Identifizierung des Fasertyps der menschlichen Skelettmuskulatur

Zusammenfassung

Dieses Protokoll demonstriert die Einzelfaserisolierung aus gefriergetrocknetem menschlichem Skelettmuskel und die Klassifizierung von Fasertypen gemäß der Myosin-Schwerketten-Isoform (MHC) unter Verwendung der Dot-Blotting-Technik. Identifizierte MHC I- und II-Faserproben können dann mittels Western Blot weiter auf fasertypspezifische Unterschiede in der Proteinexpression analysiert werden.

Zusammenfassung

Die hier beschriebene Technik kann verwendet werden, um spezifische Myosin-Schwerketten-Isoformen (MHC) in Segmenten einzelner Muskelfasern unter Verwendung von Dot-Blotting zu identifizieren, im Folgenden als My-Osin-Schwerketten-Detektion durch Do-t-B-Lotting zur Identifizierungdes Muskelfasertyps (MyDoBID) bezeichnet. Dieses Protokoll beschreibt den Prozess der Gefriertrocknung der menschlichen Skelettmuskulatur und der Isolierung von Segmenten einzelner Muskelfasern. Mit MyDoBID werden Typ-I- und Typ-II-Fasern mit MHCI- bzw. IIa-spezifischen Antikörpern klassifiziert. Klassifizierte Fasern werden dann für jede Biopsie zu fasertypspezifischen Proben kombiniert.

Das Gesamtprotein in jeder Probe wird durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) und UV-aktivierte Geltechnologie bestimmt. Der Fasertyp der Proben wird mittels Western Blot validiert. Es wird auch beschrieben, wie wichtig es ist, eine Normalisierung der Proteinbeladung durchzuführen, um die Detektion von Zielproteinen über mehrere Western Blots hinweg zu verbessern. Zu den Vorteilen der Konsolidierung klassifizierter Fasern in fasertypspezifischen Proben im Vergleich zu Western Blots mit einer Faser gehören die Vielseitigkeit der Proben, der erhöhte Probendurchsatz, die kürzere Zeitinvestition und die Kosteneinsparungsmaßnahmen, während wertvolle fasertypspezifische Informationen erhalten bleiben, die bei homogenisierten Muskelproben häufig übersehen werden. Der Zweck des Protokolls besteht darin, eine genaue und effiziente Identifizierung von Typ-I- und Typ-II-Fasern zu erreichen, die aus gefriergetrockneten menschlichen Skelettmuskelproben isoliert wurden.

Diese einzelnen Fasern werden anschließend zu typ- und typ-II-fasertypspezifischen Proben kombiniert. Darüber hinaus wird das Protokoll um die Identifizierung von Typ-IIx-Fasern erweitert, wobei Aktin als Marker für Fasern verwendet wird, die negativ für MHCI und MHCIIa waren, die durch Western Blot als IIx-Fasern bestätigt werden. Jede fasertypspezifische Probe wird dann verwendet, um die Expression verschiedener Zielproteine mit Hilfe von Western-Blotting-Techniken zu quantifizieren.

Einleitung

Der Skelettmuskel ist ein heterogenes Gewebe mit ausgeprägten zellulären metabolischen und kontraktilen Eigenschaften, die davon abhängen, ob die Zelle (Faser) langsam zuckt (Typ I) oder schnell zuckt (Typ II). Der Fasertyp kann durch die Untersuchung der Myosin-Schwerketten-Isoformen (MHC) identifiziert werden, die sich in mehrfacher Hinsicht voneinander unterscheiden, einschließlich Kontraktionszeit, Verkürzungsgeschwindigkeit und Ermüdungsbeständigkeit¹. Zu den wichtigsten MHC-Isoformen gehören Typ I, Typ IIa, Typ IIb und Typ IIx, und ihre metabolischen Profile sind entweder oxidativ (Typ I und IIa) oder glykolytisch (IIx, IIb)¹. Der Anteil dieser Fasertypen variiert je nach Muskeltyp und zwischen den Arten. Typ IIb kommt häufig im Nagetiermuskel vor. Menschliche Muskeln enthalten keine Typ-IIb-Fasern und bestehen überwiegend aus MHC-Isoformen der Typ-I- und IIa-Fasern, mit einem geringen Anteil an IIx-Fasern². Die Proteinexpressionsprofile variieren zwischen verschiedenen Fasertypen und können sich mit dem Alter³, der körperlichen Betätigung ^4,5 und der Krankheit⁶ verändern.

