İnsan İskelet Kasının Lif Tipi Tanımlaması

Özet

Bu protokol, dondurularak kurutulmuş insan iskelet kasından tek lif izolasyonunu ve nokta lekeleme tekniği kullanılarak Miyozin ağır zincir (MHC) izoformuna göre lif tipi sınıflandırmayı gösterir. Tanımlanan MHC I ve II lif örnekleri daha sonra western blotlama kullanılarak protein ekspresyonunda lif tipine özgü farklılıklar için daha fazla analiz edilebilir.

Özet

Burada tarif edilen teknik, nokta lekeleme kullanılarak bireysel kas liflerinin segmentlerinde spesifik miyozin ağır zincir (MHC) izoformlarını tanımlamak için kullanılabilir, bundan sonra kas lifi tipinin (MyDoBID) IDgirişi için Dot Blotting tarafından osinağır zincir tespitim olarak anılacaktır. Bu protokol, insan iskelet kasının dondurularak kurutulması ve tek kas liflerinin segmentlerinin izole edilmesi sürecini açıklar. MyDoBID kullanılarak, tip I ve II fiberler sırasıyla MHCI ve IIa'ya özgü antikorlarla sınıflandırılır. Sınıflandırılmış lifler daha sonra her biyopsi için lif tipine özgü örneklerde birleştirilir.

Her numunedeki toplam protein, Sodyum Dodesil-Sülfat Poliakrilamid Jel Elektroforezi (SDS-PAGE) ve UV ile aktive olan jel teknolojisi ile belirlenir. Numunelerin lif tipi, western blotlama kullanılarak doğrulanır. Birden fazla batı lekesinde hedef protein tespitini geliştirmek için protein yükleme normalizasyonu gerçekleştirmenin önemi de açıklanmaktadır. Sınıflandırılmış elyafları, tek lifli western blotlara kıyasla elyaf tipine özgü numuneler halinde birleştirmenin faydaları arasında numune çok yönlülüğü, artan numune verimi, daha kısa süreli yatırım ve maliyet tasarrufu önlemleri yer alırken, homojenize kas numuneleri kullanılarak sıklıkla gözden kaçan elyaf tipine özgü değerli bilgiler korunur. Protokolün amacı, dondurularak kurutulmuş insan iskelet kası örneklerinden izole edilen tip I ve tip II liflerin doğru ve verimli bir şekilde tanımlanmasını sağlamaktır.

Bu münferit lifler daha sonra tip I ve tip II lif tipine özgü numuneler oluşturmak için birleştirilir. Ayrıca, protokol, batı blotlama ile IIx lifleri olarak doğrulanan MHCI ve MHCIIa için negatif olan lifler için bir belirteç olarak Aktin kullanılarak tip IIx liflerin tanımlanmasını içerecek şekilde genişletilmiştir. Her lif tipine özgü numune daha sonra batı blotlama teknikleri kullanılarak çeşitli hedef proteinlerin ekspresyonunu ölçmek için kullanılır.

Giriş

İskelet kası, hücrenin (lif) yavaş seğirme (tip I) veya hızlı seğirme (tip II) olmasına bağlı olarak farklı hücresel, metabolik ve kasılma özelliklerine sahip heterojen bir dokudur. Lif tipi, kasılma süresi, kısalma hızı ve yorulma direnci¹ dahil olmak üzere çeşitli şekillerde birbirinden farklı olan miyozin ağır zincir (MHC) izoformları incelenerek tanımlanabilir. Başlıca MHC izoformları arasında tip I, tip IIa, tip IIb ve tip IIx bulunur ve metabolik profilleri oksidatif (tip I ve IIa) veya glikolitiktir (IIx, IIb)¹. Bu lif tiplerinin oranı kas tipine göre ve türler arasında farklılık gösterir. Tip IIb, kemirgen kasınd....

Protokol

70-74 yaşları arasındaki n=3 (2 erkek, 1 kadın) yaşları arasında vastus lateralis'ten lokal anestezi (Ksilokain) ve manuel aspirasyon için modifiye edilmiş Bergstrom iğnesi kullanılarak insan kas örnekleri alındı^11,12. Örnekler, Victoria Üniversitesi İnsan Araştırmaları Etik Komitesi (HRETH11/221) tarafından onaylanan ve Helsinki^{Bildirgesi 13'e} uygun olarak yürütülen önceki bir çalışmanın alt kümesiydi. Katılımcılar bu çalışmaya katılmak için yazılı, bilgilendirilmiş onam verdiler. Bu protokol için gerekli olan tüm malzemelerin tüm detayları Malzeme Tablosunda ....

