זיהוי סוג סיבים של שרירי השלד האנושיים

Summary

פרוטוקול זה מדגים בידוד של סיב יחיד משרירי השלד האנושיים המיובשים בהקפאה וסיווג סוג סיבים על פי איזופורם שרשרת כבדה מיוסין (MHC) באמצעות טכניקת כתמת הנקודות. לאחר מכן ניתן לנתח דגימות סיבים MHC I ו-II מזוהות עבור הבדלים ספציפיים לסוג הסיבים בביטוי חלבונים באמצעות כתמים מערביים.

Abstract

ניתן להשתמש בטכניקה המתוארת כאן כדי לזהות איזופורמים ספציפיים של שרשרת מיוזין כבדה (MHC) במקטעים של סיבי שריר בודדים באמצעות הכתמת נקודות, להלן זיהוי שרשרת כבדה של האוסין שליעל ידי Dot Blotting for IDentification of muscle fiber type (MyDoBID). פרוטוקול זה מתאר את תהליך הייבוש בהקפאה של שרירי השלד האנושיים ובידוד מקטעים של סיבי שריר בודדים. באמצעות MyDoBID, סיבים מסוג I ו- II מסווגים עם נוגדנים ספציפיים MHCI ו- IIa, בהתאמה. סיבים מסווגים משולבים לאחר מכן לדגימות ספציפיות לסוג הסיבים עבור כל ביופסיה.

סך החלבון בכל דגימה נקבע על ידי אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד נתרן דודציל-סולפט (SDS-PAGE) וטכנולוגיית ג'ל המופעלת על ידי UV. סוג הדגימות של הסיבים מאומת באמצעות כתמים מערביים. מתוארת גם החשיבות של ביצוע נורמליזציה של העמסת חלבונים כדי לשפר את זיהוי חלבון המטרה על פני כתמים מערביים מרובים. היתרונות של איחוד סיבים מסווגים לדגימות ספציפיות לסוג סיבים בהשוואה לסיבים מערביים יחידים, כוללים רב-תכליתיות דגימה, תפוקת דגימה מוגברת, השקעה קצרה יותר בזמן ואמצעים לחיסכון בעלויות, כל זאת תוך שמירה על מידע יקר ערך ספציפי לסוג הסיב שלעתים קרובות מתעלמים ממנו באמצעות דגימות שריר הומוגניות. מטרת הפרוטוקול היא להשיג זיהוי מדויק ויעיל של סיבים מסוג I ו-II שבודדו מדגימות שרירי שלד אנושיים מיובשים בהקפאה.

סיבים בודדים אלה משולבים לאחר מכן ליצירת דגימות ספציפיות לסוג I וסוג II. יתר על כן, הפרוטוקול מורחב וכולל זיהוי של סיבים מסוג IIx, תוך שימוש באקטין כסמן לסיבים שהיו שליליים עבור MHCI ו- MHCIIa, אשר אושרו כסיבי IIx על ידי כתם מערבי. לאחר מכן משתמשים בכל דגימה ספציפית לסוג הסיב כדי לכמת את הביטוי של חלבוני מטרה שונים באמצעות טכניקות קרישה מערביות.

Introduction

שריר השלד הוא רקמה הטרוגנית, בעלת תכונות מטבוליות והתכווצות תאיות מובהקות התלויות בשאלה אם התא (סיבים) הוא עווית איטית (סוג I) או עווית מהירה (סוג II). ניתן לזהות את סוג הסיב על ידי בחינת איזופורמים של שרשרת מיוזין כבדה (MHC), הנבדלים זה מזה במספר דרכים, כולל זמן התכווצות, מהירות הקיצור ועמידות בפני עייפות¹. איזופורמים עיקריים של MHC כוללים סוג I, סוג IIa, סוג IIb וסוג IIx והפרופילים המטבוליים שלהם הם חמצוניים (סוג I ו- IIa) או גליקוליטיים (IIx, IIb)¹. חלקם של סוגי סיבים אלה משתנה בסוג השריר ובין המינים. סוג IIb נמצא באופן נרחב בשרירי מכרסמים. שרירי האדם אינם מכילים סיבים מסוג IIb ומורכבים בעיקר מאיזופורמים מסוג MHC מסוג I ו- IIa, עם חלק קטן מסיבי IIx². פרופילי ביטוי החלבונים משתנים בין סוגי סיבים שונים, וניתן לשנות אותם עם הזדקנות³, פעילות גופנית ^4,5 ומחלה⁶.

