Identificazione del tipo di fibra del muscolo scheletrico umano

Riepilogo

Questo protocollo dimostra l'isolamento di una singola fibra dal muscolo scheletrico umano liofilizzato e la classificazione del tipo di fibra in base all'isoforma della catena pesante della miosina (MHC) utilizzando la tecnica del dot blotting. I campioni di fibre MHC I e II identificati possono quindi essere ulteriormente analizzati per le differenze specifiche del tipo di fibra nell'espressione proteica utilizzando il western blotting.

Abstract

La tecnica qui descritta può essere utilizzata per identificare specifiche isoforme della catena pesante della miosina (MHC) in segmenti di singole fibre muscolari utilizzando il dot blotting, di seguito denominato rilevamento della catena pesante della miaosina mediante lotto Dot Bper l'entificazione IDdel tipo di fibra muscolare (MyDoBID). Questo protocollo descrive il processo di liofilizzazione del muscolo scheletrico umano e l'isolamento di segmenti di singole fibre muscolari. Utilizzando MyDoBID, le fibre di tipo I e II sono classificate rispettivamente con anticorpi specifici per MHCI e IIa. Le fibre classificate vengono quindi combinate in campioni specifici per ogni biopsia.

La proteina totale in ciascun campione è determinata mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide di sodio dodecil-solfato (SDS-PAGE) e tecnologia gel attivata dai raggi UV. Il tipo di fibra dei campioni viene convalidato utilizzando il western blotting. Viene inoltre descritta l'importanza di eseguire la normalizzazione del carico proteico per migliorare il rilevamento della proteina bersaglio in più western blot. I vantaggi del consolidamento delle fibre classificate in campioni specifici per il tipo di fibra rispetto ai western blot a fibra singola includono la versatilità del campione, l'aumento della produttività del campione, l'investimento di tempo più breve e le misure di risparmio sui costi, il tutto mantenendo preziose informazioni specifiche sul tipo di fibra che vengono spesso trascurate utilizzando campioni muscolari omogeneizzati. Lo scopo del protocollo è quello di ottenere un'identificazione accurata ed efficiente delle fibre di tipo I e di tipo II isolate da campioni di muscolo scheletrico umano liofilizzato.

Queste singole fibre vengono successivamente combinate per creare campioni specifici per il tipo di fibra di tipo I e di tipo II. Inoltre, il protocollo è stato esteso per includere l'identificazione delle fibre di tipo IIx, utilizzando l'actina come marcatore per le fibre che erano negative per MHCI e MHCIIa, che sono confermate come fibre IIx mediante western blotting. Ogni campione specifico per tipo di fibra viene quindi utilizzato per quantificare l'espressione di varie proteine bersaglio utilizzando tecniche di western blotting.

Introduzione

Il muscolo scheletrico è un tessuto eterogeneo, con distinte proprietà cellulari, metaboliche e contrattili che dipendono dal fatto che la cellula (fibra) sia a contrazione lenta (tipo I) o a contrazione rapida (tipo II). Il tipo di fibra può essere identificato esaminando le isoforme della catena pesante della miosina (MHC), che differiscono l'una dall'altra in diversi modi, tra cui il tempo di contrazione, la velocità di accorciamento e la resistenza alla fatica¹. Le principali isoforme MHC includono il tipo I, il tipo IIa, il tipo IIb e il tipo IIx e i loro profili metabolici sono ossidativi (tipo I e IIa) o glicolitici (IIx, IIb)¹. La proporzione di questi tipi di fibre varia nel tipo di muscolo e tra le specie. Il tipo IIb è ampiamente presente nel muscolo dei roditori. I muscoli umani non contengono fibre di tipo IIb e sono costituiti prevalentemente da fibre isoforme MHC di tipo I e IIa, con una piccola percentuale di fibre IIx². I profili di espressione proteica variano tra i diversi tipi di fibre e possono essere alterati con l'invecchiamento³, l'esercizio fisico ^4,5 e la malattia⁶.

La misurazione delle risposte cellulari in diversi tipi di fibre muscolari scheletriche è spesso trascurata o non è possibile a causa dell'esame degli omogenati muscolari (un mix di tutti i tipi di fibre). Il western blot a fibra singola consente l'indagine di più proteine nelle singole fibre muscolari⁷. Questa metodologia è stata precedentemente utilizzata per produrre caratteristiche nuove e informative della singola fibra che non era possibile ottenere utilizzando preparati omogeneizzati. Tuttavia, ci sono alcune limitazioni della metodologia originale del western blot a fibra singola, tra cui la natura dispendiosa in termini di tempo, l'incapacità di generare repliche del campione e l'uso di reagenti a chemiluminescenza potenziata (ECL) costosi e sensibili. Se si utilizza tessuto fresco, questo metodo è ulteriormente limitato a causa dei vincoli di tempo dovuti alla necessità di isolare le singole fibre entro un periodo di tempo limitato (ad esempio, 1-2 ore). Fortunatamente, questa restrizione è mitigata isolando segmenti di fibra singola dal tessuto liofilizzato⁸. Tuttavia, la raccolta di fibre da campioni liofilizzati è limitata dalle dimensioni e dalla qualità del tessuto sottoposto a biopsia.

