İnsan İskelet Kasının Lif Tipi Tanımlaması

Özet

Bu protokol, dondurularak kurutulmuş insan iskelet kasından tek lif izolasyonunu ve nokta lekeleme tekniği kullanılarak Miyozin ağır zincir (MHC) izoformuna göre lif tipi sınıflandırmayı gösterir. Tanımlanan MHC I ve II lif örnekleri daha sonra western blotlama kullanılarak protein ekspresyonunda lif tipine özgü farklılıklar için daha fazla analiz edilebilir.

Özet

Burada tarif edilen teknik, nokta lekeleme kullanılarak bireysel kas liflerinin segmentlerinde spesifik miyozin ağır zincir (MHC) izoformlarını tanımlamak için kullanılabilir, bundan sonra kas lifi tipinin (MyDoBID) IDgirişi için Dot Blotting tarafından osinağır zincir tespitim olarak anılacaktır. Bu protokol, insan iskelet kasının dondurularak kurutulması ve tek kas liflerinin segmentlerinin izole edilmesi sürecini açıklar. MyDoBID kullanılarak, tip I ve II fiberler sırasıyla MHCI ve IIa'ya özgü antikorlarla sınıflandırılır. Sınıflandırılmış lifler daha sonra her biyopsi için lif tipine özgü örneklerde birleştirilir.

Her numunedeki toplam protein, Sodyum Dodesil-Sülfat Poliakrilamid Jel Elektroforezi (SDS-PAGE) ve UV ile aktive olan jel teknolojisi ile belirlenir. Numunelerin lif tipi, western blotlama kullanılarak doğrulanır. Birden fazla batı lekesinde hedef protein tespitini geliştirmek için protein yükleme normalizasyonu gerçekleştirmenin önemi de açıklanmaktadır. Sınıflandırılmış elyafları, tek lifli western blotlara kıyasla elyaf tipine özgü numuneler halinde birleştirmenin faydaları arasında numune çok yönlülüğü, artan numune verimi, daha kısa süreli yatırım ve maliyet tasarrufu önlemleri yer alırken, homojenize kas numuneleri kullanılarak sıklıkla gözden kaçan elyaf tipine özgü değerli bilgiler korunur. Protokolün amacı, dondurularak kurutulmuş insan iskelet kası örneklerinden izole edilen tip I ve tip II liflerin doğru ve verimli bir şekilde tanımlanmasını sağlamaktır.

Bu münferit lifler daha sonra tip I ve tip II lif tipine özgü numuneler oluşturmak için birleştirilir. Ayrıca, protokol, batı blotlama ile IIx lifleri olarak doğrulanan MHCI ve MHCIIa için negatif olan lifler için bir belirteç olarak Aktin kullanılarak tip IIx liflerin tanımlanmasını içerecek şekilde genişletilmiştir. Her lif tipine özgü numune daha sonra batı blotlama teknikleri kullanılarak çeşitli hedef proteinlerin ekspresyonunu ölçmek için kullanılır.

Giriş

İskelet kası, hücrenin (lif) yavaş seğirme (tip I) veya hızlı seğirme (tip II) olmasına bağlı olarak farklı hücresel, metabolik ve kasılma özelliklerine sahip heterojen bir dokudur. Lif tipi, kasılma süresi, kısalma hızı ve yorulma direnci¹ dahil olmak üzere çeşitli şekillerde birbirinden farklı olan miyozin ağır zincir (MHC) izoformları incelenerek tanımlanabilir. Başlıca MHC izoformları arasında tip I, tip IIa, tip IIb ve tip IIx bulunur ve metabolik profilleri oksidatif (tip I ve IIa) veya glikolitiktir (IIx, IIb)¹. Bu lif tiplerinin oranı kas tipine göre ve türler arasında farklılık gösterir. Tip IIb, kemirgen kasında yaygın olarak bulunur. İnsan kasları herhangi bir tip IIb lifi içermez ve ağırlıklı olarak MHC izoformları tip I ve IIa liflerinden oluşur ve az miktarda IIx lifleri² bulunur. Protein ekspresyon profilleri farklı lif türleri arasında değişir ve yaşlanma 3, egzersiz ^4,5 ve hastalık⁶ ile değiştirilebilir.

Farklı iskelet kası lifi tiplerinde hücresel yanıtların ölçülmesi, kas homojenatlarının (tüm lif tiplerinin bir karışımı) incelenmesi nedeniyle genellikle göz ardı edilir veya mümkün değildir. Tek lifli western blot, tek tek kas liflerinde birden fazla proteinin araştırılmasına izin verir⁷. Bu metodoloji daha önce homojenat preparatları kullanılarak elde edilmesi mümkün olmayan yeni ve bilgilendirici tek lifli özellikler üretmek için kullanılmıştır. Bununla birlikte, orijinal tek lifli western blot metodolojisinin, zaman alıcı doğası, numune kopyalarının üretilememesi ve pahalı, hassas gelişmiş kemilüminesans (ECL) reaktiflerinin kullanımı dahil olmak üzere bazı sınırlamaları vardır. Taze doku kullanılıyorsa, bu yöntem, sınırlı bir zaman dilimi içinde (yani 1-2 saat) tek tek lifleri izole etme ihtiyacının zaman kısıtlamaları nedeniyle daha da sınırlıdır. Neyse ki, bu kısıtlama, dondurularak kurutulmuş dokudan tek lifli segmentlerin izole edilmesiyle hafifletilir⁸. Bununla birlikte, dondurularak kurutulmuş örneklerden lif toplanması, biyopsi yapılan dokunun boyutu ve kalitesi ile sınırlıdır.