לעתים קרובות מתעלמים או לא מאפשרים למדוד תגובות תאיות בסוגים שונים של סיבי שריר השלד בגלל בדיקת הומוגנטים של שרירים (שילוב של כל סוגי הסיבים). כתם מערבי חד-סיבתי מאפשר חקירה של חלבונים מרובים בסיבי שריר בודדים⁷. מתודולוגיה זו שימשה בעבר לייצור מאפיינים חדשניים ואינפורמטיביים של סיב בודד שלא ניתן היה להשיג באמצעות תכשירים הומוגניים. עם זאת, ישנן כמה מגבלות של המתודולוגיה המערבית המקורית של כתם סיב יחיד, כולל האופי הגוזל זמן, חוסר היכולת לייצר שכפול דגימות, והשימוש בריאגנטים כימילומינסנציה משופרת (ECL) יקרים ורגישים. אם נעשה שימוש ברקמה טרייה, שיטה זו מוגבלת עוד יותר בשל אילוצי הזמן של הצורך לבודד סיבים בודדים במסגרת זמן מוגבלת (כלומר, 1-2 שעות). למרבה המזל, ריסון זה מתמתן על ידי בידוד מקטעים חד-סיביים מרקמה מיובשת בהקפאה⁸. עם זאת, איסוף סיבים מדגימות מיובשות בהקפאה מוגבל על ידי גודל ואיכות הרקמה הביופסית.

זיהוי סוג הסיבים בשיטת הכתמת נקודות⁹ הורחב והורחב באופן משמעותי בפרוטוקול מקיף זה. בעבר, הוכח כי מעט כמו ~ 2-10 מ"ג של רקמת שריר במשקל רטוב מספיק לייבוש בהקפאה וניתוח חלבון איזופורם MHC סיב יחיד⁹. Christensen et ^al.9 השתמשו ב-30% מקטע סיבים ~1 מ"מ כדי לזהות את איזופורם MHC הקיים על ידי כתם נקודה, אשר אושר על ידי כתם מערבי. עבודה זו הראתה כי על ידי החלפת כתם מערבי בכתמים נקודתיים, העלויות הכוללות הופחתו פי ~ 40 (עבור 50 מקטעי סיבים). לאחר מכן "אוגמו" סיבים לדגימות מסוג I ו-II, שאפשרו שכפול ניסיוני⁹. עם זאת, התקבלו רק שתי דגימות ספציפיות לסוג הסיבים: סוג I (MHCI חיובי) וסוג II (סיבים חיוביים MHCII), עם דגימות מסוג II המכילות תערובת של MHCIIa ו- MHCIIx ^6,10. יש לציין כי הפרוטוקול הנוכחי מדגים כיצד ניתן לזהות סיבי IIx טהורים מסוג IIx ומספק זרימת עבודה מפורטת ביותר (המסוכמת באיור 1), כולל אסטרטגיות לפתרון בעיות נפוצות בפרוטוקול.

Protocol

דגימות שריר אנושיות נלקחו מהווסטוס לטרליס מ n = 3 (2 גברים, 1 נקבה), בגילאי 70-74 שנים בתנאים סטריליים באמצעות הרדמה מקומית (Xylocaine) ומחט ברגסטרום שונה עבור יניקה ידנית^11,12. הדגימות היו תת-קבוצה של מחקר קודם שאושר על ידי ועדת האתיקה של המחקר האנושי באוניברסיטת ויקטוריה (HRETH11/221) ונערך בהתאם להצהרת הלסינקי¹³. המשתתפים נתנו הסכמה כתובה ומודעת להשתתף במחקר זה. פרטים מלאים על כל החומרים הדרושים לפרוטוקול זה מוצגים בטבלת החומרים. בנוסף, רשימה של אסטרטגיות לפתרון בעיות המטפלות בבעיות פרוטוקול נפוצות מסופקת בטבלה 1.

1. ייבוש בהקפאה

1. בזמן שאתם שומרים את דגימות השריר שעברו ביופסיה קפואות על קרח יבש, שוקלים ומטפלים בצינורית קפואה ריקה על המאזניים.
2. לשקול במהירות מינימום של 10 מ"ג של רקמה קפואה במשקל רטוב. רשום את המשקל למקום עשרוני אחד.
3. הפקידו את הרקמה בצינור המיקרוצנטריפוגה המקורר מראש שיש לו 3-4 חורים שנוקבו לתוך המכסה והכניסו אותו לכוס קטנה עם 2-3 כדורי קרח יבש.
4. פעל בהתאם להוראות ההפעלה של יצרן מייבש ההקפאה.
5. ודאו שכל השסתומים במייבש ההקפאה סגורים והפעילו את מייבש ההקפאה.
6. השתמשו בלוח הבקרה כדי לבדוק שנקודת הגדרת הוואקום תוכנתה לתנאי ייבוש אופטימליים בהקפאה עבור רקמה אנושית, 0.12 מיליבר (mBar) (איור 2).
7. לחץ ידנית על מייבש ההקפאה והמתן עד שהתא יתקרר ל -40 ^מעלותצלזיוס.
8. לאחר שהתא הגיע לטמפרטורה זו, הסירו את המכסה, ולאחר מכן את תא הזכוכית, והניחו את הכד (עם דגימת שריר) על במת המתכת.
9. החלף את תא הזכוכית והמכסה. סגרו את שסתום שחרור הוואקום על המכסה והמתינו עד שנורית סולם הוואקום תהפוך לירוקה כדי לוודא שהמייבש אטום בוואקום.
10. יבשו בהקפאה את דגימות השריר למשך 48 שעות. לאחר השלמת הייבוש בהקפאה, כבו את משאבת הוואקום על ידי לחיצה על כפתור הוואקום ופתחו את שסתום שחרור הוואקום במכסה.
11. הסירו את מכסה התא ואספו את הדגימה המיובשת בהקפאה. שקלו את הרקמה ורשמו את המשקל למקום עשרוני אחד.
12. חישוב אחוז אובדן המשקל; ~ ירידה של 75% במשקל מצביעה על כך שהרקמה יובשה בהצלחה בהקפאה (בעבודה זו, ממוצע ± SD, 76 ± 9%, n = 11 דגימות שריר).
13. לחץ על AUTO כדי לכבות את משאבת הוואקום והמקפיא. אפשרו ליחידה להגיע לטמפרטורת הסביבה.
14. נקו את סלילי הקירור בהתאם להוראות היצרן ונקזו נוזלים שהצטברו מהקולט.
    הערה: איסוף הסיבים יכול להתחיל באופן מיידי. כאשר הרקמה אינה משמשת לבידוד סיבים, יש לשמור את הדגימה המיובשת בהקפאה בטמפרטורה של -80°C במיכל אטום עם חרוזי מייבש.  אזהרה: קרח יבש הוא מסוכן (דרגה 9); עיין ב- MSDS לקבלת טיפול בטוח מומלץ.