L'identificazione del tipo di fibra utilizzando il metodo del dot blotting⁹ è stata significativamente elaborata e ampliata in questo protocollo completo. In precedenza, è stato dimostrato che un minimo di ~2-10 mg di tessuto muscolare umido è adeguato per la liofilizzazione e l'analisi della proteina isoforma MHC a fibra singola⁹. Christensen et ^al.9 hanno utilizzato il 30% di un segmento di fibra di ~1 mm per rilevare l'isoforma MHC presente mediante dot blotting, che è stata confermata dal western blotting. Questo lavoro ha dimostrato che sostituendo il western blotting con il dot blotting, i costi complessivi sono stati ridotti di ~ 40 volte (per 50 segmenti di fibra). Le fibre sono state poi "raggruppate" in campioni di tipo I e di tipo II, che hanno permesso la replicazione sperimentale⁹. Tuttavia, una limitazione è stata che sono stati ottenuti solo due campioni specifici per tipo di fibra: di tipo I (MHCI positivo) e di tipo II (fibre MHCII positive), con campioni di tipo II contenenti una miscela di MHCIIa e MHCIIx ^6,10. In particolare, il protocollo corrente dimostra come è possibile identificare le fibre pure di tipo IIx e fornisce un flusso di lavoro altamente dettagliato (riepilogato nella Figura 1), comprese le strategie di risoluzione dei problemi comuni del protocollo.

Protocollo

Campioni di muscolo umano sono stati ottenuti dal vasto laterale di n = 3 (2 maschi, 1 femmina), di età compresa tra 70 e 74 anni in condizioni sterili utilizzando l'anestesia locale (xilocaina) e un ago di Bergstrom modificato per l'aspirazione manuale^11,12. I campioni erano un sottoinsieme di uno studio precedente approvato dal Comitato Etico per la Ricerca Umana dell'Università di Victoria (HRETH11/221) e condotto in conformità con la Dichiarazione di Helsinki¹³. I partecipanti hanno fornito il consenso scritto e informato per partecipare a questo studio. I dettagli completi di tutti i materiali richiesti per questo protocollo sono riportati nella Tabella dei materiali. Inoltre, nella Tabella 1 viene fornito un elenco di strategie di risoluzione dei problemi che risolvono i problemi comuni del protocollo.

1. Liofilizzazione

1. Mantenendo i campioni muscolari sottoposti a biopsia congelati su ghiaccio secco, pesare e tarare una provetta congelata vuota sulla bilancia.
2. Pesare rapidamente un minimo di 10 mg di tessuto congelato a peso umido. Registrare il peso con una cifra decimale.
3. Depositare il tessuto nella provetta per microcentrifuga preraffreddata con 3-4 fori nel coperchio e metterlo in un piccolo becher con 2-3 pellet di ghiaccio secco.
4. Seguire le istruzioni per l'uso del produttore del liofilizzatore.
5. Assicurarsi che tutte le valvole del liofilizzatore siano chiuse e accendere il liofilizzatore.
6. Utilizzare il pannello di controllo per verificare che il set point di vuoto sia programmato per condizioni di liofilizzazione ottimali per i tessuti umani, 0,12 millibar (mBar) (Figura 2).
7. Premere manualmente sul liofilizzatore e attendere che la camera si sia raffreddata a −40 ^oC.
8. Una volta che la camera ha raggiunto quella temperatura, rimuovere il coperchio, quindi la camera di vetro e posizionare il becher (con il campione di muscoli) sul tavolino metallico.
9. Riposizionare la camera di vetro e il coperchio. Chiudere la valvola di rilascio del vuoto sul coperchio e attendere che la spia della bilancia del vuoto diventi verde per assicurarsi che l'asciugatrice sia sigillata sottovuoto.
10. Liofilizzare i campioni muscolari per 48 ore. Una volta completata la liofilizzazione, spegnere la pompa del vuoto premendo il pulsante del vuoto e aprire la valvola di rilascio del vuoto sul coperchio.
11. Rimuovere il coperchio della camera e raccogliere il campione liofilizzato. Pesare il tessuto e registrare il peso con una cifra decimale.
12. Calcolare la percentuale di perdita di peso; ~75% di diminuzione del peso indica che il tessuto è liofilizzato con successo (in questo lavoro, media ± DS, 76 ± 9%, n = 11 campioni muscolari).
13. Premere AUTO per spegnere la pompa del vuoto e il congelatore. Lasciare che l'unità raggiunga la temperatura ambiente.
14. Pulire le serpentine di raffreddamento secondo le istruzioni del produttore e scaricare il liquido accumulato dal collettore.
    NOTA: La raccolta delle fibre può iniziare immediatamente. Quando il tessuto non viene utilizzato per l'isolamento delle fibre, conservare il campione liofilizzato a -80 °C in un contenitore sigillato con perle essiccanti.  ATTENZIONE: Il ghiaccio secco è pericoloso (Classe 9); fare riferimento alla scheda di sicurezza per una manipolazione sicura consigliata.