Die Messung zellulärer Reaktionen in verschiedenen Skelettmuskelfasertypen wird aufgrund der Untersuchung von Muskelhomogenaten (eine Mischung aus allen Fasertypen) oft übersehen oder ist nicht möglich. Der Western Blot mit einer Faser ermöglicht die Untersuchung mehrerer Proteine in einzelnen Muskelfasern⁷. Diese Methodik wurde zuvor verwendet, um neuartige und informative Einzelfasereigenschaften herzustellen, die mit Homogenatpräparaten nicht erreicht werden konnten. Es gibt jedoch einige Einschränkungen der ursprünglichen Einzelfaser-Western-Blot-Methode, einschließlich der zeitaufwändigen Natur, der Unfähigkeit, Probenreplikate zu erstellen, und der Verwendung teurer, empfindlicher Reagenzien für die verbesserte Chemilumineszenz (ECL). Wenn frisches Gewebe verwendet wird, ist diese Methode aufgrund der zeitlichen Beschränkungen, einzelne Fasern innerhalb eines begrenzten Zeitrahmens (d. h. 1-2 Stunden) zu isolieren, weiter eingeschränkt. Glücklicherweise wird diese Einschränkung durch die Isolierung von Einzelfasersegmenten aus gefriergetrocknetem Gewebe gemildert⁸. Die Fasergewinnung aus gefriergetrockneten Proben ist jedoch durch die Größe und Qualität des biopsierten Gewebes begrenzt.

Die Identifizierung von Fasertypen mit der Dot-Blotting-Methode⁹ wurde in diesem umfassenden Protokoll erheblich ausgearbeitet und erweitert. Zuvor wurde gezeigt, dass bereits ~2-10 mg nasses Muskelgewebe für die Gefriertrocknung und die Analyse von MHC-Isoformproteinen aus einer Faser ausreichen⁹. Christensen et ^al.9 verwendeten 30% eines ~1 mm großen Fasersegments, um die MHC-Isoform durch Dot Blot zu detektieren, was durch Western Blot bestätigt wurde. Diese Arbeit zeigte, dass durch die Substitution von Western Blotting durch Dot Blot die Gesamtkosten um ~40-fach gesenkt wurden (für 50 Fasersegmente). Die Fasern wurden dann in Typ-I- und Typ-II-Proben "gepoolt", was eine experimentelle Replikation ermöglichte⁹. Eine Einschränkung bestand jedoch darin, dass nur zwei fasertypspezifische Proben gewonnen wurden: Typ I (MHCI-positiv) und Typ II (MHCII-positive Fasern), wobei Typ-II-Proben eine Mischung aus MHCIIa und MHCIIx ^6,10 enthielten. Insbesondere zeigt das aktuelle Protokoll, wie reine Typ-IIx-Fasern identifiziert werden können, und bietet einen sehr detaillierten Arbeitsablauf (zusammengefasst in Abbildung 1), einschließlich Strategien zur Fehlerbehebung bei häufigen Protokollproblemen.

Protokoll

Menschliche Muskelproben wurden aus dem Vastus lateralis von n = 3 (2 Männer, 1 Frau) im Alter von 70-74 Jahren unter sterilen Bedingungen unter örtlicher Betäubung (Xylocain) und einer für die manuelle Absaugung modifizierten Bergstrom-Nadel gewonnen^11,12. Bei den Proben handelte es sich um eine Teilmenge einer früheren Studie, die vom Ethikkomitee für Humanforschung der Universität Victoria genehmigt wurde (HRETH11/221) und in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki¹³ durchgeführt wurde. Die Teilnehmer gaben eine schriftliche, informierte Einwilligung zur Teilnahme an dieser Studie. Ausführliche Informationen zu allen Materialien, die für dieses Protokoll benötigt werden, sind in der Materialtabelle aufgeführt. Darüber hinaus finden Sie in Tabelle 1 eine Liste von Strategien zur Fehlerbehebung bei häufigen Protokollproblemen.