2. איסוף סיבים

1. הכנת אוסף סיבים
   1. יש לסמן לפחות 50 צינורות מיקרופוגה (סיבים 1 עד 50) ופיפטה 10 μL של חיץ דנטורינג לכל צינור.
   2. הכינו את אזור האיסוף עם שני זוגות של מלקחיים לניתוח רקמות עדינות, רקמה נטולת מוך, מנורת ספסל, סטריאומיקרוסקופ (עם הבמה השחורה למעלה), מערבולת וצנטריפוגת ספסל.
   3. הניחו את דגימת השריר המיובשת בהקפאה על מכסה צלחת פטרי. הניחו את המכסה על במת המיקרוסקופ המנתח.
   4. צפה בסרטון של דיסקציה של סיב יחיד. תרגלו את הפרוטוקול המלא מאיסוף סיבים ועד לזיהוי סוג סיב יחיד לפחות פעמיים לפני תחילת המחקר.
   5. לפני איסוף הסיבים, יש לחשב את הנפח הכולל הדרוש לדגימת סוג סיבים מכל ביופסיה באופן הבא. לדוגמה, אם הנפח ההתחלתי של 1 סיב = 10 μL והנפח שנותר לאחר MyDoBID הוא (1 סיב × 10 μL) - 1 μL המשמש להכתמת נקודות = 9 μL (נפח דגימה), חשב את נפח הדגימה הכולל הנדרש על ידי הכפלת נפח הדגימה (μL) במספר הכולל של כתמים מערביים שיופעלו והכפל סכום זה כדי לקחת בחשבון יתירות: (9 μL × 4 כתמים מערביים) × 2 = 72 μL. חשב את מספר הסיבים הדרושים לכל דגימה מוקלדת על ידי חלוקת נפח הדגימה הסופי הנדרש (μL) בנפח הדגימה לכל דגימה ספציפית לסוג סיבים (לדוגמה, 72 μL ÷ 9 μL = 8 סיבים לכל דגימה ספציפית לסוג הסיב). כדי להשיג זאת, לאסוף סך של 50 סיבים.
      הערה: נפח הדגימה הנדרש הוא ריכוז החלבון המינימלי הנדרש להפעלת MyDoBID ו- Western Blotting אם כמות החלבון המוטענת שווה לסיב ~3 מ"מ (~ 12 מיקרוגרם משקל רטוב) עבור כל דגימה (ראה קובץ משלים 1 לפרטים). עם זאת, נפח זה אינו לוקח בחשבון אם ג'לים חוזרים נדרשים עבור חלבון נתון.  זהירות: המלקחיים חדים; טפל בהם בזהירות כדי למנוע את הסיכון של ניקוב העור.
2. בידוד סיב יחיד
   1. על פיסת נייר קטנה בגודל 5 ס"מ x 1 ס"מ, השתמש בסרגל כדי לצייר קו של 1 ס"מ. סמן כל 1 מ"מ בקו זה.
   2. הכניסו אותו מתחת למכסה צלחת הפטרי כמדריך להערכת אורך הסיבים שנאספו.
   3. הניחו את דגימת השריר המיובשת בהקפאה מתחת לסטריאומיקרוסקופ בהגדלה נמוכה (x 7.5). השתמשו בזוג אחד של מלקחיים לניתוח רקמות עדינות כדי להחזיק את השריר המיובש בהקפאה במקומו ועם השני התחילו להפריד צרורות קטנים של סיבים (כפי שניתן לראות בסרטון).
   4. בודדו צרור סיבים אחד והמשיכו להפריד זה מזה עד שמקטעי סיבים בודדים מבודדים מהצרור.
   5. אספו לפחות 50 סיבים באורך ~1 מ"מ לפחות.
   6. העבירו את הסיב לחלל ריק על צלחת הפטרי. בדוק מקטעים בעלי סיב יחיד בהגדלה גבוהה יותר (x 50). ודאו שמדובר בסיב בודד על ידי הפרדה נוספת של הסיב בקצהו. אם הסיב נשבר במקום להיפרד, זהו סיב יחיד.
3. דנטורציה של סיבים
   1. בעזרת מלקחיים, אספו בעדינות את הסיב והניחו אותו ישירות לתוך חיץ הדנטורינג המקורק (אל תתנו למלקחיים להיתקל בחיץ).
   2. בדוק את המלקחיים מתחת למיקרוסקופ כדי לוודא שהסיב הוסר בהצלחה. סגור את הצינור והקש בחוזקה על תחתית הצינור על הספסל שלוש פעמים כדי להבטיח שהסיב יזוז לתוך החיץ.
   3. נקו את המלקחיים באמצעות רקמה נטולת סיבים לפני שתעברו לסיב הבא. חזור על תהליך זה עד שכל הסיבים נאספים.
   4. מערבלים את דגימות הסיבים וצנטריפוגה קצרה במשך 5 שניות ב 2,500 × גרם כדי למשוך את הדגימה לתחתית הצינור.
      הערה: משך הצנטריפוגה (5 שניות) מתוזמן מההתחלה (0 × גרם) עד שהמהירות מגיעה ל~2,500 × גרם.
   5. השאירו את הדגימות בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת. יש לאחסן בטמפרטורה של -80°C לשימוש עתידי. יש להקפיא ולאחר מכן להפשיר את הדגימות לפני השימוש.