Nokta lekeleme yöntemi⁹ kullanılarak fiber tipi tanımlama, bu kapsamlı protokolde önemli ölçüde detaylandırılmış ve genişletilmiştir. Daha önce, dondurarak kurutma ve tek lifli MHC izoform protein analizi için ~ 2-10 mg kadar az ıslak ağırlık kas dokusunun yeterli olduğu gösterilmiştir⁹. Christensen ve ^ark.9, batı lekeleme ile doğrulanan nokta lekeleme ile mevcut MHC izoformunu tespit etmek için ~1 mm'lik bir lif segmentinin %30'unu kullandı. Bu çalışma, batı lekelemenin nokta lekeleme ile değiştirilmesiyle, toplam maliyetlerin ~ 40 kat azaldığını gösterdi (50 elyaf segmenti için). Lifler daha sonra tip I ve tip II numuneler halinde "toplandı", bu da deneysel replikasyona^{izin verdi 9}. Bununla birlikte, bir sınırlama, yalnızca iki lif tipine özgü numunenin elde edilmesiydi: tip I (MHCI pozitif) ve tip II (MHCII pozitif lifler), tip II numuneler ile MHCIIa ve MHCIIx ^6,10 karışımı içerir. Özellikle, mevcut protokol, saf tip IIx fiberlerin nasıl tanımlanabileceğini gösterir ve yaygın protokol sorunları için sorun giderme stratejileri de dahil olmak üzere oldukça ayrıntılı bir iş akışı (Şekil 1'de özetlenmiştir) sağlar.

Protokol

70-74 yaşları arasındaki n=3 (2 erkek, 1 kadın) yaşları arasında vastus lateralis'ten lokal anestezi (Ksilokain) ve manuel aspirasyon için modifiye edilmiş Bergstrom iğnesi kullanılarak insan kas örnekleri alındı^11,12. Örnekler, Victoria Üniversitesi İnsan Araştırmaları Etik Komitesi (HRETH11/221) tarafından onaylanan ve Helsinki^{Bildirgesi 13'e} uygun olarak yürütülen önceki bir çalışmanın alt kümesiydi. Katılımcılar bu çalışmaya katılmak için yazılı, bilgilendirilmiş onam verdiler. Bu protokol için gerekli olan tüm malzemelerin tüm detayları Malzeme Tablosunda gösterilmektedir. Ayrıca, yaygın protokol sorunlarını ele alan sorun giderme stratejilerinin bir listesi Tablo 1'de verilmiştir.

1. Dondurarak kurutma

1. Biyopsi yapılan kas örneklerini kuru buz üzerinde donmuş halde tutarken, boş bir donmuş tüpü tartın ve tartıda darasını alın.
2. En az 10 mg ıslak ağırlıkta donmuş dokuyu hızlı bir şekilde tartın. Ağırlığı bir ondalık basamağa kaydedin.
3. Dokuyu, kapağa 3-4 delik açılmış önceden soğutulmuş mikrosantrifüj tüpüne koyun ve 2-3 kuru buz topağı içeren küçük bir behere yerleştirin.
4. Dondurarak kurutucu üreticisinin kullanım talimatlarına uyun.
5. Dondurarak kurutucudaki tüm vanaların kapalı olduğundan emin olun ve dondurarak kurutucuyu açın.
6. Vakum ayar noktasının insan dokusu için optimum dondurarak kurutma koşulları, 0,12 milibar (mBar) için programlandığını kontrol etmek için kontrol panelini kullanın (Şekil 2).
7. Dondurarak kurutma makinesinin kılavuzuna basın ve hazne −40 ^oC'ye soğuyana kadar bekleyin.
8. Hazne bu sıcaklığa ulaştığında, kapağı, ardından cam hazneyi çıkarın ve kabı (kas örneği ile) metal tablaya yerleştirin.
9. Cam hazneyi ve kapağı değiştirin. Kapaktaki vakum tahliye vanasını kapatın ve kurutucunun vakumla kapatıldığından emin olmak için vakumlu terazi ışığı yeşile dönene kadar bekleyin.
10. Kas örneklerini 48 saat dondurarak kurutun. Dondurarak kurutma tamamlandıktan sonra, vakum düğmesine basarak vakum pompasını kapatın ve kapaktaki vakum tahliye vanasını açın.
11. Haznenin kapağını çıkarın ve dondurularak kurutulmuş numuneyi toplayın. Dokuyu tartın ve ağırlığı bir ondalık basamağa kaydedin.
12. Kilo kaybının yüzdesini hesaplayın; Ağırlıktaki ~%75 azalma, dokunun başarılı bir şekilde dondurularak kurutulduğunu gösterir (bu çalışmada, ortalama ± SD, %76 ± %9, n = 11 kas örneği).
13. Vakum pompasını ve dondurucuyu kapatmak için OTOMATİK'e basın. Ünitenin ortam sıcaklığına ulaşmasına izin verin.
14. Soğutma serpantinlerini üreticinin talimatlarına göre temizleyin ve biriken sıvıyı kollektörden boşaltın.
    NOT: Lif toplama işlemi hemen başlayabilir. Elyaf izolasyonu için doku kullanılmadığında, dondurularak kurutulmuş numuneyi -80 °C'de kurutucu boncuklarla kapalı bir kapta saklayın.  DİKKAT: Kuru buz tehlikelidir (Sınıf 9); önerilen güvenli kullanım için MSDS'ye bakın.

