Идентификация типа волокна скелетной мускулатуры человека

Резюме

Этот протокол демонстрирует выделение одного волокна из лиофилизированных скелетных мышц человека и классификацию типов волокон в соответствии с изоформой тяжелой цепи миозина (MHC) с использованием метода точечного блоттинга. Идентифицированные образцы клетчатки MHC I и II могут быть затем дополнительно проанализированы на предмет специфичных для типа волокна различий в экспрессии белка с помощью вестерн-блоттинга.

Аннотация

Описанный здесь метод может быть использован для идентификации специфических изоформ тяжелой цепи миозина (MHC) в сегментах отдельных мышечных волокон с помощью точечного блоттинга, далее именуемого обнаружением тяжелой цепи Myosin методом лоттинга Dot Bдля идентификациитипа мышечных волокон (MyDoBID). Этот протокол описывает процесс сублимационной сушки скелетных мышц человека и выделения сегментов отдельных мышечных волокон. С помощью MyDoBID волокна I и II типов классифицируются с помощью MHCI- и IIa-специфических антител соответственно. Затем классифицированные волокна объединяются в специфичные для каждого типа образцы волокон для каждой биопсии.

Общий белок в каждом образце определяется с помощью додецилсульфатного полиакриламидного гель-электрофореза (SDS-PAGE) и технологии УФ-активированного геля. Тип образцов волокна валидируется с помощью вестерн-блоттинга. Также описана важность нормализации белковой нагрузки для улучшения обнаружения целевых белков при множественных вестерн-блоттингах. Преимущества консолидации классифицированных волокон в образцы для конкретных типов волокон по сравнению с одноволоконными вестерн-блотами включают универсальность образцов, повышенную пропускную способность образцов, более короткие временные затраты и меры по экономии средств, сохраняя при этом ценную информацию о типе волокна, которая часто упускается из виду при использовании гомогенизированных образцов мышц. Целью протокола является достижение точной и эффективной идентификации волокон I и II типа, выделенных из лиофилизированных образцов скелетных мышц человека.

Эти отдельные волокна впоследствии объединяются для создания образцов волокон типа I и типа II. Кроме того, протокол расширен и включает в себя идентификацию волокон типа IIx с использованием актина в качестве маркера для волокон, которые были отрицательными для MHCI и MHCIIa, которые подтверждены как волокна IIx с помощью вестерн-блоттинга. Каждый образец клетчатки, специфичный для конкретного типа, затем используется для количественной оценки экспрессии различных белков-мишеней с помощью методов вестерн-блоттинга.

Введение

Скелетные мышцы представляют собой гетерогенную ткань с различными клеточными метаболическими и сократительными свойствами, которые зависят от того, является ли клетка (волокно) медленно сокращающейся (тип I) или быстро сокращающейся (тип II). Тип волокна может быть идентифицирован путем изучения изоформ тяжелой цепи миозина (MHC), которые отличаются друг от друга по нескольким параметрам, включая время сокращения, скорость укорочения^{и сопротивление} усталости. Основные изоформы MHC включают тип I, тип IIa, тип IIb и тип IIx, и их метаболические профили являются либо окислительными (типы I и IIa), либо гликолитическими (IIx, IIb)¹. Пропорция этих типов волокон варьируется в зависимости от типа мышц и между видами. Тип IIb широко встречается в мышцах грызунов. Мышцы человека не содержат волокон типа IIb и состоят преимущественно из изоформ MHC волокон I и IIa, с небольшой долей волокон IIx². Профили экспрессии белков варьируются в зависимости от типа клетчатки и могут изменяться с возрастом³, физической нагрузкой ^4,5 и заболеванием 6.

Измерение клеточных реакций в различных типах скелетных мышечных волокон часто упускается из виду или не представляется возможным из-за исследования мышечных гомогенатов (смесь всех типов волокон). Одноволоконный вестерн-блот позволяет исследовать несколько белков в отдельных мышечных волокнах⁷. Эта методология ранее использовалась для получения новых и информативных одноволоконных характеристик, которые невозможно было получить с помощью гомогенатных препаратов. Тем не менее, существуют некоторые ограничения оригинальной методики вестерн-блоттинга с одним волокном, в том числе трудоемкий характер, невозможность создания репликаций образцов и использование дорогостоящих, чувствительных реагентов усиленной хемилюминесценции (ECL). Если используется свежая ткань, этот метод дополнительно ограничен из-за временных ограничений, связанных с необходимостью изолировать отдельные волокна в течение ограниченного периода времени (например, 1-2 часа). К счастью, это ограничение смягчается путем выделения одноволокнистых сегментов из лиофилизированной ткани⁸. Однако сбор клетчатки из лиофилизированных образцов ограничен размером и качеством биопсированной ткани.