2. Raccolta delle fibre

1. Preparazione della raccolta delle fibre
   1. Etichettare un minimo di 50 provette per microfuge (fibre da 1 a 50) e pipettare 10 μL di tampone denaturante a ciascuna provetta.
   2. Preparare l'area di raccolta con due paia di pinze per dissezione di tessuti fini, un tessuto privo di lanugine, una lampada da banco, uno stereomicroscopio (con il tavolino nero sollevato), un vortice e una centrifuga da banco.
   3. Posizionare il campione di muscolo liofilizzato sul coperchio di una piastra di Petri. Posizionare il coperchio sul tavolino del microscopio da dissezione.
   4. Guarda il video della dissezione a fibra singola. Mettere in pratica il protocollo completo, dalla raccolta della fibra all'identificazione del tipo di fibra singola, almeno due volte prima di iniziare uno studio.
   5. Prima della raccolta delle fibre, calcolare il volume totale richiesto per un campione di tipo di fibra da ciascuna biopsia come segue. Ad esempio, se il volume iniziale di 1 fibra = 10 μL e il volume rimanente dopo MyDoBID è (1 fibra × 10 μL) - 1 μL utilizzato per il dot blotting = 9 μL (volume del campione), calcolare il volume totale del campione richiesto moltiplicando il volume del campione (μL) per il numero totale di western blot che verranno eseguiti e raddoppiare questa quantità per tenere conto della ridondanza: (9 μL × 4 western blot) × 2 = 72 μL. Calcolare il numero di fibre necessarie per campione tipizzato dividendo il volume finale del campione richiesto (μL) per il volume del campione per campione specifico del tipo di fibra (ad esempio, 72 μL ÷ 9 μL = 8 fibre per campione specifico del tipo di fibra). Per raggiungere questo obiettivo, raccogli un totale di 50 fibre.
      NOTA: Il volume del campione richiesto è la concentrazione proteica minima richiesta per eseguire sia MyDoBID che il western blotting se la quantità di proteine caricate è equivalente a una fibra di ~3 mm (~12 μg di peso umido) per ciascun campione (vedere il file supplementare 1 per i dettagli). Tuttavia, questo volume non tiene conto del fatto che siano necessari gel ripetuti per una determinata proteina.  ATTENZIONE: Le pinze sono affilate; maneggiarli con cura per evitare il rischio di puntura della pelle.
2. Isolamento a fibra singola
   1. Su un piccolo foglio di carta di 5 cm x 1 cm, usa un righello per tracciare una linea di 1 cm. Segna ogni 1 mm su quella linea.
   2. Inseriscilo sotto il coperchio della capsula di Petri come guida per stimare la lunghezza delle fibre raccolte.
   3. Posizionare il campione di muscolo liofilizzato sotto lo stereomicroscopio a basso ingrandimento (x 7,5). Usa un paio di pinze per la dissezione dei tessuti fini per tenere in posizione il muscolo liofilizzato e con l'altro inizia a separare piccoli fasci di fibre (come si vede nel video).
   4. Isolare un fascio di fibre e continuare a separare fino a quando i singoli segmenti di fibra non sono isolati dal fascio.
   5. Raccogli un minimo di 50 fibre di almeno ~ 1 mm di lunghezza.
   6. Sposta la fibra in uno spazio vuoto sulla capsula di Petri. Ispezionare i segmenti a fibra singola con un ingrandimento maggiore (x 50). Assicurati che sia una singola fibra separando ulteriormente la fibra all'estremità. Se la fibra si rompe invece di separarsi, si tratta di una singola fibra.
3. Denaturazione delle fibre
   1. Usando una pinza, raccogliere delicatamente la fibra e posizionarla direttamente nel tampone denaturante aliquotato (non lasciare che il forcipe incontri il tampone).
   2. Controllare le pinze sotto il microscopio per assicurarsi che la fibra sia stata rimossa con successo. Chiudere il tubo e picchiettare saldamente il fondo del tubo sul banco tre volte per assicurarsi che la fibra si sposti nel tampone.
   3. Pulisci la pinza con un panno privo di lanugine prima di passare alla fibra successiva. Ripeti questo processo fino a quando tutte le fibre non sono state raccolte.
   4. Vorticare i campioni di fibre e centrifugare brevemente per 5 secondi a 2.500 × g per aspirare il campione sul fondo della provetta.
      NOTA: La durata della centrifugazione (5 s) è temporizzata dall'inizio (0 × g) fino a quando la velocità raggiunge ~2.500 × g.
   5. Lasciare i campioni a temperatura ambiente per 1 ora. Conservare a -80 °C per un uso futuro. Congelare e scongelare i campioni prima dell'uso.