3. כתם נקודה

1. הכנת הממברנה והפעלתה
   1. מדדו, תייגו וחתכו לגודל קרום פוליווינילידן דיפלואוריד (PVDF) אחד (גודל נקבוביות של 0.2 מיקרומטר) כדי להתאים ל-50 דגימות (~10.5 ס"מ x 5.5 ס"מ).
   2. סמן את הגבול השמאלי מבחינה מספרית מלמעלה למטה (1 עד 10) ואת הגבול העליון בסדר אלפביתי משמאל לימין (A עד E) במרווחים של 1 ס"מ זה מזה.
   3. הכן ארבעה גיליונות נייר סינון במידות של 12.5 ס"מ x 7.5 ס"מ.
   4. ערמו שני גיליונות יחד ליצירת ערימה. השרו מראש את ערימת נייר הסינון במאגר העברה אחד.
   5. מניחים את הממברנה במיכל. יוצקים 95% אתנול על הממברנה, עם נפח מספיק כדי לטבול לחלוטין את הממברנה (10-15 מ"ל). התסיסו על הנדנדה במשך דקה.
   6. אספו את האתנול, טבלו את הממברנה במאגר העברה 1x (~ 15 מ"ל), ונדנדו במשך 2 דקות נוספות.
      הערה: ניתן לעשות שימוש חוזר הן באתנול והן בחיץ העברה לניסויים עתידיים של הכתמת נקודות עד להיווצרות שיקוע (שינוי לאחר שישה שימושים).
   7. הנח את ערימת נייר המסנן הספוג במאגר העברה על משטח שטוח הניתן להזזה, כגון מכסה גדול, ושטח באמצעות הרולר. מקם את קרום PVDF על הערימה באמצעות משחרר ג'ל או פינצטה.
   8. הניחו גיליון בודד של נייר סינון יבש על גבי הממברנה והעבירו את הגלגלת מעל נייר הסינון כדי לספוג את עודפי החיץ על פני הממברנה. הסר את נייר הסינון העליון מבלי לשפשף את הממברנה.
      אזהרה: מתנול (דרגה 3, תת-סיכון 6.1) ואתנול (דרגה 3) מסוכנים. עיין בגליון הנתונים של בטיחות החומרים (MSDS) לקבלת המלצות לטיפול בטוח.
2. ספיגת דגימה לממברנה
   1. הפשירו את דגימות הסיבים, בצעו צנטריפוגה קצרה (5 שניות) בטמפרטורת החדר כמו בשלב 2.3.4 וערבבו היטב את הדגימה.
   2. מבלי לגעת בקרום עם קצה הפיפטה, יש להפקיד באיטיות טיפה ~1 μL של כל דגימה על הממברנה באזור המיועד. מידות השטח המיועד לדגימת סיבים הן ~ 1 ס"מ x 1 ס"מ. המטרה היא לאתר את הדגימה במרכז אזור זה.
   3. הניחו לטיפות הדגימה להיספג דרך הממברנה למשך 15 דקות לפחות. ודא שלא נשאר חיץ דגימה והוא נספג לחלוטין.
   4. בעזרת פינצטה מפלסטיק, הרימו בזהירות את הממברנה מערימת נייר הפילטר הלח, הניחו אותה על גיליון יבש אחד של נייר פילטר, וייבשו את הממברנה למשך 5 דקות לפחות.
   5. ברגע שכתמי הדגימה הופכים לבנים לחלוטין, הפעל מחדש את הממברנה.
3. הפעלה מחדש של הממברנה וחסימה
   1. הפעל מחדש את הממברנה על-ידי חזרה על שלבים 3.1.5 ו- 3.1.6.
   2. הניחו את הממברנה במאגר השטיפה ושטפו במשך 5 דקות עם נדנדה. יש להשליך את מאגר הכביסה.
   3. דוגרים על הממברנה בחיץ חוסם למשך 30 דקות תוך כדי נדנוד.
   4. שטפו את הממברנה 3 פעמים עם חיץ שטיפה עד שהמאגר כבר לא מעונן.
   5. השאירו את הממברנה בשטיפה הסופית על הנדנדה.