1. Gefriertrocknung

1. Während Sie die biopsierten Muskelproben auf Trockeneis eingefroren halten, wiegen und tarieren Sie ein leeres, gefrorenes Röhrchen auf der Waage.
2. Wiegen Sie schnell mindestens 10 mg nasses gefrorenes Gewebe. Notieren Sie das Gewicht auf eine Dezimalstelle genau.
3. Geben Sie das Gewebe in das vorgekühlte Mikrozentrifugenröhrchen, in das 3-4 Löcher in den Deckel gestochen wurden, und legen Sie es in ein kleines Becherglas mit 2-3 Pellets Trockeneis.
4. Beachten Sie die Bedienungsanleitung des Gefriertrocknerherstellers.
5. Stellen Sie sicher, dass alle Ventile am Gefriertrockner geschlossen sind, und schalten Sie den Gefriertrockner ein.
6. Verwenden Sie das Bedienfeld, um zu überprüfen, ob der Vakuum-Sollwert für optimale Gefriertrocknungsbedingungen für menschliches Gewebe programmiert ist, 0,12 Millibar (mBar) (Abbildung 2).
7. Drücken Sie am Gefriertrockner manuell und warten Sie, bis die Kammer auf −40 ^°C abgekühlt ist.
8. Sobald die Kammer diese Temperatur erreicht hat, entfernen Sie den Deckel, dann die Glaskammer und stellen Sie das Becherglas (mit der Muskelprobe) auf die Metallbühne.
9. Setzen Sie die Glaskammer und den Deckel wieder auf. Schließen Sie das Vakuumventil am Deckel und warten Sie, bis die Vakuumwaage grün leuchtet, um sicherzustellen, dass der Trockner vakuumversiegelt ist.
10. Gefriertrocknen Sie die Muskelproben für 48 Stunden. Sobald die Gefriertrocknung abgeschlossen ist, schalten Sie die Vakuumpumpe aus, indem Sie den Vakuumknopf drücken, und öffnen Sie das Vakuumablassventil am Deckel.
11. Nehmen Sie den Deckel der Kammer ab und sammeln Sie die gefriergetrocknete Probe. Wiegen Sie das Gewebe und notieren Sie das Gewicht auf eine Dezimalstelle genau.
12. Berechnen Sie den prozentualen Gewichtsverlust; ~75% Gewichtsabnahme deutet darauf hin, dass das Gewebe erfolgreich gefriergetrocknet wurde (in dieser Arbeit Mittelwert ± SD, 76 ± 9%, n = 11 Muskelproben).
13. Drücken Sie AUTO, um die Vakuumpumpe und den Gefrierschrank auszuschalten. Lassen Sie das Gerät Umgebungstemperatur erreichen.
14. Reinigen Sie die Kühlschlangen gemäß den Anweisungen des Herstellers und lassen Sie die angesammelte Flüssigkeit aus dem Kollektor ab.
    HINWEIS: Die Fasersammlung kann sofort beginnen. Wenn kein Gewebe zur Faserisolierung verwendet wird, bewahren Sie die gefriergetrocknete Probe bei -80 °C in einem verschlossenen Behälter mit Exsikkatorperlen auf.  VORSICHT: Trockeneis ist gefährlich (Klasse 9); Beziehen Sie sich auf das Sicherheitsdatenblatt für die empfohlene sichere Handhabung.

