ヒト骨格筋の線維型同定

要約

このプロトコルは、ドットブロッティング技術を使用して、ミオシン重鎖(MHC)アイソフォームに従って、凍結乾燥したヒト骨格筋および繊維タイプの分類からの単一繊維の分離を示しています。同定されたMHC IおよびIIファイバーサンプルは、ウェスタンブロッティングを使用して、タンパク質発現におけるファイバータイプ特異的な違いについてさらに分析することができます。

要約

ここで説明する技術は、ドットブロッティング(以下、筋線維タイプのIDエンティフィケーション(MyDoBID)のためのDot BロッティングによるMyosin重鎖検出と呼ぶドットブロッティングを用いて、個々の筋線維のセグメント中の特定のミオシン重鎖(MHC)アイソフォームを同定するために用いることができる。このプロトコルは人間の骨格筋を凍結乾燥し、単一の筋繊維の区分を隔離するプロセスを記述する。MyDoBIDを用いて、I型線維とII型線維をそれぞれMHCI特異的抗体とIIa特異的抗体で分類します。次に、分類されたファイバーは、各生検のファイバータイプ固有のサンプルに結合されます。

各サンプル中の総タンパク質は、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)およびUV活性化ゲル技術によって決定されます。ファイバータイプのサンプルは、ウェスタンブロッティングを使用して検証されます。また、複数のウェスタンブロットで標的タンパク質の検出を強化するために、タンパク質ローディングの正規化を行うことの重要性についても説明します。単繊維ウェスタンブロットと比較して、分類された繊維を繊維タイプ固有のサンプルに統合する利点には、サンプルの多様性、サンプルスループットの向上、投資時間の短縮、コスト削減対策などがあり、均質化された筋肉サンプルでは見落とされがちな繊維タイプ固有の貴重な情報を保持します。プロトコルの目的は、凍結乾燥したヒト骨格筋サンプルから単離されたタイプIおよびタイプII繊維の正確かつ効率的な同定を達成することです。

その後、これらの個々の繊維を組み合わせて、タイプIおよびタイプIIの繊維タイプ固有のサンプルを作成します。さらに、MHCIおよびMHCIIaが陰性であった線維のマーカーとしてアクチンを使用し、ウェスタンブロッティングによってIIx線維として確認されたIIx型線維の同定を含むようにプロトコルを拡張しています。次に、各繊維タイプ固有のサンプルを使用して、ウェスタンブロッティング技術を使用してさまざまな標的タンパク質の発現を定量化します。

概要

骨格筋は不均一な組織であり、細胞(繊維)が遅筋(タイプI)か速筋(タイプII)かに依存する明確な細胞代謝および収縮特性を持っています。繊維の種類は、収縮時間、短縮速度、耐疲労性など、いくつかの点で互いに異なるミオシン重鎖(MHC)アイソフォームを調べることで識別できます¹。主なMHCアイソフォームには、I型、IIa型、IIb型、IIx型があり、それらの代謝プロファイルは酸化性(I型およびIIa型)または解糖系(IIx、IIb^{)のいずれか}です1。これらの繊維の種類の割合は、筋肉の種類や種によって異なります。IIb型はげっ歯類の筋肉に広く見られます。ヒトの筋肉にはIIb型線維は含まれておらず、主にMHCアイソフォームI型およびIIa線維で構成されており、IIx線維の割合はわずか^です2。タンパク質の発現プロファイルは繊維の種類によって異なり、加齢³、運動^4,5、疾患⁶によって変化する可能性があります。

異なる骨格筋線維タイプの細胞応答を測定することは、筋ホモジネート(すべての線維タイプの混合物)の検査のために見落とされたり、不可能になったりすることがよくあります。単繊維ウェスタンブロットは、個々の筋線維中の複数のタンパク質の調査を可能にします⁷。この方法論は、ホモジネート調製物では得られなかった新規で有益な単繊維特性を生み出すために以前に利用されてきました。しかし、当初のシングルファイバーウェスタンブロット法には、時間がかかること、サンプルの複製ができないこと、高価で高感度な化学発光(ECL)試薬の使用など、いくつかの限界がありました。新鮮な組織を使用する場合、この方法は、限られた時間枠(すなわち、1〜2時間)内に個々の繊維を単離する必要があるという時間的制約のためにさらに制限されます。幸いなことに、この拘束は、凍結乾燥組織から単線維セグメントを単離することによって緩和^{される8。}ただし、凍結乾燥サンプルからの繊維収集は、生検組織のサイズと品質によって制限されます。