Идентификация типа волокна с помощью метода точечного блоттинга⁹ была значительно усовершенствована и расширена в этом комплексном протоколе. Ранее было продемонстрировано, что всего ~2-10 мг мышечной ткани с влажной массой достаточно для сублимационной сушки и анализа изоформы белка MHC с одним волокном⁹. Christensen et ^al.9 использовали 30% сегмента волокна ~1 мм для обнаружения изоформы MHC, присутствующей с помощью точечного блоттинга, что было подтверждено вестерн-блоттингом. Эта работа показала, что при замене вестерн-блоттинга на точечный блоттинг общие затраты были снижены в ~40 раз (для 50 сегментов волокна). Затем волокна были «объединены» в образцы типа I и типа II, что позволило провести экспериментальную репликацию⁹. Тем не менее, ограничением было то, что были получены только два образца волокон, специфичных для конкретного типа: тип I (MHCI положительный) и тип II (MHCII положительные волокна), при этом образцы типа II содержали смесь MHCIIa и MHCIIx ^6,10. Примечательно, что текущий протокол демонстрирует, как могут быть идентифицированы чистые волокна типа IIx, и предоставляет очень подробный рабочий процесс (см. рис. 1), включая стратегии устранения распространенных проблем протокола.

протокол

Образцы мышц человека были получены из vastus lateralis от n = 3 (2 мужчины, 1 женщина) в возрасте 70-74 лет в стерильных условиях с использованием местной анестезии (ксилокаин) и иглы Бергстрома, модифицированной для ручного отсасывания^11,12. Образцы представляли собой подмножество предыдущего исследования, одобренного Комитетом по этике исследований на людях Университета Виктории (HRETH11/221) и проведенного в соответствии с Хельсинкской декларацией¹³. Участники предоставили письменное информированное согласие на участие в этом исследовании. Полная информация обо всех материалах, необходимых для этого протокола, приведена в Таблице материалов. Кроме того, в таблице 1 приведен список стратегий устранения неполадок, направленных на решение распространенных проблем протокола.

1. Сублимационная сушка

1. Храня биопсированные образцы мышц замороженными на сухом льду, взвесьте и упакуйте пустую замороженную пробирку на весах.
2. Быстро взвесьте минимум 10 мг влажной замороженной ткани. Запишите вес с точностью до одного знака после запятой.
3. Поместите салфетку в предварительно охлажденную пробирку микроцентрифуги, в крышке которой пробиты 3-4 отверстия, и поместите ее в небольшой стакан с 2-3 гранулами сухого льда.
4. Следуйте инструкциям по эксплуатации производителя сублимационной сушилки.
5. Убедитесь, что все клапаны на сублимационной сушилке закрыты, и включите сублимационную сушилку.
6. С помощью панели управления убедитесь, что заданное значение вакуума запрограммировано на оптимальные условия сублимационной сушки тканей человека, 0,12 миллибар (мбар) (рис. 2).
7. Нажмите ручную на сублимационную сушилку и подождите, пока камера остынет до −40 ^oC.
8. Как только камера достигнет этой температуры, снимите крышку, затем стеклянную камеру и поместите стакан (с образцом мышцы) на металлический столик.
9. Установите на место стеклянную камеру и крышку. Закройте вакуумный выпускной клапан на крышке и подождите, пока индикатор вакуумных весов не загорится зеленым, чтобы убедиться, что сушилка герметична.
10. Образцы мышц сублимировать в течение 48 ч. После завершения сублимационной сушки выключите вакуумный насос, нажав кнопку вакуума, и откройте вакуумный клапан на крышке.
11. Снимите крышку камеры и соберите сублимированный образец. Взвесьте ткань и запишите вес с точностью до одного знака после запятой.
12. Рассчитать процент потери веса; Снижение веса на ~75% указывает на то, что ткань успешно сублимирована (в данной работе среднее ± SD, 76 ± 9%, n = 11 мышечных образцов).
13. Нажмите AUTO, чтобы выключить вакуумный насос и морозильную камеру. Дайте устройству нагреться до температуры окружающей среды.
14. Очистите охлаждающие змеевики в соответствии с инструкциями производителя и слейте скопившуюся жидкость из коллектора.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сбор волокна может начаться немедленно. Если ткань не используется для выделения волокон, храните лиофилизированный образец при температуре -80 °C в герметичном контейнере с шариками эксикатора.  ВНИМАНИЕ: Сухой лед опасен (класс 9); обратитесь к MSDS для получения рекомендаций по безопасному обращению.