3. Tamponamento a punti

1. Preparazione e attivazione della membrana
   1. Misurare, etichettare e tagliare a misura una membrana in difluoruro di polivinilidene (PVDF) (dimensione dei pori di 0,2 μm) per adattarsi a 50 campioni (~10,5 cm x 5,5 cm).
   2. Segna il bordo sinistro numericamente dall'alto verso il basso (da 1 a 10) e il bordo superiore in ordine alfabetico da sinistra a destra (da A a E) distanziati di 1 cm l'uno dall'altro.
   3. Preparare quattro fogli di carta da filtro delle dimensioni di 12,5 cm x 7,5 cm.
   4. Impila due fogli insieme per formare una pila. Preimmergere la risma di carta da filtro in 1x tampone di trasferimento.
   5. Mettere la membrana in un contenitore. Versare etanolo al 95% sulla membrana, con un volume sufficiente per immergere completamente la membrana (10-15 ml). Agitare sul bilanciere per 1 min.
   6. Raccogliere l'etanolo, immergere la membrana in 1x tampone di trasferimento (~15 mL) e scuotere per altri 2 minuti.
      NOTA: Sia l'etanolo che il tampone di trasferimento possono essere riutilizzati per futuri esperimenti di dot blotting fino a quando non si forma la sedimentazione (cambiare dopo sei utilizzi).
   7. Appoggiare la pila di carta da filtro imbevuta di tampone di trasferimento su una superficie mobile piana come un coperchio grande e appiattirla con il rullo. Posizionare la membrana in PVDF sulla pila utilizzando un distaccante di gel o una pinzetta.
   8. Posizionare un singolo foglio di carta da filtro asciutta sopra la membrana e spostare il rullo sulla carta da filtro per assorbire il tampone in eccesso sulla superficie della membrana. Rimuovere la carta da filtro superiore senza strofinare la membrana.
      ATTENZIONE: Il metanolo (Classe 3, sottorischio 6.1) e l'etanolo (Classe 3) sono pericolosi. Fare riferimento alla scheda di sicurezza dei materiali (MSDS) per raccomandazioni sulla manipolazione sicura.
2. Assorbimento del campione nella membrana
   1. Scongelare i campioni di fibre, eseguire una breve centrifuga (5 s) a temperatura ambiente come al punto 2.3.4 e mescolare accuratamente il campione.
   2. Senza toccare la membrana con il puntale della pipetta, depositare lentamente una goccia di ~1 μL di ciascun campione sulla membrana nell'area designata. Le dimensioni dell'area designata per campione di fibra sono ~1 cm x 1 cm. Cerca di individuare il campione al centro di quest'area.
   3. Lasciare che le goccioline del campione penetrino attraverso la membrana per almeno 15 minuti. Assicurarsi che non rimanga alcun tampone campione e che sia completamente assorbito.
   4. Usando una pinzetta di plastica, sollevare con cautela la membrana dall'annuncioamp pila di carta da filtro, posizionarla su un singolo foglio asciutto di carta da filtro e disidratare la membrana per almeno 5 minuti.
   5. Una volta che le macchie del campione diventano completamente bianche, riattivare la membrana.
3. Riattivazione e blocco della membrana
   1. Riattivare la membrana ripetendo i passaggi 3.1.5 e 3.1.6.
   2. Mettere la membrana nel tampone di lavaggio e risciacquare per 5 minuti a dondolo. Gettare il tampone di lavaggio.
   3. Incubare la membrana nel tampone bloccante per 30 minuti mentre si dondola.
   4. Risciacquare la membrana 3 volte con tampone di lavaggio fino a quando il tampone non è più torbido.
   5. Lasciare la membrana nel lavaggio finale sul bilanciere.