ドットブロッティング法⁹を用いた繊維タイプの同定は、この包括的なプロトコルにおいて大幅に精緻化され、拡張された。以前、わずか2~10mgの湿潤重量の筋肉組織が凍結乾燥および単繊維MHCアイソフォームタンパク質分析に十分であることが実証されています⁹。Christensen et ^al.9 は、ドットブロッティングによって存在する MHC アイソフォームを検出するために、~1 mm のファイバーセグメントの 30% を使用し、これはウェスタンブロッティングによって確認されました。この研究では、ウェスタンブロッティングをドットブロッティングに置き換えることで、全体的なコストが~40倍削減されることが示されました(ファイバーセグメント50個分)。その後、繊維をタイプIおよびタイプIIのサンプルに「プール」し、実験^{的な複製を可能にし}た9。それにもかかわらず、限界は、タイプI(MHCI陽性)とタイプII(MHCII陽性繊維)の2つの繊維タイプ固有のサンプルしか得られず、タイプIIサンプルにはMHCIIaとMHCIIx^の混合物が含まれていることでした^6,10。特に、現在のプロトコルは、純粋なIIx型ファイバーの同定方法を示しており、一般的なプロトコルの問題に対するトラブルシューティング戦略を含む、非常に詳細なワークフロー(図1に要約)を提供しています。

プロトコル

ヒトの筋肉サンプルは、局所麻酔(キシロカイン)と手動吸引用に改造されたバーグストローム針を使用した無菌条件下で70〜74歳のn = 3(男性2人、女性1人)の外側広筋から採取されました^11,12。サンプルは、ビクトリア大学ヒト研究倫理委員会(HRETH11/221)によって承認され、ヘルシンキ宣言¹³に従って実施された以前の研究のサブセットでした。参加者は、この研究に参加するために書面によるインフォームドコンセントを提供しました。このプロトコルに必要なすべての材料の詳細は、材料表に示されています。さらに、一般的なプロトコルの問題に対処するトラブルシューティング戦略のリストを表 1 に示します。

1.フリーズドライ

1. 生検された筋肉サンプルをドライアイスで凍結したまま、空の凍結チューブを体重計で計量し、風袋引きします。
2. 最低10mgの湿重量凍結組織を速やかに計量する。重量を小数点以下1桁まで記録します。
3. 蓋に3〜4個の穴が開けられた予冷された微量遠心チューブに組織を堆積させ、ドライアイスのペレットを2〜3個入れた小さなビーカーに入れます。
4. 凍結乾燥機の製造元の取扱説明書に従ってください。
5. 凍結乾燥機のすべてのバルブが閉じていることを確認し、凍結乾燥機のスイッチを入れます。
6. コントロールパネルを使用して、真空設定値が人体組織に最適な凍結乾燥条件( 0.12ミリバール(mBar)) にプログラムされていることを確認します(図2)。
7. 凍結乾燥機の 手動 を押し、チャンバーが-40 ^°Cに冷えるまで待ちます。
8. チャンバーがその温度に達したら、蓋を外し、次にガラスチャンバーを取り外し、ビーカー(筋肉サンプルを含む)を金属ステージに置きます。
9. ガラスチャンバーと蓋を交換してください。蓋の真空リリースバルブを閉じ、真空スケールライトが緑色に変わるまで待って、乾燥機が真空シールされていることを確認します。
10. 筋肉サンプルを48時間凍結乾燥します。凍結乾燥が完了したら、真空ボタンを押して真空ポンプをオフにし、蓋の真空リリースバルブを開きます。
11. チャンバーの蓋を外し、凍結乾燥したサンプルを回収します。組織の重量を量り、小数点以下1桁まで重量を記録します。
12. 体重の減少率を計算します。~75%の重量減少は、組織が凍結乾燥に成功したことを示します(この研究では、平均±SD、76±9%、n = 11の筋肉サンプル)。
13. AUTOを押して、真空ポンプと冷凍庫のスイッチを切ります。ユニットが周囲温度に達するまで待ちます。
14. 製造元の指示に従って冷却コイルを清掃し、蓄積した液体をコレクターから排出します。
    注意: ファイバーの収集はすぐに開始できます。組織を繊維の分離に使用しない場合は、凍結乾燥したサンプルをデシケータービーズ付きの密閉容器に-80°Cで保管してください。 注意:ドライアイスは危険です(クラス9)。推奨される安全な取り扱いについては、MSDSを参照してください。