4. תיוג חיסוני

1. איתור MHCIIa
   1. יש לדלל את הנוגדן הראשוני MHCIIa ב-1 ל-200 ב-10 מ"ל של מאגר אלבומין בסרום בקר (BSA).
   2. יש להשליך את חיץ השטיפה מהממברנה ולאחר מכן לשפוך את נוגדן MHCIIa המדולל על הממברנה.
   3. הניחו את המיכל (עם הממברנה ב-MHCIIa) על הנדנדה בטמפרטורת החדר למשך שעתיים או ב-4°C למשך הלילה.
   4. יש לאסוף את נוגדן MHCIIa ולאחסן אותו בטמפרטורה של 4°C. שטפו את הממברנה עם חיץ חוסם למשך 2 דקות על הנדנדה.
      הערה: ניתן לעשות שימוש חוזר בכל הנוגדנים הראשוניים עד פי חמישה כל עוד המאגר נשאר ברור.
   5. לשטוף פעמיים נוספות; 5 דקות בכל פעם; שלוש שטיפות בסך הכל.
   6. לדלל עכבר אימונוגלובולין G חזרת פרוקסידז (IgG-HRP) נוגדן משני ב 1 ל 20,000 ב 10 מ"ל של חיץ חוסם ולהוסיף לממברנה.
   7. השליכו את חיץ השטיפה ודגרו על הממברנה בעכבר IgG-HRP משני עם נדנוד למשך שעה אחת.
   8. יש להשליך את המשני ולשטוף את הממברנה במאגר השטיפה (2, 5, 5 דקות).
   9. השאירו את הממברנה ספוגה בשטיפה הסופית עד שהיא מוכנה להדמיה.
   10. הפעל את מכונת ההדמיה בג'ל, המתן 15 דקות עד שמכונת ההדמיה תגיע לטמפרטורת ההפעלה הנדרשת ולאחר מכן פתח את תוכנת ההדמיה (ראה טבלת חומרים).
   11. בחלון התוכנה, לחץ על New Single Channel Protocol (איור 3A). לתמונת אור לבן של הממברנה, תחת יישומים | כתמים | לחץ על Colorimetric (איור 3B).
   12. לחץ על אזור הג'ל; כל אפשרות מתוכנתת למידות ספציפיות כך שיתאימו לגודל של סוגי ג'ל שונים. בחרו באפשרות המתאימה ביותר למידות הממברנה (איור 3C).
   13. הכינו את ה-ECL על ידי שילוב ריאגנטים של לומינול ופרוקסידז ביחס של 1:1. הכינו נפח מספיק של תערובת ECL כדי לכסות את כל הממברנה, בדרך כלל נדרש נפח כולל של 800-1,000 מיקרוליטר.
   14. מניחים את הממברנה על מגש פלסטיק גדול ושקוף ומפזרים את תערובת ECL על הממברנה.
   15. הניחו את הממברנה על לוח ההדמיה.
   16. לחץ על מיקום ג'ל (כפתור צהוב) לתצוגה חיה של המצלמה. לחצו לחיצה ממושכת וגררו את לחצן הזום כדי להגדיל את אזור ההדמיה של הממברנה. בשלב זה, יישרו את מיקום הממברנה במידת הצורך.
   17. לחץ על הפעל פרוטוקול (כפתור ירוק) והמתן להפקת תמונה צבעונית של הממברנה. שמרו תמונה זו כדי לסייע בהתאמת הנקודות לדוגמת הסיב המתאימה.
   18. מבלי להזיז את הממברנה, שנו את היישום בתוכנה על-ידי לחיצה על האפשרות לכריכה של 2 x 2 (Chemi High Resolution) (איור 3D).
   19. תחת חשיפה לתמונה ותוכנה, מטב את זמן החשיפה, לחץ על פסים חלשים (איור 3E) | מצב צבירת אותות.
   20. תחת הגדרה, הקלד 1 שניות עבור התמונה הראשונה, 30 שניות עבור התמונה האחרונה ו- 30 תמונות בסך הכל (איור 3F).
   21. לחץ על הפעל פרוטוקול.
   22. שמור תמונה בשלבים הבאים: לפני רוויית אות (כל הנקודות הגלויות שחורות), רוויית אות ראשונית (נקודות מסוימות מתחילות להרוות) וכתמים רוויים יתר על המידה (כל הכתמים עם אות חזק שזוהה הם רוויים).
   23. שמור את כל התמונות הדרושות לפני סיום הצטברות האות. הוציאו את הממברנה מהתמונה.
   24. בעזרת משחרר הג'ל, החזירו את הממברנה למיכל בעזרת חיץ השטיפה.
2. איתור MHCI
   1. שפכו את חיץ השטיפה החוצה ופנקו את הממברנה עם חיץ הפשטה למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37°C (ודאו שהקרום שקוע לחלוטין).
   2. אספו מחדש את חיץ ההפשטה ושטפו את הממברנה בחיץ השטיפה במשך 5 דקות עם נדנדה.
      הערה: ניתן לעשות שימוש חוזר במאגר הפשטה 10x לפני השלכתו.
   3. שפכו החוצה את חיץ השטיפה והפעם מרחו נוגדן MHCI ראשוני מדולל בריכוז התחלתי של 1 ל-200 (טווח: 1 ל-200 ל-1 ל-500). רוק את הממברנה בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת.
   4. לאחר הדגירה בנוגדן MHCI ראשוני, יש לאסוף את הנוגדן ולשטוף את הממברנה כמו בשלבים 4.1.4 ו-4.1.5.
   5. לדלל עכבר IgM HRP נוגדן משני בחסימת חיץ ב 1 ל 20,000. יוצקים את המאגר החוסם מהממברנה ודגרים בעכבר IgM משני כמו בשלב 4.1.7.
   6. שטיפה ולכידת תמונה זיהו MHCI כמו בשלבים 4.1.8 עד 4.1.24.
      אזהרה: מאגר הפשטה מכיל אורגנו פוספין 3-5% (דרגה 8). עיין ב- MSDS לקבלת המלצות לטיפול בטוח.
3. איתור MHCIIx פוטנציאלי באמצעות Actin
   1. הפשיט את הממברנה פעם נוספת (שלבים 4.2.1 ו- 4.2.2).
   2. חזור על סעיף 4.1, הפעם תוך שימוש בנוגדן ראשוני אקטין מדולל ב-1 ל-500 במאגר BSA ולאחר מכן נוגדן משני HRP מדולל ב-1 ל-20,000 במאגר חוסם.