2. Lif toplama

1. Lif toplama hazırlığı
   1. En az 50 mikrofüj tüpünü (Fiber 1 ila 50) etiketleyin ve her tüpe 10 μL denatüre edici tampon pipetleyin.
   2. Toplama alanını iki çift ince doku diseksiyon forsepsi, tüy bırakmayan doku, bir tezgah üstü lamba, bir stereomikroskop (siyah sahne yukarıda), bir girdap ve bir tezgah üstü santrifüj ile hazırlayın.
   3. Dondurularak kurutulmuş kas örneğini bir Petri kabı kapağına yerleştirin. Kapağı diseksiyon mikroskobunun üzerine yerleştirin.
   4. Tek lifli diseksiyon videosunu izleyin. Bir çalışmaya başlamadan önce lif toplamadan tek lif tipi tanımlamaya kadar tüm protokolü en az iki kez uygulayın.
   5. Lif toplamadan önce, her biyopsiden lif tipi bir örnek için gereken toplam hacmi aşağıdaki gibi hesaplayın. Örneğin, 1 fiberin başlangıç hacmi = 10 μL ve MyDoBID'den sonra kalan hacim (1 fiber × 10 μL) - nokta lekeleme için kullanılan 1 μL = 9 μL (numune hacmi) ise, numune hacmini (μL) çalıştırılacak toplam western blot'ların sayısıyla çarparak gereken toplam numune hacmini hesaplayın ve fazlalığı hesaba katmak için bu miktarı ikiye katlayın: (9 μL × 4 batı lekesi) × 2 = 72 μL. Gerekli nihai numune hacmini (μL) elyaf tipine özgü numune başına numune hacmine bölerek tiplendirilen numune başına gereken elyaf sayısını hesaplayın (örneğin, elyaf tipine özgü numune başına 72 μL ÷ 9 μL = 8 elyaf). Bunun başarılması için toplam 50 lif toplayın.
      NOT: Yüklenen protein miktarı her numune için ~3 mm fibere (~12 μg ıslak ağırlık) eşdeğerse, gereken numune hacmi hem MyDoBID hem de western blotlamayı çalıştırmak için gereken minimum protein konsantrasyonudur (ayrıntılar için Ek Dosya 1'e bakın). Bununla birlikte, bu hacim, belirli bir protein için tekrar jellerin gerekli olup olmadığını etkilemez.  DİKKAT: Forseps keskindir; Cilt delinmesi riskini önlemek için bunları dikkatli kullanın.
2. Tek lif izolasyonu
   1. 5 cm x 1 cm'lik küçük bir kağıda, 1 cm'lik bir çizgi çizmek için bir cetvel kullanın. Bu çizgide her 1 mm'yi işaretleyin.
   2. Toplanan liflerin uzunluğunu tahmin etmek için bunu bir kılavuz olarak Petri kabı kapağının altına yerleştirin.
   3. Dondurularak kurutulmuş kas örneğini stereomikroskobun altına düşük büyütmede (x 7.5) yerleştirin. Dondurularak kurutulmuş kası yerinde tutmak için bir çift ince doku diseksiyon forseps kullanın ve diğeriyle küçük lif demetlerini ayırmaya başlayın (videoda görüldüğü gibi).
   4. Bir lif demetini izole edin ve tek lif segmentleri demetten izole edilene kadar ayırmaya devam edin.
   5. En az ~1 mm uzunluğunda en az 50 lif toplayın.
   6. Lifi Petri kabında boş bir alana taşıyın. Tek lifli segmentleri daha yüksek büyütme (x 50) altında inceleyin. Sonunda elyafı daha da ayırarak tek bir elyaf olduğundan emin olun. Lif ayrılmak yerine koparsa tek bir liftir.
3. Liflerin denatürasyonu
   1. Forseps kullanarak, lifi nazikçe toplayın ve doğrudan aliquoted denatüre edici tampona yerleştirin (forsepslerin tamponla karşılaşmasına izin vermeyin).
   2. Lifin başarıyla çıkarıldığından emin olmak için forsepsleri mikroskop altında kontrol edin. Tüpü kapatın ve fiberin tampona hareket etmesini sağlamak için tüpün altını tezgaha üç kez sıkıca vurun.
   3. Bir sonraki elyafa geçmeden önce forsepsleri tüy bırakmayan bir doku kullanarak silerek temizleyin. Tüm lifler toplanana kadar bu işlemi tekrarlayın.
   4. Lif numunelerini vorteksleyin ve numuneyi tüpün dibine çekmek için 2.500 × g'da 5 saniye boyunca kısaca santrifüjleyin.
      NOT: Santrifüj süresi (5 s), başlangıçtan (0 × g) hız ~2,500 × g'ye ulaşana kadar zamanlanır.
   5. Numuneleri oda sıcaklığında 1 saat bekletin. İleride kullanmak üzere -80 °C'de saklayın. Kullanmadan önce numuneleri dondurun ve ardından çözdürün.