2.繊維の収集

1. 繊維回収の準備
   1. 最低50本のマイクロチューブ(ファイバー1〜50)に標識し、各チューブに10 μLの変性バッファーをピペットで固定します。
   2. 2組の微細組織解剖鉗子、糸くずの出ない組織、卓上ランプ、実体顕微鏡(黒いステージを上にした状態)、ボルテックス、および卓上遠心分離機で採取エリアを準備します。
   3. 凍結乾燥した筋肉サンプルをペトリ皿の蓋に置きます。解剖顕微鏡のステージに蓋を置きます。
   4. 単繊維解剖のビデオをご覧ください。研究を開始する前に、繊維の収集から単一繊維タイプの識別までの完全なプロトコルを少なくとも2回練習してください。
   5. 繊維採取の前に、 各生検から繊維タイプサンプルに必要な総量 を次のように計算します。例えば、開始容量が 1 ファイバー = 10 μL で、MyDoBID 後の残量が (1 ファイバー × 10 μL) - ドットブロッティングに使用した 1 μL = 9 μL (サンプル量) の場合、サンプル容量 (μL) に実行するウェスタンブロットの総数を掛けて 必要な総サンプル 量を計算し、冗長性を考慮してこの量を 2 倍にします。 (9 μL × 4ウェスタンブロット) × 2 = 72 μL。 最終必要サンプル量(μL)をファイバータイプ固有のサンプルあたりのサンプル量で割ることにより、タイプされたサンプルあたりに必要なファイバー数を計算します(たとえば、 ファイバータイプ固有のサンプルあたり 72 μL÷9 μL = 8ファイバー)。これを達成するには、合計50本の繊維を収集します。
      注:必要なサンプル量は、ロードされたタンパク質の量が各サンプルのファイバー ~3 mm(湿重量~12 μg)に相当する場合、MyDoBID とウェスタンブロッティングの両方を実行するために必要な最小タンパク質濃度です(詳細については、補足ファイル 1 を参照)。ただし、この容量は、特定のタンパク質にリピートゲルが必要かどうかを考慮していません。 注意: 鉗子は鋭利です。皮膚に穴を開ける危険を避けるために、注意して取り扱ってください。
2. 単芯ファイバー絶縁
   1. 5cm×1cmの小紙に定規を使って1cmの線を引きます。その線に1mmごとにマークを付けます。
   2. これをシャーレの蓋の下にガイドとして挿入し、収集された繊維の長さを推定します。
   3. 凍結乾燥した筋肉サンプルを低倍率(7.5倍)で実体顕微鏡の下に置きます。1組の微細組織解剖鉗子を使用して凍結乾燥した筋肉を所定の位置に保持し、もう1組で繊維の小さな束を分離し始めます(ビデオを参照)。
   4. 繊維の 1 つの束を単離し、単一の繊維セグメントが束から分離されるまで引き離し続けます。
   5. 長さが少なくとも~1mmの繊維を最低50本集めます。
   6. ファイバーをペトリ皿の空きスペースに移動します。単繊維セグメントを高倍率(50倍)で検査します。最後にファイバーをさらに分離して、単一のファイバーであることを確認します。繊維が分離せずに壊れる場合、それは単一の繊維です。
3. 繊維の変性
   1. 鉗子を使用して、繊維を静かに回収し、分注した変性バッファーに直接入れます(鉗子がバッファーに接触しないようにしてください)。
   2. 顕微鏡で鉗子をチェックして、繊維が正常に除去されたことを確認します。チューブを閉じ、ベンチでチューブの底をしっかりと3回叩いて、ファイバーがバッファーに移動するようにします。
   3. 次の繊維に移る前に、糸くずの出ないティッシュで鉗子をきれいに拭きます。すべての繊維が収集されるまで、このプロセスを繰り返します。
   4. ファイバーサンプルをボルテックスし、2,500 × g で5秒間短時間遠心分離して、サンプルをチューブの底に引き込みます。
      注:遠心分離時間(5秒)は、開始(0 × g)から速度が~2,500 × gに達するまでの時間です。
   5. サンプルを室温で1時間放置します。将来の使用のために-80°Cで保管してください。使用前にサンプルを凍結してから解凍してください。

