goat anti-Rabbit IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilution same as mouse secondary antibodies.
Rocker	N/A	N/A
Ruler	N/A	N/A
Scissors	N/A	N/A
Stereomicroscope	Motic	SMZ-168
Stripping buffer	Thermo Fisher Scientific	21059	Product name: Restore Western Blot Stripping Buffer.
Tissue (lint free)	Kimberly-Clark professional	34120	Product name: Kimwipe.
Transfer buffer (1x Tris Glycine buffer (TG), 20% Methanol)	TG: Bio-Rad Laboratories   Methanol: Merck	TG buffer: 1610771           Methanol: 1.06018	dilute 10x TG buffer with ultra-pure H2O to 1x. Add 100% Methanol to a final concentration of 20% Methanol. Store at 4 °C.
Transfer tray	Bio-Rad Laboratories	1704089
UV-activation precast gel	Bio-Rad Laboratories	5678085	Gel type: 4–15% Criterion TGX Stain-Free Protein Gel, 26 well, 15 µL.
Vortex	N/A	N/A
Wash buffer (1x TBST)	10x TBS: Astral Scientific  Tween 20: Sigma	BIOA0027-4L	1x TBST recipe: 10x Tris-buffered saline (TBS) is diluted down to 1x with ultra-pure H2O, Tween 20 is added to a final concentration of 0.1%. Store buffer at 4 °C.
Wash containers	Sistema	Store bought	Any tupperware container, that suits the approximate dimensions of the membrane would suffice.