2. Sammlung von Fasern

1. Vorbereitung der Fasersammlung
   1. Beschriften Sie mindestens 50 Mikrofugenröhrchen (Faser 1 bis 50) und pipettieren Sie 10 μl Denaturierungspuffer in jedes Röhrchen.
   2. Bereiten Sie den Entnahmebereich mit zwei Paar Feingewebepräparierzangen, fusselfreiem Gewebe, einer Tischlampe, einem Stereomikroskop (mit dem schwarzen Tisch nach oben), einem Wirbel und einer Tischzentrifuge vor.
   3. Legen Sie die gefriergetrocknete Muskelprobe auf einen Petrischalendeckel. Legen Sie den Deckel auf den Tisch des Präpariermikroskops.
   4. Sehen Sie sich das Video der Einzelfaserdissektion an. Üben Sie das vollständige Protokoll von der Faserentnahme bis zur Identifizierung des Einzelfasertyps mindestens zweimal, bevor Sie mit einer Studie beginnen.
   5. Berechnen Sie vor der Faserentnahme das Gesamtvolumen, das für eine Faserprobe aus jeder Biopsie erforderlich ist , wie folgt. Wenn z. B. das Ausgangsvolumen von 1 Faser = 10 μl und das nach MyDoBID verbleibende Volumen (1 Faser × 10 μl) - 1 μl für das Dot Blotting = 9 μl (Probenvolumen) beträgt, berechnen Sie das erforderliche Gesamtprobenvolumen , indem Sie das Probenvolumen (μl) mit der Gesamtzahl der Western Blots multiplizieren, die ausgeführt werden, und verdoppeln Sie diese Menge, um Redundanz zu berücksichtigen: (9 μl × 4 Western Blots) × 2 = 72 μl. Berechnen Sie die Anzahl der benötigten Fasern pro typisierter Probe, indem Sie das endgültige erforderliche Probenvolumen (μl) durch das Probenvolumen pro fasertypspezifischer Probe dividieren (z. B. 72 μl ÷ 9 μl = 8 Fasern pro fasertypspezifischer Probe). Um dies zu erreichen, sammeln Sie insgesamt 50 Fasern.
      HINWEIS: Das erforderliche Probenvolumen ist die minimale Proteinkonzentration, die erforderlich ist, um sowohl MyDoBID als auch Western Blot durchzuführen, wenn die Menge des geladenen Proteins einer ~3 mm Faser (~12 μg Nassgewicht) für jede Probe entspricht (siehe Zusatzdatei 1 für Details). Dieses Volumen berücksichtigt jedoch nicht, ob für ein bestimmtes Protein Wiederholungsgele erforderlich sind.  VORSICHT: Pinzetten sind scharf; Behandeln Sie sie mit Vorsicht, um das Risiko einer Hautdurchstichung zu vermeiden.
2. Einzelfaser-Isolierung
   1. Zeichnen Sie auf einem kleinen Blatt Papier 5 cm x 1 cm mit einem Lineal eine 1 cm lange Linie. Markieren Sie alle 1 mm auf dieser Linie.
   2. Führen Sie diese unter den Petrischalendeckel ein, um die Länge der gesammelten Fasern abzuschätzen.
   3. Die gefriergetrocknete Muskelprobe wird bei geringer Vergrößerung (x 7,5) unter das Stereomikroskop gelegt. Verwenden Sie eine Feingewebezange, um den gefriergetrockneten Muskel an Ort und Stelle zu halten, und beginnen Sie mit der anderen, kleine Faserbündel zu trennen (wie im Video zu sehen).
   4. Isolieren Sie ein Bündel von Fasern und ziehen Sie es weiter auseinander, bis einzelne Fasersegmente aus dem Bündel isoliert sind.
   5. Sammle mindestens 50 Fasern, die mindestens ~1 mm lang sind.
   6. Bewegen Sie die Faser an eine leere Stelle in der Petrischale. Prüfen Sie Einzelfasersegmente unter höherer Vergrößerung (x 50). Stellen Sie sicher, dass es sich um eine einzelne Faser handelt, indem Sie die Faser am Ende weiter trennen. Wenn die Faser bricht, anstatt sich zu trennen, handelt es sich um eine einzelne Faser.
3. Denaturierung von Fasern
   1. Sammeln Sie die Faser vorsichtig mit einer Pinzette und legen Sie sie direkt in den aliquotierten Denaturierungspuffer (lassen Sie die Pinzette nicht auf den Puffer treffen).
   2. Überprüfe die Pinzette unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass die Faser erfolgreich entfernt wurde. Schließen Sie den Schlauch und klopfen Sie dreimal fest auf den Boden des Schlauchs, um sicherzustellen, dass sich die Faser in den Puffer bewegt.
   3. Wischen Sie die Pinzette mit fusselfreiem Tuch sauber, bevor Sie zur nächsten Faser übergehen. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle Fasern gesammelt sind.
   4. Die Faserproben vortexen und 5 s bei 2.500 × g kurz zentrifugieren, um die Probe auf den Boden des Röhrchens zu ziehen.
      HINWEIS: Die Zentrifugationsdauer (5 s) ist vom Start (0 × g) bis zum Erreichen der Drehzahl von ~2.500 × g getaktet.
   5. Lassen Sie die Proben 1 h bei Raumtemperatur. Für die spätere Verwendung bei -80 °C lagern. Frieren Sie die Proben ein und tauen Sie sie dann vor der Verwendung wieder auf.