2. Сбор волокна

1. Подготовка к сбору клетчатки
   1. Промаркируйте минимум 50 пробирок для микрофуги (волокна от 1 до 50) и пипетку на 10 мкл денатурирующего буфера на каждую пробирку.
   2. Подготовьте зону сбора с помощью двух пар щипцов для рассечения тонких тканей, безворсовой ткани, настольной лампы, стереомикроскопа (с черной сценой вверх), вихря и настольной центрифуги.
   3. Поместите сублимированный образец мышц на крышку чашки Петри. Поместите крышку на предметный столик препарирующего микроскопа.
   4. Посмотрите видео одноволоконной диссекции. Отработайте полный протокол от сбора волокон до идентификации типа одного волокна не менее двух раз, прежде чем начинать исследование.
   5. Перед сбором волокна рассчитайте общий объем, необходимый для образца типа волокна из каждой биопсии , следующим образом. Например, если начальный объем 1 волокна = 10 мкл, а объем, оставшийся после MyDoBID, равен (1 волокно × 10 мкл) - 1 мкл, используемый для точечного блоттинга = 9 мкл (объем образца), рассчитайте общий необходимый объем образца, умножив объем образца (мкл) на общее количество вестерн-блоттинга, которое будет выполнено, и удвойте это количество, чтобы учесть избыточность: (9 мкл × 4 вестерн-блота) × 2 = 72 мкл. Рассчитайте необходимое количество волокон на типированный образец , разделив окончательный требуемый объем образца (мкл) на объем образца на образец для конкретного типа волокна (например, 72 мкл ÷ 9 мкл = 8 волокон на образец для конкретного типа волокна). Чтобы этого добиться, соберите в общей сложности 50 волокон.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Требуемый объем образца является минимальной концентрацией белка, необходимой для проведения как MyDoBID, так и вестерн-блоттинга, если количество загружаемого белка эквивалентно ~3 мм клетчатки (~12 мкг сырого веса) для каждого образца (см. Дополнительный файл 1 для получения подробной информации). Однако этот объем не учитывает, требуются ли повторные гели для данного белка.  ВНИМАНИЕ: Щипцы острые; Обращайтесь с ними осторожно, чтобы избежать риска прокола кожи.
2. Одноволоконная изоляция
   1. На небольшом листе бумаги 5 см х 1 см с помощью линейки нарисуйте линию в 1 см. Отметьте через каждые 1 мм на этой линии.
   2. Вставьте его под крышку чашки Петри в качестве ориентира для оценки длины собранных волокон.
   3. Поместите лиофилизированный образец мышцы под стереомикроскоп при малом увеличении (x 7,5). Используйте одну пару щипцов для рассечения тонких тканей, чтобы удерживать лиофилизированную мышцу на месте, а другой начните разделять небольшие пучки волокон (как показано на видео).
   4. Изолируйте один пучок волокон и продолжайте раздвигать их до тех пор, пока отдельные сегменты волокон не будут изолированы от пучка.
   5. Соберите не менее 50 волокон длиной не менее ~1 мм.
   6. Переместите волокно в пустое место на чашке Петри. Осматривайте одноволоконные сегменты при большем увеличении (x 50). Убедитесь, что это одно волокно, дополнительно отделив волокно на конце. Если волокно разрывается, а не отделяется, это одно волокно.
3. Денатурация волокон
   1. С помощью щипцов аккуратно соберите волокно и поместите его непосредственно в аликотируемый денатурирующий буфер (не допускайте столкновения щипцов с буфером).
   2. Проверьте щипцы под микроскопом, чтобы убедиться, что волокно было успешно удалено. Закройте пробирку и трижды плотно постучите по нижней части пробирки по столу, чтобы убедиться, что волокно движется в буфер.
   3. Протрите щипцы безворсовой салфеткой, прежде чем переходить к следующему волокну. Повторяйте этот процесс до тех пор, пока не соберутся все волокна.
   4. Встряхните образцы волокон и кратковременно центрифугируйте в течение 5 с при 2 500 × g , чтобы извлечь образец на дно пробирки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность центрифугирования (5 с) измеряется с начала (0 × g) до достижения скорости ~ 2 500 × g.
   5. Оставьте образцы при комнатной температуре на 1 ч. Хранить при температуре -80 °C для дальнейшего использования. Заморозьте, а затем разморозьте образцы перед использованием.