5. זיהוי סוג סיבים

1. ניתוח אותות MHCI, MHCIIa ואקטין
   1. הכירו את לוח עוצמת האות (איור 4A). רשום לעצמך את שלבים 5.1.2 עד 5.1.4.
   2. עוצמת אות רווי מצביעה איכותית על כך שזיהוי החלבון חזק.
   3. מתון מציין כי חלבון המטרה נמצא ברמה בינונית.
   4. אות חלש מצביע על נוכחות מועטה של חלבון מטרה.
   5. השתמשו בלוח עוצמת האות כדי לסווג סיבים עם עוצמת אות 'רוויה', 'בינונית' או 'חלשה' (איור 4A).
   6. בצעו זיהוי סוג סיבים על-ידי השוואת תוצאות MHCIIa ו-MHCI תחילה (איור 4B, כתמים שמאליים ואמצעיים).
   7. הקלט סיבים עם עוצמת אות רוויה או בינונית של איזופורם MHC אחד בלבד.
   8. אם אות האיזופורם MHC 'חלש', השאירו את הסיב לא מסומן (ראו איור 4B).
   9. לבסוף, כאשר אקטין נצפה (עוצמת אות בינונית או רוויה) בסיבים ללא זיהוי MHCI או IIa, רשמו אותו כסיב פוטנציאלי מסוג IIx (איור 4B, כתם ימני).
   10. הקלט סיבים עם אות איזופורם MHC חלש אך אקטין זוהה (עוצמה בינונית או רוויה) כבלתי מזוהה.
   11. השליכו דגימות עם זיהוי חלש או ללא זיהוי (ללא סיבים נאספים) עבור כל שלושת חלבוני המטרה (איור 4C).
   12. הקלט כל סיב שבו אותות MHCI ו- MHCII מזוהים עם אות 'רווי' או מתון. דגימות אלה אינן מיועדות לשימוש בתכשיר ספציפי לסוג הסיבים.
2. הכנת דגימות ספציפיות לסוג סיבים
   1. הכינו דגימה נפרדת מסוג I ו-II לכל ביופסיה. עבור דגימה מסוג II, שלב את מספר הסיבים המינימלי הנדרש (מחושב בשלב 2.1.5) שבהם MHCIIa מזוהה ברמות רוויות או בינוניות.
   2. בצינור נפרד שמסומן כסוג I, חזרו על התהליך הזה עבור סיבים שבהם MHCI מזוהה (איור 4D).
   3. השתמש בסיבים עם עוצמת אות בינונית אם אין מספיק סיבים עם אותות רוויים.
   4. שלב כל סיבי IIx פוטנציאליים.
   5. השתמש מיד בדגימות ספציפיות לסוג סיבים עבור כתמים מערביים או לאחסן אותם ב -80 ° C לשימוש עתידי.