3. Punkt-Blotting

1. Membranpräparation und -aktivierung
   1. Messen, beschriften und schneiden Sie eine Membran aus Polyvinylidendifluorid (PVDF) (0,2 μm Porengröße) auf 50 Proben (~10,5 cm x 5,5 cm) zu.
   2. Markieren Sie den linken Rand numerisch von oben nach unten (1 bis 10) und den oberen Rand alphabetisch von links nach rechts (A bis E) im Abstand von 1 cm.
   3. Bereiten Sie vier Blatt Filterpapier mit den Maßen 12,5 cm x 7,5 cm vor.
   4. Stapeln Sie zwei Blätter zu einem Stapel zusammen. Weichen Sie den Filterpapierstapel in 1x Transferpuffer ein.
   5. Legen Sie die Membran in einen Behälter. Gießen Sie 95%iges Ethanol über die Membran, mit genügend Volumen, um die Membran vollständig einzutauchen (10-15 ml). 1 Min. auf der Wippe rühren.
   6. Sammeln Sie das Ethanol, tauchen Sie die Membran in 1x Transferpuffer (~15 ml) und rocken Sie es weitere 2 Minuten lang.
      HINWEIS: Sowohl Ethanol als auch Transferpuffer können für zukünftige Dot-Blotting-Experimente wiederverwendet werden, bis sich Sedimentation bildet (Wechsel nach sechs Anwendungen).
   7. Legen Sie den mit Transferpuffer getränkten Filterpapierstapel auf eine flache, bewegliche Fläche, z. B. einen großen Deckel, und drücken Sie ihn mit der Walze flach. Positionieren Sie die PVDF-Membran mit einem Gelablöser oder einer Pinzette auf dem Stapel.
   8. Legen Sie ein einzelnes Blatt trockenes Filterpapier auf die Membran und bewegen Sie die Walze über das Filterpapier, um überschüssigen Puffer auf der Membranoberfläche aufzusaugen. Entfernen Sie das obere Filterpapier, ohne die Membran zu reiben.
      VORSICHT: Methanol (Klasse 3, Unterrisiko 6.1) und Ethanol (Klasse 3) sind gefährlich. Im Sicherheitsdatenblatt (MSDS) finden Sie Empfehlungen zur sicheren Handhabung.
2. Probenaufnahme an die Membran
   1. Die Faserproben werden aufgetaut, eine kurze Zentrifuge (5 s) bei Raumtemperatur wie in Schritt 2.3.4 durchgeführt und die Probe gründlich gemischt.
   2. Ohne die Membran mit der Pipettenspitze zu berühren, geben Sie langsam einen ~1 μl Tropfen jeder Probe auf die Membran im dafür vorgesehenen Bereich. Die Abmessungen des ausgewiesenen Bereichs pro Faserprobe betragen ~1 cm x 1 cm. Versuchen Sie, die Probe in der Mitte dieses Bereichs zu erkennen.
   3. Lassen Sie die Probentröpfchen mindestens 15 Minuten lang durch die Membran einweichen. Stellen Sie sicher, dass kein Probenpuffer zurückbleibt und vollständig absorbiert wird.
   4. Heben Sie die Membran mit einer Plastikpinzette vorsichtig vom feuchten Filterpapierstapel ab, legen Sie sie auf ein einzelnes trockenes Blatt Filterpapier und dehydrieren Sie die Membran mindestens 5 Minuten lang.
   5. Sobald die Probenflecken vollständig weiß geworden sind, reaktivieren Sie die Membran.
3. Reaktivierung und Blockierung der Membran
   1. Die Membran wird durch Wiederholung der Schritte 3.1.5 und 3.1.6 reaktiviert.
   2. Legen Sie die Membran in Waschpuffer und spülen Sie sie 5 Minuten lang mit Schaukeln. Entsorgen Sie den Waschpuffer.
   3. Inkubieren Sie die Membran 30 Minuten lang im Blockierungspuffer, während Sie schaukeln.
   4. Spülen Sie die Membran 3x mit Waschpuffer aus, bis der Puffer nicht mehr trüb ist.
   5. Lassen Sie die Membran in der letzten Wäsche auf der Wippe.