3. Точечное блоттинг

1. Подготовка и активация мембраны
   1. Измерьте, промаркируйте и отрежьте по размеру одну мембрану из поливинилидендифторида (ПВДФ) (размер пор 0,2 мкм) для 50 образцов (~10,5 см x 5,5 см).
   2. Отметьте левую границу цифрами сверху вниз (от 1 до 10), а верхнюю границу в алфавитном порядке слева направо (от A до E) на расстоянии 1 см друг от друга.
   3. Подготовьте четыре листа фильтровальной бумаги размером 12,5 см х 7,5 см.
   4. Сложите два листа вместе, чтобы получилась стопка. Предварительно замочите стопку фильтровальной бумаги в 1-кратном буфере для переноса.
   5. Поместите мембрану в емкость. Залейте мембрану 95% этанолом, достаточным для полного погружения мембраны (10-15 мл). Взбалтывайте на коромысле в течение 1 мин.
   6. Соберите этанол, погрузите мембрану в буфер для переноса 1x (~15 мл) и покачайте еще 2 минуты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как этанол, так и трансферный буфер могут быть повторно использованы для будущих экспериментов по точечному блоттингу до образования седиментации (смена после шести использований).
   7. Положите стопку фильтровальной бумаги, пропитанную буфером, на плоскую подвижную поверхность, например, на большую крышку, и разровняйте валиком. Расположите мембрану PVDF на стеке с помощью гелевого релизера или пинцета.
   8. Положите один лист сухой фильтровальной бумаги поверх мембраны и проведите валиком по фильтровальной бумаге, чтобы впитать излишки буфера на поверхности мембраны. Снимите верхнюю фильтровальную бумагу, не теребя мембрану.
      ВНИМАНИЕ: Метанол (класс 3, подриск 6.1) и этанол (класс 3) являются опасными. Обратитесь к паспорту безопасности материала (MSDS) для получения рекомендаций по безопасному обращению.
2. Абсорбция образца на мембране
   1. Разморозьте образцы волокон, выполните кратковременную центрифугу (5 с) при комнатной температуре, как показано на шаге 2.3.4, и тщательно перемешайте образец.
   2. Не касаясь мембраны наконечником пипетки, медленно нанесите ~1 мкл капли каждого образца на мембрану в отведенном месте. Размеры выделенной площади на образец волокна ~1 см x 1 см. Стремитесь найти образец в центре этой области.
   3. Дайте каплям образца пропитаться через мембрану в течение не менее 15 минут. Убедитесь, что буфера образца не осталось и он полностью абсорбирован.
   4. С помощью пластикового пинцета осторожно снимите мембрану с влажной стопки фильтровальной бумаги, поместите ее на один сухой лист фильтровальной бумаги и обезвоживайте мембрану не менее 5 минут.
   5. Как только пятна образца станут полностью белыми, повторно активируйте мембрану.
3. Реактивация и блокировка мембраны
   1. Повторно активируйте мембрану, повторив шаги 3.1.5 и 3.1.6.
   2. Поместите мембрану в буфер для промывки и промывайте в течение 5 минут при раскачивании. Выбросьте буфер для стирки.
   3. Инкубируйте мембрану в блокирующем буфере в течение 30 мин во время раскачивания.
   4. Промойте мембрану 3 раза буфером для промывки до тех пор, пока буфер не перестанет мутнеть.
   5. Оставьте мембрану в окончательной стирке на коромысле.