4. Immunoetichettatura

1. Rilevamento di MHCIIa
   1. Diluire l'anticorpo primario MHCIIa a 1 su 200 in 10 mL di tampone di albumina sierica bovina (BSA).
   2. Eliminare il tampone di lavaggio dalla membrana e quindi versare l'anticorpo MHCIIa diluito sulla membrana.
   3. Posizionare il contenitore (con la membrana in MHCIIa) sul bilanciere a temperatura ambiente per 2 h o a 4 °C per tutta la notte.
   4. Raccogliere l'anticorpo MHCIIa e conservarlo a 4 °C. Lavare la membrana con tampone bloccante per 2 minuti sul bilanciere.
      NOTA: Tutti gli anticorpi primari possono essere riutilizzati fino a cinque volte finché il tampone rimane limpido.
   5. Risciacquare altre due volte; 5 minuti ogni volta; Tre lavaggi in totale.
   6. Diluire l'anticorpo secondario dell'immunoglobulina G di rafano perossidasi (IgG-HRP) di topo a 1 su 20.000 in 10 mL di tampone bloccante e aggiungerlo alla membrana.
   7. Scartare il tampone di lavaggio e incubare la membrana in IgG-HRP secondarie di topo con oscillazione per 1 h.
   8. Scartare il secondario e lavare la membrana in tampone di lavaggio (2, 5, 5 min).
   9. Lasciare la membrana in ammollo nel lavaggio finale fino al momento dell'imaging.
   10. Accendere la gel imager, attendere 15 minuti affinché raggiunga la temperatura di esercizio richiesta, quindi aprire il software di imaging (vedere Tabella dei materiali).
   11. Nella finestra del software, fare clic su Nuovo protocollo a canale singolo (Figura 3A). Per un'immagine a luce bianca della membrana, in Applicazioni | Macchie | fare clic su Colorimetrico (Figura 3B).
   12. Fare clic sull'area del gel; Ogni opzione è programmata per dimensioni specifiche per adattarsi alle dimensioni di vari tipi di gel. Selezionare l'opzione appropriata per adattarsi al meglio alle dimensioni della membrana (Figura 3C).
   13. Preparare l'ECL combinando i reagenti luminol e perossidasi in un rapporto 1:1. Produrre un volume sufficiente di miscela ECL per coprire l'intera membrana, in genere è richiesto un volume totale di 800-1.000 μL.
   14. Posizionare la membrana su un ampio vassoio di plastica trasparente e disperdere la miscela ECL sulla membrana.
   15. Posizionare la membrana sulla piastra ai fosfori.
   16. Fare clic su Posiziona gel (pulsante giallo) per una vista della telecamera dal vivo. Fare clic su Tieni premuto e trascinare il pulsante di zoom per ingrandire l'area di imaging della membrana. A questo punto, raddrizzare la posizione della membrana se necessario.
   17. Fare clic su Run Protocol (pulsante verde) e attendere che venga prodotta un'immagine colorimetrica della membrana. Salvare questa immagine per facilitare l'abbinamento dei punti al campione di fibre corrispondente.
   18. Senza spostare la membrana, modificare l'applicazione sul software facendo clic sull'opzione per un binning 2 x 2 (Chemi High Resolution) (Figura 3D).
   19. In Esposizione immagine e software, ottimizzare il tempo di esposizione, fare clic su Bande deboli (Figura 3E) | Modalità di accumulo del segnale.
   20. In Imposta, digitare 1 s per la prima immagine, 30 s per l'ultima immagine e 30 immagini totali (Figura 3F).
   21. Fare clic su Esegui protocollo.
   22. Salvare un'immagine nelle seguenti fasi: prima della saturazione del segnale (tutti i punti visibili sono neri), della saturazione iniziale del segnale (alcuni punti iniziano a saturarsi) e dei punti sovrasaturi (tutti i punti con segnale forte rilevato sono saturi).
   23. Salvare tutte le immagini richieste prima di terminare l'accumulo del segnale. Estrarre la membrana dall'imager.
   24. Utilizzando il distaccante di gel, riposizionare la membrana nel contenitore con il tampone di lavaggio.
2. Rilevamento di MHCI
   1. Versare il tampone di lavaggio e trattare la membrana con tampone di strippaggio per 30 minuti a 37 °C (assicurarsi che la membrana sia completamente immersa).
   2. Raccogliere il tampone di strippaggio e sciacquare la membrana nel tampone di lavaggio per 5 minuti con oscillazione.
      NOTA: Il tampone di strippaggio può essere riutilizzato 10 volte prima di essere eliminato.
   3. Versare il tampone di lavaggio e questa volta applicare l'anticorpo primario MHCI diluito a una concentrazione iniziale di 1 su 200 (intervallo: da 1 su 200 a 1 su 500). Scuotere la membrana a temperatura ambiente per 1 h.
   4. Dopo l'incubazione nell'anticorpo primario MHCI, raccogliere nuovamente l'anticorpo e lavare la membrana come nei passaggi 4.1.4 e 4.1.5.
   5. Diluire l'anticorpo secondario IgM HRP di topo nel tampone bloccante a 1 su 20.000. Versare il tampone bloccante dalla membrana e incubare nelle IgM secondarie di topo come al punto 4.1.7.
   6. Il lavaggio e l'acquisizione dell'immagine hanno rilevato MHCI come nei passaggi da 4.1.8 a 4.1.24.
      ATTENZIONE: Il tampone di stripping contiene fosfina organica al 3-5% (classe 8). Fare riferimento alla scheda di sicurezza per le raccomandazioni sulla manipolazione sicura.
3. Rilevamento di potenziali MHCIIx mediante actina
   1. Spelare nuovamente la membrana (punti 4.2.1 e 4.2.2).
   2. Ripetere il paragrafo 4.1, questa volta applicando l'anticorpo primario di actina diluito a 1 su 500 nel tampone BSA e poi l'anticorpo secondario HRP di coniglio diluito a 1 su 20.000 nel tampone bloccante.