3. Nokta lekeleme

1. Membran hazırlama ve aktivasyon
   1. 50 numuneye (~10,5 cm x 5,5 cm) sığacak şekilde bir poliviniliden diflorür (PVDF) membranı (0,2 μm gözenek boyutu) ölçün, etiketleyin ve boyutlandırın.
   2. Sol kenarlığı yukarıdan aşağıya sayısal olarak (1'den 10'a kadar) ve üst kenarlığı soldan sağa (A'dan E'ye) 1 cm aralıklarla alfabetik olarak işaretleyin.
   3. 12,5 cm x 7,5 cm boyutlarında dört yaprak filtre kağıdı hazırlayın.
   4. Bir yığın oluşturmak için iki sayfayı bir araya getirin. Filtre kağıdı yığınını 1x transfer tamponunda önceden ıslatın.
   5. Membranı bir kaba yerleştirin. Membranı tamamen daldırmak için yeterli hacimde (10-15 mL) membranın üzerine% 95 etanol dökün. Rocker'da 1 dakika çalkalayın.
   6. Etanolü geri toplayın, membranı 1x transfer tamponuna (~ 15 mL) daldırın ve 2 dakika daha sallayın.
      NOT: Hem etanol hem de transfer tamponu, sedimantasyon oluşana kadar (altı kullanımdan sonra değişir) gelecekteki nokta lekeleme deneyleri için yeniden kullanılabilir.
   7. Transfer tamponu ile ıslatılmış filtre kağıdı yığınını büyük bir kapak gibi düz, hareketli bir yüzeye yerleştirin ve silindirle düzleştirin. PVDF membranını bir jel ayırıcı veya cımbız kullanarak yığının üzerine yerleştirin.
   8. Membranın üzerine tek bir yaprak kuru filtre kağıdı yerleştirin ve membran yüzeyindeki fazla tamponu emmek için silindiri filtre kağıdının üzerinde hareket ettirin. Membranı ovalamadan üst filtre kağıdını çıkarın.
      DİKKAT: Metanol (Sınıf 3, alt risk 6.1) ve etanol (Sınıf 3) tehlikelidir. Güvenli kullanım önerileri için malzeme güvenlik veri sayfasına (MSDS) bakın.
2. Membrana numune absorpsiyonu
   1. Lif numunelerini çözdürün, adım 2.3.4'teki gibi oda sıcaklığında kısa bir santrifüj (5 sn) yapın ve numuneyi iyice karıştırın.
   2. Pipet ucuyla membrana dokunmadan, her bir numuneden ~1 μL'lik bir damlayı belirlenen alandaki membranın üzerine yavaşça bırakın. Lif numunesi başına belirlenen alanın boyutları ~1 cm x 1 cm'dir. Numuneyi bu alanın merkezinde tespit etmeyi hedefleyin.
   3. Numune damlacıklarının membrandan en az 15 dakika geçmesine izin verin. Numune tamponunun kalmadığından ve tamamen emildiğinden emin olun.
   4. Plastik cımbız kullanarak, membranı nemli filtre kağıdı yığınından dikkatlice kaldırın, tek bir kuru filtre kağıdına yerleştirin ve membranı en az 5 dakika kurutun.
   5. Numune lekeleri tamamen beyaza döndüğünde, zarı yeniden etkinleştirin.
3. Membran reaktivasyonu ve bloğu
   1. 3.1.5 ve 3.1.6 adımlarını tekrarlayarak membranı yeniden etkinleştirin.
   2. Membranı yıkama tamponuna yerleştirin ve sallayarak 5 dakika durulayın. Yıkama tamponunu atın.
   3. Sallanırken membranı 30 dakika boyunca bloke edici tamponda inkübe edin.
   4. Tampon artık bulanık olmayana kadar membranı 3x yıkama tamponu ile durulayın.
   5. Membranı külbütördeki son yıkamada bırakın.