4. Иммуномаркировка

1. Обнаружение MHCIIa
   1. Разбавляют первичные антитела MHCIIa в соотношении 1 к 200 в 10 мл буфера бычьего сывороточного альбумина (BSA).
   2. Снимите промывочный буфер с мембраны, а затем вылейте разбавленное антитело MHCIIa на мембрану.
   3. Поместите контейнер (с мембраной в MHCIIa) на коромысло при комнатной температуре на 2 часа или при температуре 4 °C на ночь.
   4. Соберите антитело MHCIIa и храните его при температуре 4 °C. Промойте мембрану с блокирующим буфером в течение 2 мин на коромысле.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все первичные антитела могут быть повторно использованы до пяти раз дольше, пока буфер остается прозрачным.
   5. Промыть еще дважды; 5 минут каждый раз; Всего три стирки.
   6. Разбавьте вторичные антитела к пероксидазе хрена (IgG-HRP) мышиного иммуноглобулина G (IgG-HRP) в соотношении 1 к 20 000 в 10 мл блокирующего буфера и добавьте к мембране.
   7. Промывочный буфер выбросьте и инкубируйте мембрану во вторичной обработке IgG-HRP мыши с раскачиванием в течение 1 ч.
   8. Выбросьте вторичную обмотку и промойте мембрану в буфере для промывки (2, 5, 5 мин).
   9. Оставьте мембрану для окончательной промывки до тех пор, пока она не будет готова к визуализации.
   10. Включите гелевый имидж-сканер, подождите 15 минут, пока тепловизор не достигнет требуемой рабочей температуры, а затем откройте программное обеспечение для обработки изображений (см. Таблицу материалов).
   11. В окне программного обеспечения нажмите кнопку New Single Channel Protocol (рисунок 3A). Для получения изображения мембраны в белом свете в разделе Приложения | Кляксы | выберите Колориметрический (Colorimetric ) (Рисунок 3B).
   12. Нажмите на область геля; Каждая опция запрограммирована на определенные размеры, чтобы соответствовать размеру различных типов гелей. Выберите подходящий вариант, который наилучшим образом соответствует размерам мембраны (рисунок 3C).
   13. Приготовьте ЭХЛ, комбинируя реагенты люминол и пероксидазу в соотношении 1:1. Сделайте достаточный объем смеси ECL, чтобы покрыть всю мембрану, обычно требуется общий объем 800-1000 мкл.
   14. Поместите мембрану на большой прозрачный пластиковый лоток и распределите смесь ECL по мембране.
   15. Поместите мембрану на пластину для визуализации.
   16. Нажмите на Position Gel (желтая кнопка), чтобы увидеть камеру в реальном времени. Нажмите и удерживайте и перетащите кнопку масштабирования, чтобы увеличить область изображения мембраны. На этом этапе при необходимости выпрямите положение мембраны.
   17. Нажмите Run Protocol (зеленая кнопка) и дождитесь получения колориметрического изображения мембраны. Сохраните это изображение, чтобы помочь сопоставить точки с соответствующим образцом волокна.
   18. Не перемещая мембрану, измените приложение в программном обеспечении, выбрав опцию биннинга 2 x 2 (Chemi High Resolution) (рис. 3D).
   19. В разделе «Экспозиция изображения и программное обеспечение» оптимизируйте время экспозиции нажмите «Слабые полосы » (рис. 3E) | Режим накопления сигнала.
   20. В разделе «Настройка» введите 1 с для первого изображения, 30 с для последнего изображения и 30 всего изображений (рис. 3F).
   21. Нажмите кнопку Run Protocol.
   22. Сохраняйте изображение на следующих этапах: до насыщения сигнала (все видимые точки черные), начального насыщения сигнала (некоторые точки начинают насыщаться) и перенасыщенных пятен (все пятна с обнаруженным сильным сигналом насыщены).
   23. Сохраните все необходимые изображения перед окончанием накопления сигнала. Извлеките мембрану из тепловизора.
   24. Используя средство для удаления геля, поместите мембрану обратно в контейнер с буфером для стирки.
2. Обнаружение MHCI
   1. Вылейте буфер для промывки и обработайте мембрану буфером для снятия изоляции в течение 30 минут при температуре 37 °C (убедитесь, что мембрана полностью погружена).
   2. Соберите буфер для зачистки и промойте мембрану в буфере для промывки в течение 5 минут с покачиванием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер для зачистки можно использовать повторно 10 раз перед выбросом.
   3. Вылейте буфер для промывки и на этот раз нанесите первичные антитела MHCI, разведенные в начальной концентрации 1 к 200 (диапазон: от 1 к 200 до 1 к 500). Раскачивайте мембрану при комнатной температуре в течение 1 ч.
   4. После инкубации в первичном антителе MHCI отобрать антитело и промыть мембрану, как показано на этапах 4.1.4 и 4.1.5.
   5. Разбавляют вторичные антитела IgM HRP мыши в блокирующем буфере в соотношении 1 к 20 000. Вылейте блокирующий буфер из мембраны и инкубируйте во вторичной обмотке IgM мыши, как показано на шаге 4.1.7.
   6. Промывка и захват изображения обнаружили MHCI, как описано на шагах 4.1.8–4.1.24.
      ВНИМАНИЕ: Буфер для отпарки содержит фосфин органического соединения 3-5% (класс 8). Обратитесь к MSDS для получения рекомендаций по безопасному обращению.
3. Обнаружение потенциальных MHCIIx с помощью актина
   1. Снимите мембрану еще раз (шаги 4.2.1 и 4.2.2).
   2. Повторите раздел 4.1, на этот раз применяя первичные антитела к актину, разведенные в соотношении 1 к 500 в буфере BSA, а затем вторичные антитела HRP кролика, разбавленные в соотношении 1 к 20 000 в блокирующем буфере.