5. Identificazione del tipo di fibra

1. Analisi del segnale MHCI, MHCIIa e actina
   1. Acquisire familiarità con il pannello dell'intensità del segnale (Figura 4A). Prendere nota dei passaggi da 5.1.2 a 5.1.4.
   2. Un'intensità del segnale saturo indica qualitativamente che il rilevamento della proteina è forte.
   3. Un moderato indica che la proteina bersaglio è presente a un livello medio.
   4. Un debole segnale indica che è presente poca proteina bersaglio.
   5. Utilizzare il pannello dell'intensità del segnale per classificare le fibre con intensità del segnale "satura", "moderata" o "debole" (Figura 4A).
   6. Eseguire l'identificazione del tipo di fibra confrontando prima i risultati di MHCIIa e MHCI (Figura 4B, macchie a sinistra e al centro).
   7. Registra fibre con intensità del segnale satura o moderata di una sola isoforma MHC.
   8. Se il segnale dell'isoforma MHC è "debole", lasciare la fibra non contrassegnata (vedere la Figura 4B).
   9. Infine, se si osserva actina (intensità del segnale moderata o satura) nelle fibre senza MHCI o IIa rilevati, registrarla come potenziale fibra di tipo IIx (Figura 4B, macchia a destra).
   10. Registrare le fibre con un debole segnale isoforme MHC ma l'actina rilevata (intensità moderata o satura) non è stata identificata.
   11. Scartare i campioni con rilevamento debole o assente (nessuna fibra raccolta) per tutte e tre le proteine bersaglio (Figura 4C).
   12. Registra qualsiasi fibra in cui vengono rilevati sia i segnali MHCI che MHCII con un segnale "saturo" o moderato. Questi campioni non sono destinati all'uso nella preparazione specifica del tipo di fibra.
2. Preparazione di campioni specifici per tipo di fibra
   1. Preparare un campione separato di tipo I e di tipo II per ogni biopsia. Per un campione di tipo II, combinare il numero minimo richiesto di fibre (calcolato al punto 2.1.5) in cui viene rilevata MHCIIa a livelli saturi o moderati.
   2. In una provetta separata etichettata come tipo I, ripetere questo processo per le fibre in cui viene rilevato MHCI (Figura 4D).
   3. Utilizzare fibre con intensità di segnale moderata se non ci sono abbastanza fibre con segnali saturi.
   4. Combina tutte le potenziali fibre IIx.
   5. Utilizzare immediatamente campioni specifici per il tipo di fibra per il western blotting o conservarli a -80 °C per un uso futuro.