4. İmmün etiketleme

1. MHCIIa'nın Tespiti
   1. MHCIIa primer antikorunu 10 mL Sığır Serum Albümini (BSA) tamponunda 200'de 1 oranında seyreltin.
   2. Yıkama tamponunu membrandan atın ve ardından seyreltilmiş MHCIIa antikorunu membranın üzerine dökün.
   3. Kabı (membran MHCIIa'da olacak şekilde) 2 saat oda sıcaklığında veya gece boyunca 4 °C'de külbütöre yerleştirin.
   4. MHCIIa antikorunu hatırlayın ve 4 ° C'de saklayın. Membranı külbütör üzerinde 2 dakika boyunca bloke edici tamponla yıkayın.
      NOT: Tüm primer antikorlar, tampon temiz kaldığı sürece beş kata kadar tekrar kullanılabilir.
   5. İki kez daha durulayın; Her seferinde 5 dakika; toplamda üç yıkama.
   6. Fare İmmünoglobulin G Yaban turpu Peroksidaz (IgG-HRP) sekonder antikorunu 10 mL bloke edici tamponda 20.000'de 1'de seyreltin ve membrana ekleyin.
   7. Yıkama tamponunu atın ve membranı fare IgG-HRP sekonder içinde 1 saat sallanarak inkübe edin.
   8. İkincil olanı atın ve membranı yıkama tamponunda yıkayın (2, 5, 5 dakika).
   9. Görüntüleme için hazır olana kadar membranı son yıkamada bekletin.
   10. Jel görüntüleyiciyi açın, görüntüleyicinin gerekli çalışma sıcaklığına ulaşması için 15 dakika bekleyin ve ardından görüntüleme yazılımını açın (bkz.
   11. Yazılım penceresinde Yeni Tek Kanal Protokolü'ne tıklayın (Şekil 3A). Membranın beyaz ışıklı görüntüsü için, Uygulamalar | Lekeler | Kolorimetrik'e tıklayın (Şekil 3B).
   12. Jel alanına tıklayın; Her seçenek, çeşitli jel türlerinin boyutuna uyacak şekilde belirli boyutlar için programlanmıştır. Membranın boyutlarına en uygun seçeneği seçin (Şekil 3C).
   13. Luminol ve peroksidaz reaktiflerini 1:1 oranında birleştirerek ECL'yi hazırlayın. Tüm membranı kaplamak için yeterli hacimde ECL karışımı yapın, tipik olarak toplam 800-1.000 μL hacim gereklidir.
   14. Membranı büyük, şeffaf plastik bir tepsiye yerleştirin ve ECL karışımını membranın üzerine dağıtın.
   15. Membranı görüntüleme plakasına yerleştirin.
   16. Canlı kamera görüntüsü için Position Gel'e (sarı düğme) tıklayın. Membranın görüntüleme alanını en üst düzeye çıkarmak için yakınlaştırma düğmesine tıklayın, basılı tutun ve sürükleyin. Bu noktada, gerekirse zarın konumunu düzeltin.
   17. Protokolü Çalıştır'a (yeşil düğme) tıklayın ve membranın kolorimetrik görüntüsünün üretilmesini bekleyin. Noktaları ilgili lif örneğiyle eşleştirmeye yardımcı olması için bu görüntüyü kaydedin.
   18. Membranı hareket ettirmeden, 2 x 2 gruplama (Chemi Yüksek Çözünürlük) seçeneğine tıklayarak yazılımdaki uygulamayı değiştirin (Şekil 3D).
   19. Görüntü pozlaması ve yazılım altında, pozlama süresini optimize edin, Soluk Bantlar (Şekil 3E) | Sinyal Biriktirme Modu.
   20. Kurulum altında, ilk görüntü için 1 sn, son görüntü için 30 sn ve toplam 30 görüntü yazın (Şekil 3F).
   21. Protokolü Çalıştır'a tıklayın.
   22. Bir görüntüyü şu aşamalarda kaydedin: sinyal doygunluğundan önce (tüm görünür noktalar siyahtır), ilk sinyal doygunluğu (bazı noktalar doymaya başlar) ve aşırı doygun noktalar (güçlü sinyal algılanan tüm noktalar doygundur).
   23. Sinyal birikimini sonlandırmadan önce gerekli tüm görüntüleri kaydedin. Membranı görüntüleyiciden çıkarın.
   24. Jel ayırıcıyı kullanarak, membranı yıkama tamponu ile kaba geri yerleştirin.
2. MHCI'nin Tespiti
   1. Yıkama tamponunu dökün ve membrana 37 °C'de 30 dakika sıyırma tamponu uygulayın (membranın tamamen daldırıldığından emin olun).
   2. Sıyırma tamponunu geri toplayın ve membranı 5 dakika boyunca sallayarak yıkama tamponunda durulayın.
      NOT: Sıyırma tamponu, atılmadan önce 10 kez tekrar kullanılabilir.
   3. Yıkama tamponunu dökün ve bu sefer 200'de 1'lik bir başlangıç konsantrasyonunda seyreltilmiş MHCI primer antikoru uygulayın (aralık: 200'de 1 ila 500'de 1). Membranı oda sıcaklığında 1 saat sallayın.
   4. MHCI primer antikorunda inkübe edildikten sonra, antikoru geri toplayın ve membranı adım 4.1.4 ve 4.1.5'teki gibi yıkayın.
   5. Fare IgM HRP sekonder antikorunu bloke edici tamponda 20.000'de 1 oranında seyreltin. Bloke edici tamponu membrandan boşaltın ve adım 4.1.7'deki gibi ikincil fare IgM'sinde inkübe edin.
   6. Yıkama ve görüntü yakalama, 4.1.8 ila 4.1.24 adımlarında olduğu gibi MHCI algıladı.
      DİKKAT: Sıyırma tamponu %3-5 Organo Fosfin içerir (Sınıf 8). Güvenli kullanım önerileri için MSDS'ye bakın.
3. Aktin kullanılarak potansiyel MHCIIx'in tespiti
   1. Membranı bir kez daha soyun (adım 4.2.1 ve 4.2.2).
   2. Bölüm 4.1'i tekrarlayın, bu sefer BSA tamponunda 500'de 1'de seyreltilmiş Aktin primer antikoru ve daha sonra bloke edici tamponda 20.000'de 1'de seyreltilmiş tavşan HRP sekonder antikoru uygulayın.