Tartışmalar

Lif toplama
Birkaç yıllık deneyime dayanarak, çoğu araştırmacı bu teknikte ustalaşabilir; Bununla birlikte, uygulama, sonraki analizler için daha hızlı ve daha verimli lif toplamaya yol açar. Havuzlama kalitesinde 30 tek elyaf segmentini izole edebilmek için, numune başına 50 elyaf segmentinin toplanması önerilir. Makul bir standarda ulaşmak için lif toplama videosunu dikkatlice incelemek ve iki uygulama seansı (seans başına ~ 50 lif) gerçekleştirdikten sonra önerilir. Toplan.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x Denaturing buffer	Make according to recipe	Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributing companies	1x denaturing buffer is made by diluting 3x denaturing buffer 1 in 3 v/v with 1X Tris-HCl (pH 6.8). Store at -20 °C.
3x Denaturing buffer	Make according to recipe	Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributors	3x denaturing buffer contains: 0.125M Tris-HCI, 10% glycerol, 4% SDS, 4 M urea, 10% 2-mercaptoethanol, and 0.001% bromophenol blue, pH 6.8.  Store at -20 °C.
95% Ethanol	N/A	100% ethanol can be sourced from any company	Diluted to 95% with ultra-pure H2O.
Actin rabbit polyclonal antibody	Sigma-Aldrich	A2066	Dilute 1 in 1,000 with BSA buffer.
Analytical scales	Mettler Toledo	Model number: MSZ042101
Antibody enhancer	Thermo Fischer Scientific	32110	Product name is Miser Antibody Extender Solution NC.
Beaker (100 mL)	N/A	N/A
Benchtop centrifuge	Eppendorf	5452	Model name: Mini Spin.
Blocking buffer: 5% Skim milk in Wash buffer.	Diploma	Store bought
BSA buffer: 1 % BSA/PBST, 0.02 % NaN3	BSA: Sigma-Aldrich              PBS: Bio-Rad Laboratories. NaN3 : Sigma-Aldrich	BSA: A6003-25G                         10x PBS: 1610780                       NaN3: S2002	Bovine serum albumin (BSA), Phosphate-buffered saline (PBS), and Sodium azide (NaN3). Store at 4 °C.
Cassette opening lever	Bio-Rad Laboratories	4560000	Used to open the precast gel cassettes.
Chemidoc MP Imager	Bio-Rad Laboratories	Model number: Universal hood III	Any imaging system with Stain-Free gel imaging capabilities.
Criterion blotter	Bio-Rad Laboratories	1704070	Includes ice pack, transfer tray, roller, 2 cassette holders, filter paper, foam pads and lid with cables.
Criterion Cell (Bio-Rad)	Bio-Rad Laboratories	1656001
ECL (enhanced chemiluminescence)	Bio-Rad Laboratories	1705062	Product name: Clarity Max Western ECL Substrate.
Electrophoresis buffer 1x Tris Glycine SDS (TGS)	Bio-Rad Laboratories	1610772	Dilute 10x TGS 1 in 10 with ultra-pure H2O.
Filter paper, 0.34 mm thick	Whatmann	3030917	Bulk size 3 MM, pack 100 sheets, 315 x 335 mm.
Fine tissue dissecting forceps	Dumont	F6521-1EA	Jeweller’s forceps no. 5.
Flat plastic tray/lid	N/A	N/A	Large enough to place the membrane on. Ensure the surface is completely flat.
Freeze-drying System	Labconco	7750030	Freezone 4.5 L with glass chamber sample stage.
Freezer -80 oC	N/A	N/A	Any freezer with a constant temperature of -80 °C is suitable.
Gel releasers	1653320	Bio-Rad	Slide under the membrane to gather or move the membrane.
Grey lead pencil	N/A	N/A
Image lab software	Bio-Rad Laboratories	N/A	Figures refers to software version 5.2.1 but other versions can used.
Incubator	Bio-Rad Laboratories	1660521	Any incubator that can be set to 37 °C would suffice.
Lamp	N/A	N/A
Magnetic stirrer with flea	N/A	N/A
Membrane roller	Bio-Rad Laboratories	1651279	Can be purchased in the Transfer bundle pack. However, if this product is not available, any smooth surface cylindrical tube long enough to roll over the membrane would suffice.
Microcentrifuge tubes  (0.6 mL)	N/A	N/A
Mouse IgG HRP secondary	Thermo Fisher Scientific	31430	Goat anti-Mouse IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilute at 1 in 20,000 in blocking buffer.
Mouse IgM HRP secondary	Abcam	ab97230	Goat Anti-Mouse IgM mu chain. Use at the same dilution as mouse IgG.
Myosin Heavy Chain I (MHCI) primary antibody	DSHB	A4.840	Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.
Myosin Heavy Chain IIa (MHCIIa) primary antibody	DSHB	A4.74	Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.
Myosin Heavy Chain IIx (MHCIIx) primary antibody	DSHB	6H1	Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.
Nitrocellulose Membrane 0.45 µm	Bio-Rad Laboratories	1620115	For Western blotting.
Petri dish lid	N/A	N/A
Plastic tweezers	N/A	N/A
Power Pack	Bio-Rad Laboratories	164-5050	Product name: Basic power supply.
Protein ladder	Thermo Fisher Scientific	26616	PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa.
PVDF Membrane 0.2 µm	Bio-Rad Laboratories	1620177
Rabbit HRP secondary	Thermo Fisher Scientific	31460	Goat anti-Rabbit IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilution same as mouse secondary antibodies.
Rocker	N/A	N/A
Ruler	N/A	N/A
Scissors	N/A	N/A
Stereomicroscope	Motic	SMZ-168
Stripping buffer	Thermo Fisher Scientific	21059	Product name: Restore Western Blot Stripping Buffer.
Tissue (lint free)	Kimberly-Clark professional	34120	Product name: Kimwipe.
Transfer buffer (1x Tris Glycine buffer (TG), 20% Methanol)	TG: Bio-Rad Laboratories   Methanol: Merck	TG buffer: 1610771           Methanol: 1.06018	dilute 10x TG buffer with ultra-pure H2O to 1x. Add 100% Methanol to a final concentration of 20% Methanol. Store at 4 °C.
Transfer tray	Bio-Rad Laboratories	1704089
UV-activation precast gel	Bio-Rad Laboratories	5678085	Gel type: 4–15% Criterion TGX Stain-Free Protein Gel, 26 well, 15 µL.
Vortex	N/A	N/A
Wash buffer (1x TBST)	10x TBS: Astral Scientific  Tween 20: Sigma	BIOA0027-4L	1x TBST recipe: 10x Tris-buffered saline (TBS) is diluted down to 1x with ultra-pure H2O, Tween 20 is added to a final concentration of 0.1%. Store buffer at 4 °C.
Wash containers	Sistema	Store bought	Any tupperware container, that suits the approximate dimensions of the membrane would suffice.