4. Immunmarkierung

1. Nachweis von MHCIIa
   1. Verdünnen Sie den MHCIIa-Primärantikörper mit 1:200 in 10 ml BSA-Puffer (Rinderserumalbumin).
   2. Verwerfen Sie den Waschpuffer von der Membran und gießen Sie dann den verdünnten MHCIIa-Antikörper auf die Membran.
   3. Stellen Sie den Behälter (mit der Membran in MHCIIa) bei Raumtemperatur für 2 h oder über Nacht bei 4 °C auf die Wippe.
   4. Sammeln Sie den MHCIIa-Antikörper und lagern Sie ihn bei 4 °C. Waschen Sie die Membran mit Blockierpuffer 2 Minuten lang auf der Wippe.
      HINWEIS: Alle Primärantikörper können bis zu fünfmal wiederverwendet werden, solange der Puffer frei bleibt.
   5. Noch zweimal ausspülen; 5 min jedes Mal; Insgesamt drei Wäschen.
   6. Sekundärer Maus-Immunglobulin-G-Meerrettichperoxidase (IgG-HRP)-Sekundärantikörper bei 1 zu 20.000 in 10 ml Blockierungspuffer verdünnen und der Membran hinzufügen.
   7. Verwerfen Sie den Waschpuffer und inkubieren Sie die Membran in Maus-IgG-HRP-sekundär mit Schaukeln für 1 h.
   8. Entsorgen Sie das Sekundär und waschen Sie die Membran im Waschpuffer (2, 5, 5 min).
   9. Lassen Sie die Membran in der letzten Wäsche einweichen, bis sie für die Bildgebung bereit ist.
   10. Schalten Sie den Gel-Imager ein, warten Sie 15 Minuten, bis der Imager die erforderliche Betriebstemperatur erreicht hat, und öffnen Sie dann die Bildgebungssoftware (siehe Materialtabelle).
   11. Klicken Sie im Softwarefenster auf Neues Single-Channel-Protokoll (Abbildung 3A). Für ein Weißlichtbild der Membran finden Sie unter Anwendungen | Kleckse | Klicken Sie auf Kolorimetrisch (Abbildung 3B).
   12. Klicken Sie auf den Gelbereich; Jede Option ist für bestimmte Abmessungen programmiert, um der Größe verschiedener Geltypen gerecht zu werden. Wählen Sie die entsprechende Option aus, die am besten zu den Abmessungen der Membran passt (Abbildung 3C).
   13. Bereiten Sie die ECL vor, indem Sie Luminol- und Peroxidase-Reagenzien im Verhältnis 1:1 kombinieren. Stellen Sie ein ausreichendes Volumen der ECL-Mischung her, um die gesamte Membran zu bedecken, in der Regel ist ein Gesamtvolumen von 800-1.000 μl erforderlich.
   14. Legen Sie die Membran auf eine große, durchsichtige Kunststoffschale und verteilen Sie die ECL-Mischung auf der Membran.
   15. Legen Sie die Membran auf die Speicherfolie.
   16. Klicken Sie auf Position Gel (gelbe Schaltfläche), um eine Live-Kameraansicht zu erhalten. Halten Sie die Zoom-Taste gedrückt und ziehen Sie sie, um den Abbildungsbereich der Membran zu maximieren. Begradigen Sie an dieser Stelle bei Bedarf die Position der Membran.
   17. Klicken Sie auf Protokoll ausführen (grüne Schaltfläche) und warten Sie, bis ein farbmetrisches Bild der Membran erstellt wurde. Speichern Sie dieses Bild, um die Zuordnung der Punkte zur entsprechenden Faserprobe zu erleichtern.
   18. Ohne die Membran zu bewegen, ändern Sie die Anwendung in der Software, indem Sie auf die Option für ein 2 x 2-Binning (Chemi High Resolution) klicken (Abbildung 3D).
   19. Optimieren Sie unter Bildbelichtung und Software die Belichtungszeit, klicken Sie auf Schwache Bänder (Abbildung 3E) | Signal-Akkumulations-Modus.
   20. Geben Sie unter Setup 1 s für das erste Bild, 30 s für das letzte Bild und insgesamt 30 Bilder ein (Abbildung 3F).
   21. Klicken Sie auf Protokoll ausführen.
   22. Speichern Sie ein Bild in den folgenden Phasen: vor der Signalsättigung (alle sichtbaren Punkte sind schwarz), der anfänglichen Signalsättigung (einige Punkte beginnen zu sättigen) und übersättigten Stellen (alle Stellen mit starkem Signal sind gesättigt).
   23. Speichern Sie alle erforderlichen Bilder, bevor Sie die Signalakkumulation beenden. Nehmen Sie die Membran aus dem Imager.
   24. Legen Sie die Membran mit dem Gelablöser zurück in den Behälter mit dem Waschpuffer.
2. Nachweis von MHCI
   1. Gießen Sie den Waschpuffer aus und behandeln Sie die Membran 30 Minuten lang bei 37 °C mit Stripping-Puffer (stellen Sie sicher, dass die Membran vollständig eingetaucht ist).
   2. Ziehen Sie den Stripping-Puffer zurück und spülen Sie die Membran 5 Minuten lang mit Schaukeln im Waschpuffer.
      HINWEIS: Der Stripping-Puffer kann 10x wiederverwendet werden, bevor er entsorgt wird.
   3. Gießen Sie den Waschpuffer aus und tragen Sie diesmal MHCI-Primärantikörper in einer Anfangskonzentration von 1 zu 200 (Bereich: 1 zu 200 bis 1 zu 500) auf. Die Membran 1 h bei Raumtemperatur rocken.
   4. Nach der Inkubation im MHCI-Primärantikörper wird der Antikörper entnommen und die Membran wie in den Schritten 4.1.4 und 4.1.5 gewaschen.
   5. Verdünnen Sie den Maus-IgM-HRP-Sekundärantikörper im Blockierungspuffer bei 1 zu 20.000. Gießen Sie den Blockierungspuffer aus der Membran und inkubieren Sie das Maus-IgM-Sekundär wie in Schritt 4.1.7.
   6. Wash und Bilderfassung erkannten MHCI wie in den Schritten 4.1.8 bis 4.1.24.
      VORSICHT: Der Stripping-Puffer enthält Organophosphin 3-5% (Klasse 8). In den Sicherheitsdatenblättern finden Sie Empfehlungen für die sichere Handhabung.
3. Nachweis von potentiellem MHCIIx mittels Actin
   1. Die Membran wird erneut abgezogen (Schritte 4.2.1 und 4.2.2).
   2. Wiederholen Sie Abschnitt 4.1 und wenden Sie diesmal den Primärantikörper Actin an, der mit 1 zu 500 im BSA-Puffer verdünnt ist, und dann den Kaninchen-HRP-Sekundärantikörper, der mit 1 zu 20.000 im Blockierungspuffer verdünnt ist.