5. Elyaf tipi tanımlama

1. MHCI, MHCIIa ve Aktin sinyal analizi
   1. Sinyal yoğunluğu panelini tanıyın (Şekil 4A). 5.1.2 ile 5.1.4 arasındaki adımları not edin.
   2. Doymuş bir sinyal yoğunluğu, kalitatif olarak protein tespitinin güçlü olduğunu gösterir.
   3. Orta, hedef proteinin orta seviyede mevcut olduğunu gösterir.
   4. Zayıf bir sinyal, çok az hedef proteinin mevcut olduğunu gösterir.
   5. Fiberleri 'doymuş', 'orta' veya 'zayıf' sinyal yoğunluğuna sahip kategorilere ayırmak için sinyal yoğunluğu panelini kullanın (Şekil 4A).
   6. Önce MHCIIa ve MHCI sonuçlarını karşılaştırarak lif tipi tanımlaması yapın (Şekil 4B, sol ve orta lekeler).
   7. Yalnızca bir MHC izoformunun doymuş veya orta sinyal yoğunluğuna sahip lifleri kaydedin.
   8. MHC izoform sinyali 'zayıf' ise, fiberi işaretsiz bırakın (bkz. Şekil 4B).
   9. Son olarak, MHCI veya IIa tespit edilmeyen liflerde Aktin gözlendiğinde (orta veya doymuş sinyal yoğunluğu), bunu potansiyel bir tip IIx lifi olarak kaydedin (Şekil 4B, sağ leke).
   10. Zayıf MHC izoform sinyaline sahip lifleri kaydedin, ancak Aktin tanımlanamayan olarak algılandı (orta veya doymuş yoğunlukta).
   11. Her üç hedef protein için de zayıf veya hiç tespit edilmemiş (lif toplanmamış) numuneleri atın (Şekil 4C).
   12. Hem MHCI hem de MHCII sinyallerinin 'doymuş' veya orta düzeyde bir sinyalle algılandığı herhangi bir fiberi kaydedin. Bu numuneler, elyaf tipine özgü preparasyonda kullanım için değildir.
2. Elyaf tipine özel numunelerin hazırlanması
   1. Her biyopsi için ayrı bir tip I ve tip II numune hazırlayın. Tip II numune için, MHCIIa'nın doymuş veya orta seviyelerde tespit edildiği gerekli minimum lif sayısını (adım 2.1.5'te hesaplanmıştır) birleştirin.
   2. Tip I olarak etiketlenmiş ayrı bir tüpte, MHCI'nin tespit edildiği lifler için bu işlemi tekrarlayın (Şekil 4D).
   3. Doymuş sinyallere sahip yeterli fiber yoksa, orta sinyal yoğunluğuna sahip fiberler kullanın.
   4. Herhangi bir potansiyel IIx fiberini birleştirin.
   5. Western blotlama için hemen elyaf tipine özel numuneler kullanın veya ileride kullanmak üzere -80 °C'de saklayın.