3. ドットブロッティング

1. メンブレンの調製と活性化
   1. 50 サンプル(~10.5 cm x 5.5 cm)に適合するように、1 つのポリフッ化二フッ化ビニリデン(PVDF)メンブレン(孔径 0.2 μm)のサイズに測定、標識、および切断します。
   2. 左の境界線を上から下 (1 から 10) の数字でマークし、上の境界線を左から右 (A から E) のアルファベット順に 1 cm 間隔でマークします。
   3. 12.5cm×7.5cmのろ紙を4枚用意します。
   4. 2枚のシートを重ねて積み重ねます。ろ紙スタックを1x転写バッファーに事前に浸します。
   5. メンブレンを容器に入れます。95%エタノールをメンブレンに注ぎ、メンブレンを完全に浸すのに十分な量(10〜15 mL)を注ぎます。ロッカーで1分間攪拌します。
   6. エタノールを回収し、メンブレンを 1 倍転写バッファー(~15 mL)に浸し、さらに 2 分間揺石します。
      注:エタノールと転写バッファーはどちらも、沈降が形成されるまで(6回使用すると交換)、将来のドットブロッティング実験に再利用できます。
   7. 転写バッファーを浸した濾紙を大きな蓋などの平らな可動面に置き、ローラーで平らにします。PVDFメンブレンをゲルリリーサーまたはピンセットを使用してスタック上に配置します。
   8. メンブレンの上に乾いた濾紙を1枚置き、ローラーを濾紙の上で動かして、メンブレン表面の余分なバッファーを吸収します。メンブレンをこすらずに上部のろ紙を取り除きます。
      注意:メタノール(クラス3、サブリスク6.1)とエタノール(クラス3)は危険です。安全な取り扱いに関する推奨事項については、製品安全データシート(MSDS)を参照してください。
2. メンブレンへのサンプル吸収
   1. 繊維サンプルを解凍し、ステップ2.3.4と同様に室温で短時間の遠心分離(5秒)を行い、サンプルを完全に混合します。
   2. ピペットチップでメンブレンに触れずに、各サンプルの~1 μL滴をメンブレンの所定の領域にゆっくりと堆積させます。繊維サンプルあたりの指定面積の寸法は、~1 cm x 1 cm です。この領域の中心にあるサンプルを見つけることを目指しています。
   3. サンプル液滴をメンブレンに少なくとも15分間浸します。サンプルバッファーが残っておらず、完全に吸収されていることを確認してください。
   4. プラスチックピンセットを使用して、湿らせた濾紙のスタックからメンブレンを慎重に持ち上げ、1枚の乾いた濾紙の上に置き、メンブレンを少なくとも5分間脱水します。
   5. サンプルの斑点が完全に白くなったら、メンブレンを再活性化します。
3. 膜の再活性化とブロック
   1. 手順3.1.5と3.1.6を繰り返して、メンブレンを再活性化します。
   2. メンブレンを洗浄バッファーに入れ、ロッキングしながら5分間すすぎます。洗浄バッファーを廃棄します。
   3. メンブレンをブロッキングバッファー中で30分間、ロッキングしながらインキュベートします。
   4. 緩衝液が曇らなくなるまで、洗浄バッファーでメンブレンを3回すすぎます。
   5. メンブレンはロッカーでの最終洗浄時に残しておきます。