5. Идентификация типа волокна

1. Анализ сигналов MHCI, MHCIIa и Actin
   1. Ознакомьтесь с панелью интенсивности сигнала (рис. 4A). Обратите внимание на шаги с 5.1.2 по 5.1.4.
   2. Насыщенная интенсивность сигнала качественно указывает на то, что обнаружение белка сильное.
   3. Умеренный указывает на то, что целевой белок присутствует на среднем уровне.
   4. Слабый сигнал указывает на то, что в организме мало целевого белка.
   5. Используйте панель интенсивности сигнала, чтобы классифицировать волокна с «насыщенной», «умеренной» или «слабой» интенсивностью сигнала (рис. 4A).
   6. Определите тип волокна, сначала сравнив результаты MHCIIa и MHCI (рис. 4B, левая и средняя блотины).
   7. Запись волокон с насыщенной или умеренной интенсивностью сигнала только одной изоформы MHC.
   8. Если сигнал изоформы MHC «слабый», оставьте волокно без маркировки (см. рис. 4B).
   9. Наконец, там, где актин наблюдается (умеренная или насыщенная интенсивность сигнала) в волокнах, где не обнаружены MHCI или IIa, запишите его как потенциальное волокно типа IIx (рис. 4B, правое блот).
   10. Регистрируйте волокна со слабым сигналом изоформы MHC, но актин, обнаруженный (умеренной или насыщенной интенсивности), как неидентифицированный.
   11. Отбракуйте образцы со слабым обнаружением или без него (без собранной клетчатки) для всех трех белков-мишеней (рисунок 4C).
   12. Запишите любое волокно, в котором сигналы MHCI и MHCII обнаружены с «насыщенным» или умеренным сигналом. Эти образцы не предназначены для использования в препаратах для конкретных типов волокон.
2. Подготовка образцов для конкретных типов волокон
   1. Для каждой биопсии готовят отдельный образец I и II типа. Для образца типа II комбинируйте минимально необходимое количество волокон (рассчитанное на шаге 2.1.5), в которых MHCIIa обнаруживается на насыщенных или умеренных уровнях.
   2. В отдельной пробирке, помеченной как тип I, повторите этот процесс для волокон, в которых обнаружен MHCI (рис. 4D).
   3. Используйте волокна с умеренной интенсивностью сигнала, если волокон с насыщенными сигналами недостаточно.
   4. Комбинируйте любые потенциальные волокна IIx.
   5. Немедленно используйте образцы волокон для вестерн-блоттинга или храните их при температуре -80 °C для использования в будущем.