6. Western blot fiber tipi onayı

1. Her bir elyaf tipine özgü numuneden 10 μL kullanın (gereken minimum numune hacmi, bkz. adım 2.1.5).
2. Belirtilen prekast jeli kullanarak numuneleri, üreticinin protokolüne göre SDS-PAGE aracılığıyla ayırın.
3. Jeldeki proteini üreticinin protokolüne göre tespit etmek için bir jel görüntüleyici kullanın.
4. Jeli 10 dakika boyunca soğuk 1x transfer tamponuna yerleştirin.
5. Proteinleri, üreticinin protokolüne göre 0,45 μm nitroselüloz membrana (9,5 cm x 13,5 cm) ıslak olarak aktarın.
6. Transferden sonra, membranı bir kapta ultra saf H₂O ile kısaca durulayın. Ultra saf suyu dökün.
7. Membrana 10 mL antikor sinyal arttırıcı solüsyon ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca çalkalayın.
8. Antikor sinyal arttırıcı solüsyonu geri toplayın ve ultra saf_H2Oile 5x (yıkama başına 5 s) yıkayın.
   NOT: Antikor sinyal arttırıcı solüsyon, atılmadan önce 5 kez kullanılabilir.
9. Son yıkamayı dökün, bloke edici solüsyon ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat çalkalayın.
10. 180 kDa ve üzeri proteinlerin zarın üst kısmında olmasını sağlayan moleküler ağırlıkta zarı yatay olarak kesmek için temiz bir neşter bıçağı veya makas kullanın.
11. Daha fazla fiber tipi onayı için bu üst bölümü kullanın.
12. Farklı hedef proteinleri tespit etmek için 180 kDa'nın altındaki kısmı kullanın.
13. Membranın üst kısmında, MHCIIx primer ve fare İmmünoglobulin M (IgM) HRP sekonder antikoru ile bölüm 4.1'i takip edin.
14. İşlemi MHCIIa IgG primer ve fare IgG HRP sekonder antikoru ile tekrarlamadan önce membranı (bölüm 4.2.1 ve 4.2.2'de açıklandığı gibi) soyun.
15. Bir kez daha soyun ve son olarak MHCI IgM primer ve fare IgM HRP sekonder antikoru uygulayın.
    NOT: Bu adım kalitatiftir ve bu nedenle membran sıyırma nedeniyle herhangi bir protein kaybı endişe verici değildir.
16. Farklı MHC izoformlarında tespit edilen sinyali karşılaştırın ( Şekil 5B'de görüldüğü gibi). Beklenen numunede (MHCI - tip I, MHCIIa - tip II ve MHCIIx - tip IIx) sinyal yoğunluğu orta ila doymuş seviyelerde tespit edildiğinde, fiber tipine özgü numuneler gelecekteki çalışmalarda kullanılmak üzere güvenilir olarak kaydedilecektir.
17. Bir numunede birden fazla MHC izoformu eşit olarak tespit edildiğinde numuneyi güvenilmez olarak kaydedin.
    DİKKAT: Antikor arttırıcı solüsyon %50 sodyum hidroksit içerir. Güvenli kullanım önerileri için MSDS'ye bakın.

Sonuçlar

Nokta lekeleme kullanılarak bireysel MHCI, MHCIIa ve MHCIIx kas liflerinin tanımlanması
MyDoBID'in bir özelliği, belirli bir fiberde değişen MHC ve Aktin sinyal yoğunluğu gücünün kategorize edilmesidir (Şekil 4A). Lif tipi, MHCI ve IIa izoformlarının varlığı veya yokluğu ile tanımlandı (Şekil 4B). Altı lif, MHC veya aktin tespiti göstermedi, bu da lif toplanmadığını gösterdi. Bu spesifik nokta lekesinin sonuçlar?...