5. Identifizierung des Fasertyps

1. MHCI-, MHCIIa- und Aktin-Signalanalyse
   1. Machen Sie sich mit dem Signalintensitätsfeld vertraut (Abbildung 4A). Notieren Sie sich die Schritte 5.1.2 bis 5.1.4.
   2. Eine gesättigte Signalintensität zeigt qualitativ an, dass die Proteindetektion stark ist.
   3. Ein moderater Wert zeigt an, dass das Zielprotein auf einem mittleren Niveau vorhanden ist.
   4. Ein schwaches Signal zeigt an, dass nur wenig Zielprotein vorhanden ist.
   5. Verwenden Sie das Signalintensitätsfeld, um Fasern mit "gesättigter", "mäßiger" oder "schwacher" Signalintensität zu kategorisieren (Abbildung 4A).
   6. Führen Sie die Identifizierung des Fasertyps durch, indem Sie zuerst die MHCIIa- und MHCI-Ergebnisse vergleichen (Abbildung 4B, linke und mittlere Blots).
   7. Zeichnen Sie Fasern mit gesättigter oder mittlerer Signalintensität von nur einer MHC-Isoform auf.
   8. Wenn das MHC-Isoformsignal "schwach" ist, lassen Sie die Faser unmarkiert (siehe Abbildung 4B).
   9. Wenn schließlich Aktin (moderate oder gesättigte Signalintensität) in den Fasern beobachtet wird, ohne dass MHCI oder IIa nachgewiesen wurde, wird es als potenzielle Typ-IIx-Faser aufgezeichnet (Abbildung 4B, rechter Blot).
   10. Aufzeichnung von Fasern mit schwachem MHC-Isoformsignal, aber Aktin (moderate oder gesättigte Intensität) als nicht identifiziert.
   11. Verwerfen Sie Proben mit schwachem oder keinem Nachweis (keine Faser gesammelt) für alle drei Zielproteine (Abbildung 4C).
   12. Zeichnen Sie jede Faser auf, bei der sowohl MHCI- als auch MHCII-Signale mit einem "gesättigten" oder moderaten Signal erkannt werden. Diese Proben sind nicht für die Verwendung in fasertypspezifischen Präparaten bestimmt.
2. Aufbereitung von fasertypspezifischen Proben
   1. Bereiten Sie für jede Biopsie eine separate Typ-I- und Typ-II-Probe vor. Für eine Typ-II-Probe ist die erforderliche Mindestanzahl von Fasern (berechnet in Schritt 2.1.5) zu kombinieren, in der MHCIIa in gesättigten oder moderaten Mengen nachgewiesen wird.
   2. Wiederholen Sie diesen Vorgang in einem separaten Röhrchen, das als Typ I gekennzeichnet ist, für Fasern, in denen MHCI nachgewiesen wird (Abbildung 4D).
   3. Verwenden Sie Fasern mit moderater Signalintensität, wenn nicht genügend Fasern mit gesättigten Signalen vorhanden sind.
   4. Kombinieren Sie alle potentiellen IIx-Fasern.
   5. Verwenden Sie sofort fasertypspezifische Proben für das Western Blot oder lagern Sie sie bei -80 °C für die zukünftige Verwendung.