6. Подтверждение типа волокна вестерн-блоттингом

1. Используйте 10 мкл каждого образца для конкретного типа волокна (минимальный требуемый объем образца, см. шаг 2.1.5).
2. Разделяют образцы с помощью указанного сборного геля через SDS-PAGE в соответствии с протоколом производителя.
3. Используйте гелевый имидж-сканер для обнаружения белка в геле в соответствии с протоколом производителя.
4. Поместите гель в холодный буфер для переноса 1x на 10 минут.
5. Влажный перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану размером 0,45 мкм (9,5 см x 13,5 см) в соответствии с протоколом производителя.
6. После переноса кратковременно промойте мембрану сверхчистым_Н2Ов емкости. Вылейте сверхчистую воду.
7. Добавьте 10 мл раствора усилителя сигнала антител к мембране и закажите при комнатной температуре в течение 10 минут.
8. Соберите раствор усилителя сигнала антител и промойте 5 раз (5 с на стирку) сверхчистым H₂O.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор усилителя сигнала антител можно использовать 5 раз перед выбросом.
9. Вылейте последнюю промывку, добавьте блокирующий раствор и раскажите при комнатной температуре в течение 1 ч.
10. Используйте чистое лезвие скальпеля или ножницы, чтобы разрезать горизонтально через мембрану с молекулярной массой, которая гарантирует, что белки с молекулярной массой 180 кДа и выше находятся в верхней части мембраны.
11. Используйте этот верхний раздел для дальнейшего подтверждения типа волокна.
12. Используйте порцию ниже 180 кДа для обнаружения различных белков-мишеней.
13. На верхней части мембраны следует следовать разделу 4.1 с первичным и мышиным вторичным антителом к иммуноглобулину M (IgM) HRP.
14. Удалите мембрану (как описано в разделах 4.2.1 и 4.2.2) перед повторением процесса с первичными первичными антителами MHCIIa IgG и вторичными антителами IgG HRP мыши.
15. Раздейте еще раз и, наконец, нанесите первичные первичные антитела MHCI IgM и вторичные антитела IgM HRP мыши.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг является качественным, поэтому любая потеря белка из-за удаления мембраны не является проблемой.
16. Сравните сигнал, обнаруженный различными изоформами MHC (как показано на рисунке 5B). Когда интенсивность сигнала будет обнаружена на уровнях от умеренного до насыщенного в ожидаемом образце (MHCI - тип I, MHCIIa - тип II и MHCIIx - тип IIx), образцы волокна, специфичные для конкретного типа, будут записаны как надежные для использования в будущих исследованиях.
17. Запишите образец как ненадежный, если в образце одинаково обнаружено более одной изоформы MHC.
    ВНИМАНИЕ: Раствор усилителя антител содержит гидроксид натрия 50%. Обратитесь к MSDS для получения рекомендаций по безопасному обращению.

Результаты

Идентификация отдельных мышечных волокон MHCI, MHCIIa и MHCIIx с помощью точечного блоттинга
Особенностью MyDoBID является категоризация переменной интенсивности сигнала MHC и Actin в данном волокне (рис. 4A). Тип волокна определяли по наличию или отсутствию изоформ MHCI и IIa (