Tartışmalar

Lif toplama
Birkaç yıllık deneyime dayanarak, çoğu araştırmacı bu teknikte ustalaşabilir; Bununla birlikte, uygulama, sonraki analizler için daha hızlı ve daha verimli lif toplamaya yol açar. Havuzlama kalitesinde 30 tek elyaf segmentini izole edebilmek için, numune başına 50 elyaf segmentinin toplanması önerilir. Makul bir standarda ulaşmak için lif toplama videosunu dikkatlice incelemek ve iki uygulama seansı (seans başına ~ 50 lif) gerçekleştirdikten sonra önerilir. Toplan...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x Denaturing buffer	Make according to recipe	Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributing companies	1x denaturing buffer is made by diluting 3x denaturing buffer 1 in 3 v/v with 1X Tris-HCl (pH 6.8). Store at -20 °C.
3x Denaturing buffer	Make according to recipe	Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributors	3x denaturing buffer contains: 0.125M Tris-HCI, 10% glycerol, 4% SDS, 4 M urea, 10% 2-mercaptoethanol, and 0.001% bromophenol blue, pH 6.8.  Store at -20 °C.
95% Ethanol	N/A	100% ethanol can be sourced from any company	Diluted to 95% with ultra-pure H2O.
Actin rabbit polyclonal antibody	Sigma-Aldrich	A2066	Dilute 1 in 1,000 with BSA buffer.
Analytical scales	Mettler Toledo	Model number: MSZ042101
Antibody enhancer	Thermo Fischer Scientific	32110	Product name is Miser Antibody Extender Solution NC.
Beaker (100 mL)	N/A	N/A
Benchtop centrifuge	Eppendorf	5452	Model name: Mini Spin.
Blocking buffer: 5% Skim milk in Wash buffer.	Diploma	Store bought
BSA buffer: 1 % BSA/PBST, 0.02 % NaN3	BSA: Sigma-Aldrich              PBS: Bio-Rad Laboratories. NaN3 : Sigma-Aldrich	BSA: A6003-25G                         10x PBS: 1610780                       NaN3: S2002	Bovine serum albumin (BSA), Phosphate-buffered saline (PBS), and Sodium azide (NaN3). Store at 4 °C.
Cassette opening lever	Bio-Rad Laboratories	4560000	Used to open the precast gel cassettes.
Chemidoc MP Imager	Bio-Rad Laboratories	Model number: Universal hood III	Any imaging system with Stain-Free gel imaging capabilities.
Criterion blotter	Bio-Rad Laboratories	1704070	Includes ice pack, transfer tray, roller, 2 cassette holders, filter paper, foam pads and lid with cables.
Criterion Cell (Bio-Rad)	Bio-Rad Laboratories	1656001
ECL (enhanced chemiluminescence)	Bio-Rad Laboratories	1705062	Product name: Clarity Max Western ECL Substrate.
Electrophoresis buffer 1x Tris Glycine SDS (TGS)	Bio-Rad Laboratories	1610772	Dilute 10x TGS 1 in 10 with ultra-pure H2O.
Filter paper, 0.34 mm thick	Whatmann	3030917	Bulk size 3 MM, pack 100 sheets, 315 x 335 mm.
Fine tissue dissecting forceps	Dumont	F6521-1EA	Jeweller’s forceps no. 5.
Flat plastic tray/lid	N/A	N/A	Large enough to place the membrane on. Ensure the surface is completely flat.
Freeze-drying System	Labconco	7750030	Freezone 4.5 L with glass chamber sample stage.
Freezer -80 oC	N/A	N/A	Any freezer with a constant temperature of -80 °C is suitable.
Gel releasers	1653320	Bio-Rad	Slide under the membrane to gather or move the membrane.
Grey lead pencil	N/A	N/A
Image lab software	Bio-Rad Laboratories	N/A	Figures refers to software version 5.2.1 but other versions can used.
Incubator	Bio-Rad Laboratories	1660521	Any incubator that can be set to 37 °C would suffice.
Lamp	N/A	N/A
Magnetic stirrer with flea	N/A	N/A
Membrane roller	Bio-Rad Laboratories	1651279	Can be purchased in the Transfer bundle pack. However, if this product is not available, any smooth surface cylindrical tube long enough to roll over the membrane would suffice.
Microcentrifuge tubes  (0.6 mL)	N/A	N/A
Mouse IgG HRP secondary	Thermo Fisher Scientific	31430	Goat anti-Mouse IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilute at 1 in 20,000 in blocking buffer.
Mouse IgM HRP secondary	Abcam	ab97230	Goat Anti-Mouse IgM mu chain. Use at the same dilution as mouse IgG.
Myosin Heavy Chain I (MHCI) primary antibody	DSHB	A4.840	Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.
Myosin Heavy Chain IIa (MHCIIa) primary antibody	DSHB	A4.74	Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.
Myosin Heavy Chain IIx (MHCIIx) primary antibody	DSHB	6H1	Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.
Nitrocellulose Membrane 0.45 µm	Bio-Rad Laboratories	1620115	For Western blotting.
Petri dish lid	N/A	N/A
Plastic tweezers	N/A	N/A
Power Pack	Bio-Rad Laboratories	164-5050	Product name: Basic power supply.
Protein ladder	Thermo Fisher Scientific	26616	PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa.
PVDF Membrane 0.2 µm	Bio-Rad Laboratories	1620177
Rabbit HRP secondary	Thermo Fisher Scientific	31460	Goat anti-Rabbit IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilution same as mouse secondary antibodies.
Rocker	N/A	N/A
Ruler	N/A	N/A
Scissors	N/A	N/A
Stereomicroscope	Motic	SMZ-168
Stripping buffer	Thermo Fisher Scientific	21059	Product name: Restore Western Blot Stripping Buffer.
Tissue (lint free)	Kimberly-Clark professional	34120	Product name: Kimwipe.
Transfer buffer (1x Tris Glycine buffer (TG), 20% Methanol)	TG: Bio-Rad Laboratories   Methanol: Merck	TG buffer: 1610771           Methanol: 1.06018	dilute 10x TG buffer with ultra-pure H2O to 1x. Add 100% Methanol to a final concentration of 20% Methanol. Store at 4 °C.
Transfer tray	Bio-Rad Laboratories	1704089
UV-activation precast gel	Bio-Rad Laboratories	5678085	Gel type: 4–15% Criterion TGX Stain-Free Protein Gel, 26 well, 15 µL.
Vortex	N/A	N/A
Wash buffer (1x TBST)	10x TBS: Astral Scientific  Tween 20: Sigma	BIOA0027-4L	1x TBST recipe: 10x Tris-buffered saline (TBS) is diluted down to 1x with ultra-pure H2O, Tween 20 is added to a final concentration of 0.1%. Store buffer at 4 °C.
Wash containers	Sistema	Store bought	Any tupperware container, that suits the approximate dimensions of the membrane would suffice.