4. 免疫標識

1. MHCIIaの検出
   1. MHCIIa一次抗体を10 mLのウシ血清アルブミン(BSA)緩衝液中で200分の1に希釈します。
   2. 洗浄バッファーをメンブレンから廃棄し、希釈したMHCIIa抗体をメンブレンに注ぎます。
   3. 容器(MHCIIaのメンブレン付き)をロッカーに置き、室温で2時間または4°Cで一晩。
   4. MHCIIa抗体を回収し、4°Cで保存してください。 メンブレンをブロッキングバッファーでロッカー上で2分間洗浄します。
      注:すべての一次抗体は、バッファーが透明である限り、最大5倍まで再利用できます。
   5. さらに2回すすいでください。毎回5分。合計3回の洗浄。
   6. マウス免疫グロブリンG西洋ワサビペルオキシダーゼ(IgG-HRP)二次抗体を10 mLのブロッキングバッファーで20,000分の1で希釈し、メンブレンに添加します。
   7. 洗浄バッファーを廃棄し、マウスIgG-HRPセカンダリーでメンブレンを1時間ロッキングしながらインキュベートします。
   8. 二次膜を廃棄し、洗浄バッファー(2、5、5分)でメンブレンを洗浄します。
   9. イメージングの準備が整うまで、メンブレンを最終洗浄に浸しておきます。
   10. ゲルイメージャーの電源を入れ、イメージャーが必要な動作温度に達するまで15分間待ってから、イメージングソフトウェアを開きます( 材料表を参照)。
   11. ソフトウェアウィンドウで、[ New Single Channel Protocol](新しいシングルチャネルプロトコル )をクリックします(図3A)。メンブレンの白色光画像の場合は、[ アプリケーション] |しみ | [ 比色] をクリックします(図3B)。
   12. ゲル領域をクリックします。各オプションは、さまざまなゲルタイプのサイズに合わせて特定の寸法にプログラムされています。メンブレンの寸法に最も適した適切なオプションを選択します(図3C)。
   13. ルミノール試薬とペルオキシダーゼ試薬を1:1の比率で組み合わせてECLを調製します。メンブレン全体を覆うのに十分な量のECL混合物を作成し、通常、総容量は800〜1,000μLが必要です。
   14. メンブレンを大きな透明なプラスチックトレイに置き、ECL混合物をメンブレンに分散させます。
   15. メンブレンをイメージングプレートの上に置きます。
   16. Position Gel(黄色のボタン)をクリックすると、ライブカメラビューが表示されます。ズームボタンをクリックしたままドラッグすると、メンブレンのイメージング領域が最大化されます。この時点で、必要に応じてメンブレンの位置をまっすぐにします。
   17. Run Protocol(緑色のボタン)をクリックし、メンブレンの比色画像が生成されるのを待ちます。この画像を保存して、ドットを対応するファイバーサンプルに一致させます。
   18. メンブレンを動かさずに、 2 x 2ビニング (Chemi High Resolution)のオプションをクリックして、ソフトウェア上のアプリケーションを変更します(図3D)。
   19. [Image exposure and software](画像の露出とソフトウェア)で、露光時間を最適化し、[Faint Bands](フェイントバンド)(図3E)|信号蓄積モード。
   20. [Setup](設定)で、最初の画像に1秒、最後の画像に30秒、合計30枚の画像を入力します(図3F)。
   21. [ Run Protocol] をクリックします。
   22. 信号が飽和する前(目に見えるすべてのドットが黒くなる)、最初の信号が飽和する前(一部のドットが飽和し始める)、および過飽和スポット(強い信号が検出されたすべてのスポットが飽和する)の段階で画像を保存します。
   23. 信号の蓄積を終了する前に、必要なすべてのイメージを保存します。イメージャーからメンブレンを取り出します。
   24. ゲルリリーサーを使用して、メンブレンを洗浄バッファーの入った容器に戻します。
2. MHCIの検出
   1. 洗浄バッファーを注ぎ、ストリッピングバッファーで37°Cで30分間メンブレンを処理します(メンブレンが完全に浸漬していることを確認してください)。
   2. ストリッピングバッファーを回収し、メンブレンを洗浄バッファーでロッキングしながら 5 分間すすぎます。
      注:ストリッピングバッファは、廃棄する前に10倍再利用できます。
   3. 洗浄バッファーを注ぎ、今度は開始濃度200分の1(範囲:200分の1から500分の1)に希釈したMHCI一次抗体を塗布します。メンブレンを室温で1時間揺り動かします。
   4. MHCI一次抗体でインキュベートした後、抗体を回収し、ステップ4.1.4および4.1.5に従ってメンブレンを洗浄します。
   5. マウスIgM HRP二次抗体をブロッキングバッファー中で20,000分の1に希釈します。メンブレンからブロッキングバッファーを流し出し、ステップ4.1.7と同様にマウスIgMセカンダリーでインキュベートします。
   6. 洗浄と画像キャプチャは、手順4.1.8から4.1.24のようにMHCIを検出しました。
      注意:剥離バッファーには、有機ホスフィン3〜5%(クラス8)が含まれています。安全な取り扱いに関する推奨事項については、MSDSを参照してください。
3. アクチンを用いたMHCIIx候補の検出
   1. もう一度メンブレンを剥がします(手順4.2.1および4.2.2)。
   2. セクション4.1を繰り返し、今度はアクチン一次抗体をBSA緩衝液で500分の1に希釈し、次に20,000分の1で希釈したウサギHRP二次抗体をブロッキング緩衝液で適用します。