Обсуждение

Сбор клетчатки
Основываясь на многолетнем опыте, большинство исследователей могут освоить эту технику; Тем не менее, практика приводит к более быстрому и эффективному сбору волокна для последующего анализа. Чтобы можно было выделить 30 отдельных сегментов волокна определен?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x Denaturing buffer	Make according to recipe	Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributing companies	1x denaturing buffer is made by diluting 3x denaturing buffer 1 in 3 v/v with 1X Tris-HCl (pH 6.8). Store at -20 °C.
3x Denaturing buffer	Make according to recipe	Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributors	3x denaturing buffer contains: 0.125M Tris-HCI, 10% glycerol, 4% SDS, 4 M urea, 10% 2-mercaptoethanol, and 0.001% bromophenol blue, pH 6.8.  Store at -20 °C.
95% Ethanol	N/A	100% ethanol can be sourced from any company	Diluted to 95% with ultra-pure H2O.
Actin rabbit polyclonal antibody	Sigma-Aldrich	A2066	Dilute 1 in 1,000 with BSA buffer.
Analytical scales	Mettler Toledo	Model number: MSZ042101
Antibody enhancer	Thermo Fischer Scientific	32110	Product name is Miser Antibody Extender Solution NC.
Beaker (100 mL)	N/A	N/A
Benchtop centrifuge	Eppendorf	5452	Model name: Mini Spin.
Blocking buffer: 5% Skim milk in Wash buffer.	Diploma	Store bought
BSA buffer: 1 % BSA/PBST, 0.02 % NaN3	BSA: Sigma-Aldrich              PBS: Bio-Rad Laboratories. NaN3 : Sigma-Aldrich	BSA: A6003-25G                         10x PBS: 1610780                       NaN3: S2002	Bovine serum albumin (BSA), Phosphate-buffered saline (PBS), and Sodium azide (NaN3). Store at 4 °C.
Cassette opening lever	Bio-Rad Laboratories	4560000	Used to open the precast gel cassettes.
Chemidoc MP Imager	Bio-Rad Laboratories	Model number: Universal hood III	Any imaging system with Stain-Free gel imaging capabilities.
Criterion blotter	Bio-Rad Laboratories	1704070	Includes ice pack, transfer tray, roller, 2 cassette holders, filter paper, foam pads and lid with cables.
Criterion Cell (Bio-Rad)	Bio-Rad Laboratories	1656001
ECL (enhanced chemiluminescence)	Bio-Rad Laboratories	1705062	Product name: Clarity Max Western ECL Substrate.
Electrophoresis buffer 1x Tris Glycine SDS (TGS)	Bio-Rad Laboratories	1610772	Dilute 10x TGS 1 in 10 with ultra-pure H2O.
Filter paper, 0.34 mm thick	Whatmann	3030917	Bulk size 3 MM, pack 100 sheets, 315 x 335 mm.
Fine tissue dissecting forceps	Dumont	F6521-1EA	Jeweller’s forceps no. 5.
Flat plastic tray/lid	N/A	N/A	Large enough to place the membrane on. Ensure the surface is completely flat.
Freeze-drying System	Labconco	7750030	Freezone 4.5 L with glass chamber sample stage.
Freezer -80 oC	N/A	N/A	Any freezer with a constant temperature of -80 °C is suitable.
Gel releasers	1653320	Bio-Rad	Slide under the membrane to gather or move the membrane.
Grey lead pencil	N/A	N/A
Image lab software	Bio-Rad Laboratories	N/A	Figures refers to software version 5.2.1 but other versions can used.
Incubator	Bio-Rad Laboratories	1660521	Any incubator that can be set to 37 °C would suffice.
Lamp	N/A	N/A
Magnetic stirrer with flea	N/A	N/A
Membrane roller	Bio-Rad Laboratories	1651279	Can be purchased in the Transfer bundle pack. However, if this product is not available, any smooth surface cylindrical tube long enough to roll over the membrane would suffice.
Microcentrifuge tubes  (0.6 mL)	N/A	N/A
Mouse IgG HRP secondary	Thermo Fisher Scientific	31430	Goat anti-Mouse IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilute at 1 in 20,000 in blocking buffer.
Mouse IgM HRP secondary	Abcam	ab97230	Goat Anti-Mouse IgM mu chain. Use at the same dilution as mouse IgG.
Myosin Heavy Chain I (MHCI) primary antibody	DSHB	A4.840	Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.
Myosin Heavy Chain IIa (MHCIIa) primary antibody	DSHB	A4.74	Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.
Myosin Heavy Chain IIx (MHCIIx) primary antibody	DSHB	6H1	Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.
Nitrocellulose Membrane 0.45 µm	Bio-Rad Laboratories	1620115	For Western blotting.
Petri dish lid	N/A	N/A
Plastic tweezers	N/A	N/A
Power Pack	Bio-Rad Laboratories	164-5050	Product name: Basic power supply.
Protein ladder	Thermo Fisher Scientific	26616	PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa.
PVDF Membrane 0.2 µm	Bio-Rad Laboratories	1620177
Rabbit HRP secondary	Thermo Fisher Scientific	31460	Goat anti-Rabbit IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilution same as mouse secondary antibodies.
Rocker	N/A	N/A
Ruler	N/A	N/A
Scissors	N/A	N/A
Stereomicroscope	Motic	SMZ-168
Stripping buffer	Thermo Fisher Scientific	21059	Product name: Restore Western Blot Stripping Buffer.
Tissue (lint free)	Kimberly-Clark professional	34120	Product name: Kimwipe.
Transfer buffer (1x Tris Glycine buffer (TG), 20% Methanol)	TG: Bio-Rad Laboratories   Methanol: Merck	TG buffer: 1610771           Methanol: 1.06018	dilute 10x TG buffer with ultra-pure H2O to 1x. Add 100% Methanol to a final concentration of 20% Methanol. Store at 4 °C.
Transfer tray	Bio-Rad Laboratories	1704089
UV-activation precast gel	Bio-Rad Laboratories	5678085	Gel type: 4–15% Criterion TGX Stain-Free Protein Gel, 26 well, 15 µL.
Vortex	N/A	N/A
Wash buffer (1x TBST)	10x TBS: Astral Scientific  Tween 20: Sigma	BIOA0027-4L	1x TBST recipe: 10x Tris-buffered saline (TBS) is diluted down to 1x with ultra-pure H2O, Tween 20 is added to a final concentration of 0.1%. Store buffer at 4 °C.
Wash containers	Sistema	Store bought	Any tupperware container, that suits the approximate dimensions of the membrane would suffice.