6. אישור סוג סיבי כתם מערביים

1. נצלו 10 μL מכל דגימה ספציפית לסוג הסיב (נפח הדגימה המינימלי הנדרש, ראה שלב 2.1.5).
2. יש להפריד דגימות באמצעות הג'ל הטרומי שצוין באמצעות SDS-PAGE בהתאם לפרוטוקול היצרן.
3. השתמש במכונת הדמיה של ג'ל כדי לזהות את החלבון בג'ל בהתאם לפרוטוקול היצרן.
4. מניחים את הג'ל במאגר העברה קר 1x למשך 10 דקות.
5. העברה רטובה של החלבונים לקרום ניטרוצלולוז בגודל 0.45 מיקרומטר (9.5 ס"מ x 13.5 ס"מ) על פי פרוטוקול היצרן.
6. לאחר ההעברה, לשטוף בקצרה את הממברנה עם ultrapure H₂O במיכל. יוצקים החוצה את המים האולטרה-טהורים.
7. הוסף 10 מ"ל של תמיסת משפר אות נוגדנים לממברנה ולסלע בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
8. אסוף מחדש את תמיסת משפר אות הנוגדנים ושטוף 5x (5 שניות לכל כביסה) עם H₂O טהור במיוחד.
   הערה: ניתן להשתמש בתמיסת משפר אות נוגדנים פי 5 לפני השלכתה.
9. יוצקים החוצה את השטיפה האחרונה, מוסיפים תמיסת חסימה ומתנדנדים בטמפרטורת החדר למשך שעה.
10. השתמש בלהב אזמל נקי או מספריים כדי לחתוך אופקית על פני הממברנה במשקל מולקולרי המבטיח כי חלבונים בגודל 180 kDa ומעלה נמצאים בחלק העליון של הממברנה.
11. השתמשו בחלק העליון הזה לאישור נוסף של סוג הסיב.
12. השתמש בחלק מתחת 180 kDa כדי לזהות חלבוני מטרה שונים.
13. בחלק העליון של הממברנה, בצע את סעיף 4.1 עם נוגדן משניים MHCIIx ראשוני ועכבר אימונוגלובולין M (IgM) HRP.
14. הסירו את הממברנה (כמתואר בסעיפים 4.2.1 ו-4.2.2) לפני חזרה על התהליך עם MHCIIa IgG ראשוני ונוגדן משני מסוג IgG HRP בעכבר.
15. הפשיטו פעם נוספת ולבסוף מרחו נוגדן משני מסוג MHCI IgM ראשוני ועכבר מסוג IgM HRP.
    הערה: שלב זה הוא איכותי ולכן כל אובדן חלבון עקב הפשטת הממברנה אינו מהווה דאגה.
16. השוו את האות שזוהה בין איזופורמים שונים של MHC (כפי שניתן לראות באיור 5B). כאשר עוצמת האות מזוהה ברמות בינוניות עד רוויות במדגם הצפוי (MHCI - סוג I, MHCIIa - סוג II ו- MHCIIx - סוג IIx), הדגימות הספציפיות לסוג הסיב יירשמו כאמינות לשימוש במחקרים עתידיים.
17. רשום את הדגימה כבלתי אמינה כאשר יותר מאיזופורם MHC אחד מזוהה באותה מידה בדגימה.
    אזהרה: תמיסת משפר נוגדנים מכילה נתרן הידרוקסידי 50%. עיין ב- MSDS לקבלת המלצות לטיפול בטוח.

תוצאות

זיהוי סיבי שריר בודדים מסוג MHCI, MHCIIa ו-MHCIIx באמצעות כתם נקודות
מאפיין של MyDoBID הוא סיווג של עוצמת האות MHC ו-Actin המשתנה בסיב נתון (איור 4A). סוג הסיבים זוהה על-ידי נוכחות או היעדר איזופורמים MHCI ו-IIa (איור 4B). שישה סיבים לא הראו זיהוי MHC או אקטין (actin), מה שמצביע...