5. ファイバータイプの識別

1. MHCI、MHCIIa、アクチンシグナル解析
   1. 信号強度パネル(図4A)をよく理解します。手順 5.1.2 から 5.1.4 をメモします。
   2. 飽和シグナル強度は、タンパク質の検出が強いことを定性的に示しています。
   3. 中程度は、標的タンパク質が中程度に存在することを示します。
   4. 微弱なシグナルは、標的タンパク質がほとんど存在しないことを示しています。
   5. 信号強度パネルを使用して、信号強度が「飽和」、「中程度」、または「微弱」のファイバーを分類します(図4A)。
   6. 最初にMHCIIaとMHCIの結果を比較して、ファイバータイプの同定を行います(図4B、左および中央のブロット)。
   7. 1つのMHCアイソフォームのみの飽和または中程度のシグナル強度を持つファイバーを記録します。
   8. MHCアイソフォームシグナルが「微弱」な場合は、ファイバーにマークを付けないままにします( 図4Bを参照)。
   9. 最後に、MHCIまたはIIaが検出されないファイバーでアクチンが観察された場合(中程度または飽和シグナル強度)は、それを潜在的なIIx型ファイバーとして記録します(図4B、右ブロット)。
   10. MHCアイソフォームシグナルが微弱であるが、アクチンが検出された(中程度または飽和強度)ファイバーを未同定として記録します。
   11. 3 つの標的タンパク質すべてについて、検出が微弱または検出されない(繊維が回収されない)サンプルは廃棄します(図 4C)。
   12. MHCI信号とMHCII信号の両方が「飽和」または中程度の信号で検出されたファイバーを記録します。これらのサンプルは、繊維タイプ固有の調製には使用できません。
2. 繊維種別サンプルの調製
   1. 生検ごとに個別のタイプIとタイプIIのサンプルを準備します。タイプIIサンプルの場合、MHCIIaが飽和レベルまたは中程度のレベルで検出されるファイバーの最小必要数(ステップ2.1.5で計算)を組み合わせます。
   2. タイプIとラベル付けされた別のチューブで、MHCIが検出されたファイバーに対してこのプロセスを繰り返します(図4D)。
   3. 飽和した信号を持つファイバーが十分にない場合は、中程度の信号強度のファイバーを使用します。
   4. 潜在的なIIxファイバーを組み合わせます。
   5. ウェスタンブロッティングには、ファイバータイプ固有のサンプルを直ちに使用するか、将来の使用のために-80°Cで保存してください。