6. Conferma del tipo di fibra Western blot

1. Utilizzare 10 μL di ciascun campione specifico per il tipo di fibra (il volume minimo di campione richiesto, vedere il passaggio 2.1.5).
2. Separare i campioni utilizzando il gel prefabbricato specificato tramite SDS-PAGE secondo il protocollo del produttore.
3. Utilizzare un gel imager per rilevare la proteina nel gel secondo il protocollo del produttore.
4. Mettere il gel nel tampone di trasferimento 1x freddo per 10 minuti.
5. Trasferire a umido le proteine su una membrana di nitrocellulosa da 0,45 μm (9,5 cm x 13,5 cm) secondo il protocollo del produttore.
6. Dopo il trasferimento, sciacquare brevemente la membrana con H₂O ultrapuro in un contenitore. Versare l'acqua ultrapura.
7. Aggiungere 10 mL di soluzione di potenziamento del segnale anticorpale alla membrana e scuotere a temperatura ambiente per 10 minuti.
8. Raccogliere la soluzione di potenziamento del segnale anticorpale e lavare 5 volte (5 s per lavaggio) con H₂O ultrapuro.
   NOTA: La soluzione di potenziamento del segnale anticorpale può essere utilizzata 5 volte prima di essere eliminata.
9. Versare l'ultimo lavaggio, aggiungere la soluzione bloccante e far oscillare a temperatura ambiente per 1 ora.
10. Utilizzare una lama di bisturi pulita o delle forbici per tagliare orizzontalmente la membrana a un peso molecolare che assicuri che le proteine di 180 kDa e oltre si trovino sulla sezione superiore della membrana.
11. Utilizzare questa sezione superiore per un'ulteriore conferma del tipo di fibra.
12. Utilizzare la porzione inferiore a 180 kDa per rilevare diverse proteine bersaglio.
13. Sulla parte superiore della membrana, seguire il paragrafo 4.1 con l'anticorpo MHCIIx primario e l'anticorpo secondario HRP Immunoglobulina M (IgM) di topo.
14. Rimuovere la membrana (come descritto nei paragrafi 4.2.1 e 4.2.2) prima di ripetere il processo con l'anticorpo MHCIIa IgG primario e l'anticorpo secondario IgG HRP di topo.
15. Rimuovere ancora una volta e infine applicare l'anticorpo MHCI IgM primario e l'anticorpo secondario IgM HRP di topo.
    NOTA: Questo passaggio è qualitativo e quindi qualsiasi perdita di proteine dovuta allo stripping della membrana non è un problema.
16. Confrontare il segnale rilevato tra le diverse isoforme MHC (come mostrato nella Figura 5B). Quando l'intensità del segnale viene rilevata a livelli da moderati a saturi nel campione previsto (MHCI - tipo I, MHCIIa - tipo II e MHCIIx - tipo IIx) i campioni specifici del tipo di fibra saranno registrati come affidabili per l'uso in studi futuri.
17. Registrare il campione come inaffidabile quando più di un'isoforma MHC viene rilevata allo stesso modo in un campione.
    ATTENZIONE: La soluzione di potenziamento degli anticorpi contiene idrossido di sodio al 50%. Fare riferimento alla scheda di sicurezza per le raccomandazioni sulla manipolazione sicura.

Risultati

Identificazione delle singole fibre muscolari MHCI, MHCIIa e MHCIIx mediante dot blotting
Una caratteristica di MyDoBID è la categorizzazione della diversa intensità del segnale MHC e Actin in una data fibra (Figura 4A). Il tipo di fibra è stato identificato dalla presenza o dall'assenza delle isoforme MHCI e IIa (Figura 4B). Sei fibre non hanno mostrato alcun rilevamento di MHC o actina, indicando che non c'era alcuna fibra raccolta. I ri...