Discussion

אוסף סיבים
בהתבסס על מספר שנות ניסיון, רוב החוקרים יכולים לשלוט בטכניקה זו; עם זאת, תרגול מוביל לאיסוף סיבים מהיר ויעיל יותר לניתוחים במורד הזרם. כדי שניתן יהיה לבודד 30 מקטעי סיבים בודדים באיכות לאיגום, מומלץ לאסוף 50 מקטעי סיבים בכל דגימה. מומלץ ללמוד היטב את סרטון איסוף הסיבים ו?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x Denaturing buffer	Make according to recipe	Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributing companies	1x denaturing buffer is made by diluting 3x denaturing buffer 1 in 3 v/v with 1X Tris-HCl (pH 6.8). Store at -20 °C.
3x Denaturing buffer	Make according to recipe	Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributors	3x denaturing buffer contains: 0.125M Tris-HCI, 10% glycerol, 4% SDS, 4 M urea, 10% 2-mercaptoethanol, and 0.001% bromophenol blue, pH 6.8.  Store at -20 °C.
95% Ethanol	N/A	100% ethanol can be sourced from any company	Diluted to 95% with ultra-pure H2O.
Actin rabbit polyclonal antibody	Sigma-Aldrich	A2066	Dilute 1 in 1,000 with BSA buffer.
Analytical scales	Mettler Toledo	Model number: MSZ042101
Antibody enhancer	Thermo Fischer Scientific	32110	Product name is Miser Antibody Extender Solution NC.
Beaker (100 mL)	N/A	N/A
Benchtop centrifuge	Eppendorf	5452	Model name: Mini Spin.
Blocking buffer: 5% Skim milk in Wash buffer.	Diploma	Store bought
BSA buffer: 1 % BSA/PBST, 0.02 % NaN3	BSA: Sigma-Aldrich              PBS: Bio-Rad Laboratories. NaN3 : Sigma-Aldrich	BSA: A6003-25G                         10x PBS: 1610780                       NaN3: S2002	Bovine serum albumin (BSA), Phosphate-buffered saline (PBS), and Sodium azide (NaN3). Store at 4 °C.
Cassette opening lever	Bio-Rad Laboratories	4560000	Used to open the precast gel cassettes.
Chemidoc MP Imager	Bio-Rad Laboratories	Model number: Universal hood III	Any imaging system with Stain-Free gel imaging capabilities.
Criterion blotter	Bio-Rad Laboratories	1704070	Includes ice pack, transfer tray, roller, 2 cassette holders, filter paper, foam pads and lid with cables.
Criterion Cell (Bio-Rad)	Bio-Rad Laboratories	1656001
ECL (enhanced chemiluminescence)	Bio-Rad Laboratories	1705062	Product name: Clarity Max Western ECL Substrate.
Electrophoresis buffer 1x Tris Glycine SDS (TGS)	Bio-Rad Laboratories	1610772	Dilute 10x TGS 1 in 10 with ultra-pure H2O.
Filter paper, 0.34 mm thick	Whatmann	3030917	Bulk size 3 MM, pack 100 sheets, 315 x 335 mm.
Fine tissue dissecting forceps	Dumont	F6521-1EA	Jeweller’s forceps no. 5.
Flat plastic tray/lid	N/A	N/A	Large enough to place the membrane on. Ensure the surface is completely flat.
Freeze-drying System	Labconco	7750030	Freezone 4.5 L with glass chamber sample stage.
Freezer -80 oC	N/A	N/A	Any freezer with a constant temperature of -80 °C is suitable.
Gel releasers	1653320	Bio-Rad	Slide under the membrane to gather or move the membrane.
Grey lead pencil	N/A	N/A
Image lab software	Bio-Rad Laboratories	N/A	Figures refers to software version 5.2.1 but other versions can used.
Incubator	Bio-Rad Laboratories	1660521	Any incubator that can be set to 37 °C would suffice.
Lamp	N/A	N/A
Magnetic stirrer with flea	N/A	N/A
Membrane roller	Bio-Rad Laboratories	1651279	Can be purchased in the Transfer bundle pack. However, if this product is not available, any smooth surface cylindrical tube long enough to roll over the membrane would suffice.
Microcentrifuge tubes  (0.6 mL)	N/A	N/A
Mouse IgG HRP secondary	Thermo Fisher Scientific	31430	Goat anti-Mouse IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilute at 1 in 20,000 in blocking buffer.
Mouse IgM HRP secondary	Abcam	ab97230	Goat Anti-Mouse IgM mu chain. Use at the same dilution as mouse IgG.
Myosin Heavy Chain I (MHCI) primary antibody	DSHB	A4.840	Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.
Myosin Heavy Chain IIa (MHCIIa) primary antibody	DSHB	A4.74	Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.
Myosin Heavy Chain IIx (MHCIIx) primary antibody	DSHB	6H1	Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.
Nitrocellulose Membrane 0.45 µm	Bio-Rad Laboratories	1620115	For Western blotting.
Petri dish lid	N/A	N/A
Plastic tweezers	N/A	N/A
Power Pack	Bio-Rad Laboratories	164-5050	Product name: Basic power supply.
Protein ladder	Thermo Fisher Scientific	26616	PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa.
PVDF Membrane 0.2 µm	Bio-Rad Laboratories	1620177
Rabbit HRP secondary	Thermo Fisher Scientific	31460	Goat anti-Rabbit IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilution same as mouse secondary antibodies.
Rocker	N/A	N/A
Ruler	N/A	N/A
Scissors	N/A	N/A
Stereomicroscope	Motic	SMZ-168
Stripping buffer	Thermo Fisher Scientific	21059	Product name: Restore Western Blot Stripping Buffer.
Tissue (lint free)	Kimberly-Clark professional	34120	Product name: Kimwipe.
Transfer buffer (1x Tris Glycine buffer (TG), 20% Methanol)	TG: Bio-Rad Laboratories   Methanol: Merck	TG buffer: 1610771           Methanol: 1.06018	dilute 10x TG buffer with ultra-pure H2O to 1x. Add 100% Methanol to a final concentration of 20% Methanol. Store at 4 °C.
Transfer tray	Bio-Rad Laboratories	1704089
UV-activation precast gel	Bio-Rad Laboratories	5678085	Gel type: 4–15% Criterion TGX Stain-Free Protein Gel, 26 well, 15 µL.
Vortex	N/A	N/A
Wash buffer (1x TBST)	10x TBS: Astral Scientific  Tween 20: Sigma	BIOA0027-4L	1x TBST recipe: 10x Tris-buffered saline (TBS) is diluted down to 1x with ultra-pure H2O, Tween 20 is added to a final concentration of 0.1%. Store buffer at 4 °C.
Wash containers	Sistema	Store bought	Any tupperware container, that suits the approximate dimensions of the membrane would suffice.