6. ウェスタンブロット繊維の種類の確認

1. 各ファイバータイプ固有のサンプルを10 μL利用します(必要な最小サンプル量、ステップ2.1.5を参照)。
2. メーカーのプロトコルに従って、SDS-PAGEを介して指定されたプレキャストゲルを使用してサンプルを分離します。
3. ゲルイメージャーを使用して、メーカーのプロトコルに従ってゲル中のタンパク質を検出します。
4. ゲルを冷たい1x転写バッファーに10分間入れます。
5. メーカーのプロトコルに従って、タンパク質を0.45 μmのニトロセルロースメンブレン(9.5 cm x 13.5 cm)に湿式転写します。
6. 転写後、容器内で超高純度H₂Oでメンブレンを短時間すすぎます。超純水を注ぎます。
7. 10 mLの抗体シグナルエンハンサー溶液をメンブレンに加え、室温で10分間揺るがします。
8. 抗体シグナルエンハンサー溶液を回収し、超高純度_H2Oで5回(1回の洗浄あたり5秒)洗浄します。
   注:抗体シグナルエンハンサー溶液は、廃棄する前に5回使用できます。
9. 最後の洗浄液を注ぎ、ブロッキング溶液を加え、室温で1時間揺石します。
10. 清潔なメスの刃またはハサミを使用して、180 kDa以上のタンパク質が膜の上部にあることを確認する分子量で膜を横切って水平に切断します。
11. この上部セクションを使用して、ファイバータイプをさらに確認します。
12. 180 kDa未満の部分を使用して、さまざまなターゲットタンパク質を検出します。
13. メンブレンの上部に、セクション4.1に従ってMHCIIx一次抗体およびマウス免疫グロブリンM(IgM)HRP二次抗体を添加します。
14. メンブレンを剥がしてから(セクション4.2.1および4.2.2に記載)、MHCIIa IgG一次抗体およびマウスIgG HRP二次抗体でこのプロセスを繰り返します。
15. もう一度剥がし、最後にMHCI IgM一次抗体とマウスIgM HRP二次抗体を塗布します。
    注:このステップは定性的なものであるため、メンブレンストリッピングによるタンパク質の損失は問題になりません。
16. 異なるMHCアイソフォームで検出されたシグナルを比較します( 図5Bを参照)。予想されるサンプル(MHCI - タイプI、MHCIIa - タイプII、MHCIIx - タイプIIx)で信号強度が中程度から飽和レベルで検出された場合、ファイバータイプ固有のサンプルは、将来の研究で使用するために信頼できるものとして記録されます。
17. 1つのサンプルで複数のMHCアイソフォームが等しく検出された場合、サンプルを信頼できないものとして記録します。
    注意:抗体エンハンサー溶液には水酸化ナトリウムが50%含まれています。安全な取り扱いに関する推奨事項については、MSDSを参照してください。

結果

ドットブロッティングを用いたMHCI、MHCIIa、MHCIIx筋線維の個体同定
MyDoBIDの特徴は、特定のファイバー内のさまざまなMHCおよびアクチンシグナル強度を分類することです(図4A)。繊維の種類は、MHCIおよびIIaアイソフォームの有無によって識別されました(図4B)。6本のファイバーはMHCまたはアクチンの検出を示さず、ファイバーが回収さ?...