Discussione

Raccolta fibre
Sulla base di diversi anni di esperienza, la maggior parte dei ricercatori è in grado di padroneggiare questa tecnica; Tuttavia, la pratica porta a una raccolta più rapida ed efficiente delle fibre per le analisi a valle. Per essere in grado di isolare 30 segmenti di fibra singola di una qualità per il pooling, si consiglia di raccogliere 50 segmenti di fibra per campione. Si consiglia di studiare attentamente il video di raccolta delle fibre e dopo aver eseguito due sessioni di prat...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x Denaturing buffer	Make according to recipe	Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributing companies	1x denaturing buffer is made by diluting 3x denaturing buffer 1 in 3 v/v with 1X Tris-HCl (pH 6.8). Store at -20 °C.
3x Denaturing buffer	Make according to recipe	Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributors	3x denaturing buffer contains: 0.125M Tris-HCI, 10% glycerol, 4% SDS, 4 M urea, 10% 2-mercaptoethanol, and 0.001% bromophenol blue, pH 6.8.  Store at -20 °C.
95% Ethanol	N/A	100% ethanol can be sourced from any company	Diluted to 95% with ultra-pure H2O.
Actin rabbit polyclonal antibody	Sigma-Aldrich	A2066	Dilute 1 in 1,000 with BSA buffer.
Analytical scales	Mettler Toledo	Model number: MSZ042101
Antibody enhancer	Thermo Fischer Scientific	32110	Product name is Miser Antibody Extender Solution NC.
Beaker (100 mL)	N/A	N/A
Benchtop centrifuge	Eppendorf	5452	Model name: Mini Spin.
Blocking buffer: 5% Skim milk in Wash buffer.	Diploma	Store bought
BSA buffer: 1 % BSA/PBST, 0.02 % NaN3	BSA: Sigma-Aldrich              PBS: Bio-Rad Laboratories. NaN3 : Sigma-Aldrich	BSA: A6003-25G                         10x PBS: 1610780                       NaN3: S2002	Bovine serum albumin (BSA), Phosphate-buffered saline (PBS), and Sodium azide (NaN3). Store at 4 °C.
Cassette opening lever	Bio-Rad Laboratories	4560000	Used to open the precast gel cassettes.
Chemidoc MP Imager	Bio-Rad Laboratories	Model number: Universal hood III	Any imaging system with Stain-Free gel imaging capabilities.
Criterion blotter	Bio-Rad Laboratories	1704070	Includes ice pack, transfer tray, roller, 2 cassette holders, filter paper, foam pads and lid with cables.
Criterion Cell (Bio-Rad)	Bio-Rad Laboratories	1656001
ECL (enhanced chemiluminescence)	Bio-Rad Laboratories	1705062	Product name: Clarity Max Western ECL Substrate.
Electrophoresis buffer 1x Tris Glycine SDS (TGS)	Bio-Rad Laboratories	1610772	Dilute 10x TGS 1 in 10 with ultra-pure H2O.
Filter paper, 0.34 mm thick	Whatmann	3030917	Bulk size 3 MM, pack 100 sheets, 315 x 335 mm.
Fine tissue dissecting forceps	Dumont	F6521-1EA	Jeweller’s forceps no. 5.
Flat plastic tray/lid	N/A	N/A	Large enough to place the membrane on. Ensure the surface is completely flat.
Freeze-drying System	Labconco	7750030	Freezone 4.5 L with glass chamber sample stage.
Freezer -80 oC	N/A	N/A	Any freezer with a constant temperature of -80 °C is suitable.
Gel releasers	1653320	Bio-Rad	Slide under the membrane to gather or move the membrane.
Grey lead pencil	N/A	N/A
Image lab software	Bio-Rad Laboratories	N/A	Figures refers to software version 5.2.1 but other versions can used.
Incubator	Bio-Rad Laboratories	1660521	Any incubator that can be set to 37 °C would suffice.
Lamp	N/A	N/A
Magnetic stirrer with flea	N/A	N/A
Membrane roller	Bio-Rad Laboratories	1651279	Can be purchased in the Transfer bundle pack. However, if this product is not available, any smooth surface cylindrical tube long enough to roll over the membrane would suffice.
Microcentrifuge tubes  (0.6 mL)	N/A	N/A
Mouse IgG HRP secondary	Thermo Fisher Scientific	31430	Goat anti-Mouse IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilute at 1 in 20,000 in blocking buffer.
Mouse IgM HRP secondary	Abcam	ab97230	Goat Anti-Mouse IgM mu chain. Use at the same dilution as mouse IgG.
Myosin Heavy Chain I (MHCI) primary antibody	DSHB	A4.840	Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.
Myosin Heavy Chain IIa (MHCIIa) primary antibody	DSHB	A4.74	Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.
Myosin Heavy Chain IIx (MHCIIx) primary antibody	DSHB	6H1	Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.
Nitrocellulose Membrane 0.45 µm	Bio-Rad Laboratories	1620115	For Western blotting.
Petri dish lid	N/A	N/A
Plastic tweezers	N/A	N/A
Power Pack	Bio-Rad Laboratories	164-5050	Product name: Basic power supply.
Protein ladder	Thermo Fisher Scientific	26616	PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa.
PVDF Membrane 0.2 µm	Bio-Rad Laboratories	1620177
Rabbit HRP secondary	Thermo Fisher Scientific	31460	Goat anti-Rabbit IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilution same as mouse secondary antibodies.
Rocker	N/A	N/A
Ruler	N/A	N/A
Scissors	N/A	N/A
Stereomicroscope	Motic	SMZ-168
Stripping buffer	Thermo Fisher Scientific	21059	Product name: Restore Western Blot Stripping Buffer.
Tissue (lint free)	Kimberly-Clark professional	34120	Product name: Kimwipe.
Transfer buffer (1x Tris Glycine buffer (TG), 20% Methanol)	TG: Bio-Rad Laboratories   Methanol: Merck	TG buffer: 1610771           Methanol: 1.06018	dilute 10x TG buffer with ultra-pure H2O to 1x. Add 100% Methanol to a final concentration of 20% Methanol. Store at 4 °C.
Transfer tray	Bio-Rad Laboratories	1704089
UV-activation precast gel	Bio-Rad Laboratories	5678085	Gel type: 4–15% Criterion TGX Stain-Free Protein Gel, 26 well, 15 µL.
Vortex	N/A	N/A
Wash buffer (1x TBST)	10x TBS: Astral Scientific  Tween 20: Sigma	BIOA0027-4L	1x TBST recipe: 10x Tris-buffered saline (TBS) is diluted down to 1x with ultra-pure H2O, Tween 20 is added to a final concentration of 0.1%. Store buffer at 4 °C.
Wash containers	Sistema	Store bought	Any tupperware container, that suits the approximate dimensions of the membrane would suffice.