ディスカッション

繊維の収集
数年の経験に基づいて、ほとんどの研究者はこの手法を習得できます。しかし、実践することで、下流分析のためのファイバー収集をより迅速かつ効率的に行うことができます。プーリング用に品質の 30 本の単一ファイバーセグメントを分離できるようにするには、サンプルごとに 50 本のファイバーセグメントを収集することをお勧めします。妥当な基準を達成?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x Denaturing buffer	Make according to recipe	Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributing companies	1x denaturing buffer is made by diluting 3x denaturing buffer 1 in 3 v/v with 1X Tris-HCl (pH 6.8). Store at -20 °C.
3x Denaturing buffer	Make according to recipe	Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributors	3x denaturing buffer contains: 0.125M Tris-HCI, 10% glycerol, 4% SDS, 4 M urea, 10% 2-mercaptoethanol, and 0.001% bromophenol blue, pH 6.8.  Store at -20 °C.
95% Ethanol	N/A	100% ethanol can be sourced from any company	Diluted to 95% with ultra-pure H2O.
Actin rabbit polyclonal antibody	Sigma-Aldrich	A2066	Dilute 1 in 1,000 with BSA buffer.
Analytical scales	Mettler Toledo	Model number: MSZ042101
Antibody enhancer	Thermo Fischer Scientific	32110	Product name is Miser Antibody Extender Solution NC.
Beaker (100 mL)	N/A	N/A
Benchtop centrifuge	Eppendorf	5452	Model name: Mini Spin.
Blocking buffer: 5% Skim milk in Wash buffer.	Diploma	Store bought
BSA buffer: 1 % BSA/PBST, 0.02 % NaN3	BSA: Sigma-Aldrich              PBS: Bio-Rad Laboratories. NaN3 : Sigma-Aldrich	BSA: A6003-25G                         10x PBS: 1610780                       NaN3: S2002	Bovine serum albumin (BSA), Phosphate-buffered saline (PBS), and Sodium azide (NaN3). Store at 4 °C.
Cassette opening lever	Bio-Rad Laboratories	4560000	Used to open the precast gel cassettes.
Chemidoc MP Imager	Bio-Rad Laboratories	Model number: Universal hood III	Any imaging system with Stain-Free gel imaging capabilities.
Criterion blotter	Bio-Rad Laboratories	1704070	Includes ice pack, transfer tray, roller, 2 cassette holders, filter paper, foam pads and lid with cables.
Criterion Cell (Bio-Rad)	Bio-Rad Laboratories	1656001
ECL (enhanced chemiluminescence)	Bio-Rad Laboratories	1705062	Product name: Clarity Max Western ECL Substrate.
Electrophoresis buffer 1x Tris Glycine SDS (TGS)	Bio-Rad Laboratories	1610772	Dilute 10x TGS 1 in 10 with ultra-pure H2O.
Filter paper, 0.34 mm thick	Whatmann	3030917	Bulk size 3 MM, pack 100 sheets, 315 x 335 mm.
Fine tissue dissecting forceps	Dumont	F6521-1EA	Jeweller’s forceps no. 5.
Flat plastic tray/lid	N/A	N/A	Large enough to place the membrane on. Ensure the surface is completely flat.
Freeze-drying System	Labconco	7750030	Freezone 4.5 L with glass chamber sample stage.
Freezer -80 oC	N/A	N/A	Any freezer with a constant temperature of -80 °C is suitable.
Gel releasers	1653320	Bio-Rad	Slide under the membrane to gather or move the membrane.
Grey lead pencil	N/A	N/A
Image lab software	Bio-Rad Laboratories	N/A	Figures refers to software version 5.2.1 but other versions can used.
Incubator	Bio-Rad Laboratories	1660521	Any incubator that can be set to 37 °C would suffice.
Lamp	N/A	N/A
Magnetic stirrer with flea	N/A	N/A
Membrane roller	Bio-Rad Laboratories	1651279	Can be purchased in the Transfer bundle pack. However, if this product is not available, any smooth surface cylindrical tube long enough to roll over the membrane would suffice.
Microcentrifuge tubes  (0.6 mL)	N/A	N/A
Mouse IgG HRP secondary	Thermo Fisher Scientific	31430	Goat anti-Mouse IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilute at 1 in 20,000 in blocking buffer.
Mouse IgM HRP secondary	Abcam	ab97230	Goat Anti-Mouse IgM mu chain. Use at the same dilution as mouse IgG.
Myosin Heavy Chain I (MHCI) primary antibody	DSHB	A4.840	Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.
Myosin Heavy Chain IIa (MHCIIa) primary antibody	DSHB	A4.74	Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.
Myosin Heavy Chain IIx (MHCIIx) primary antibody	DSHB	6H1	Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.
Nitrocellulose Membrane 0.45 µm	Bio-Rad Laboratories	1620115	For Western blotting.
Petri dish lid	N/A	N/A
Plastic tweezers	N/A	N/A
Power Pack	Bio-Rad Laboratories	164-5050	Product name: Basic power supply.
Protein ladder	Thermo Fisher Scientific	26616	PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa.
PVDF Membrane 0.2 µm	Bio-Rad Laboratories	1620177
Rabbit HRP secondary	Thermo Fisher Scientific	31460	Goat anti-Rabbit IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilution same as mouse secondary antibodies.
Rocker	N/A	N/A
Ruler	N/A	N/A
Scissors	N/A	N/A
Stereomicroscope	Motic	SMZ-168
Stripping buffer	Thermo Fisher Scientific	21059	Product name: Restore Western Blot Stripping Buffer.
Tissue (lint free)	Kimberly-Clark professional	34120	Product name: Kimwipe.
Transfer buffer (1x Tris Glycine buffer (TG), 20% Methanol)	TG: Bio-Rad Laboratories   Methanol: Merck	TG buffer: 1610771           Methanol: 1.06018	dilute 10x TG buffer with ultra-pure H2O to 1x. Add 100% Methanol to a final concentration of 20% Methanol. Store at 4 °C.
Transfer tray	Bio-Rad Laboratories	1704089
UV-activation precast gel	Bio-Rad Laboratories	5678085	Gel type: 4–15% Criterion TGX Stain-Free Protein Gel, 26 well, 15 µL.
Vortex	N/A	N/A
Wash buffer (1x TBST)	10x TBS: Astral Scientific  Tween 20: Sigma	BIOA0027-4L	1x TBST recipe: 10x Tris-buffered saline (TBS) is diluted down to 1x with ultra-pure H2O, Tween 20 is added to a final concentration of 0.1%. Store buffer at 4 °C.
Wash containers	Sistema	Store bought	Any tupperware container, that suits the approximate dimensions of the membrane would suffice.