6. Bestätigung des Western-Blot-Fasertyps

1. Verwenden Sie 10 μl jeder fasertypspezifischen Probe (das erforderliche Mindestprobenvolumen, siehe Schritt 2.1.5).
2. Trennen Sie die Proben mit dem angegebenen Fertiggel über SDS-PAGE gemäß dem Protokoll des Herstellers.
3. Verwenden Sie einen Gel-Imager, um das Protein im Gel gemäß dem Protokoll des Herstellers nachzuweisen.
4. Geben Sie das Gel für 10 Minuten in einen kalten 1x Transferpuffer.
5. Die Proteine werden gemäß dem Protokoll des Herstellers nass auf eine 0,45 μm große Nitrozellulosemembran (9,5 cm x 13,5 cm) übertragen.
6. Nach dem Transfer die Membran kurz mit hochreinem_H2Oin einem Behälter abspülen. Gießen Sie das Reinstwasser aus.
7. Geben Sie 10 ml der Antikörper-Signalverstärkungslösung zur Membran und zum Gestein bei Raumtemperatur für 10 Minuten.
8. Nehmen Sie die Antikörper-Signalverstärkungslösung auf und waschen Sie sie 5x (5 s pro Waschgang) mit hochreinem_H2O.
   HINWEIS: Die Lösung zur Verbesserung des Antikörpersignals kann 5x verwendet werden, bevor sie verworfen wird.
9. Gießen Sie die letzte Wäsche aus, fügen Sie Blockierlösung hinzu und rocken Sie sie 1 Stunde lang bei Raumtemperatur.
10. Verwenden Sie ein sauberes Skalpell, eine Klinge oder eine Schere, um horizontal mit einem Molekulargewicht über die Membran zu schneiden, das sicherstellt, dass sich Proteine mit einer Größe von 180 kDa und mehr auf dem oberen Abschnitt der Membran befinden.
11. Verwenden Sie diesen oberen Abschnitt zur weiteren Bestätigung des Fasertyps.
12. Verwenden Sie den Anteil unter 180 kDa, um verschiedene Zielproteine zu detektieren.
13. Auf dem oberen Abschnitt der Membran folgen Sie Abschnitt 4.1 mit dem primären MHCIIx- und dem Maus-Immunglobulin M (IgM) HRP-Sekundärantikörper.
14. Die Membran wird abgezogen (wie in den Abschnitten 4.2.1 und 4.2.2 beschrieben), bevor der Vorgang mit dem primären MHCIIa-IgG-Antikörper und dem Maus-IgG-HRP-Sekundärantikörper wiederholt wird.
15. Streifen Sie noch einmal ab und tragen Sie schließlich den primären MHCI-IgM- und den Maus-IgM-HRP-Sekundärantikörper auf.
    HINWEIS: Dieser Schritt ist qualitativ und daher ist ein Proteinverlust aufgrund des Membranstrippings kein Problem.
16. Vergleichen Sie das Signal, das in den verschiedenen MHC-Isoformen detektiert wurde (wie in Abbildung 5B dargestellt). Wenn die Signalintensität in der erwarteten Probe (MHCI - Typ I, MHCIIa - Typ II und MHCIIx - Typ IIx) bei moderaten bis gesättigten Werten nachgewiesen wird, werden die fasertypspezifischen Proben als zuverlässig für die Verwendung in zukünftigen Studien aufgezeichnet.
17. Zeichnen Sie die Probe als unzuverlässig auf, wenn mehr als eine MHC-Isoform gleichzeitig in einer Probe nachgewiesen wird.
    ACHTUNG: Antikörper-Enhancer-Lösung enthält 50% Natriumhydroxid. In den Sicherheitsdatenblättern finden Sie Empfehlungen zur sicheren Handhabung.

Ergebnisse

Identifizierung einzelner MHCI-, MHCIIa- und MHCIIx-Muskelfasern mittels Dot Blot
Ein Merkmal von MyDoBID ist die Kategorisierung der variierenden MHC- und Aktin-Signalintensitätsstärke in einer bestimmten Faser (Abbildung 4A). Der Fasertyp wurde durch das Vorhandensein oder Fehlen von MHCI- und IIa-Isoformen identifiziert (Abbildung 4B). Sechs Fasern zeigten keine MHC- oder Aktin-Detektion, was darauf hindeutet, dass keine Faser gesammelt ...

Diskussion

Sammlung von Fasern
Basierend auf mehrjähriger Erfahrung können die meisten Forscher diese Technik beherrschen; Die Praxis führt jedoch zu einer schnelleren und effizienteren Fasersammlung für nachgelagerte Analysen. Um 30 einzelne Fasersegmente einer Qualität für das Pooling isolieren zu können, wird empfohlen, 50 Fasersegmente pro Probe zu sammeln. Es wird empfohlen, das Video zur Fasersammlung sorgfältig und nach Durchführung von zwei Übungssitzungen (~50 Fasern pro Sitzung) zu studieren,...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x Denaturing buffer	Make according to recipe	Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributing companies	1x denaturing buffer is made by diluting 3x denaturing buffer 1 in 3 v/v with 1X Tris-HCl (pH 6.8). Store at -20 °C.
3x Denaturing buffer	Make according to recipe	Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributors	3x denaturing buffer contains: 0.125M Tris-HCI, 10% glycerol, 4% SDS, 4 M urea, 10% 2-mercaptoethanol, and 0.001% bromophenol blue, pH 6.8.  Store at -20 °C.
95% Ethanol	N/A	100% ethanol can be sourced from any company	Diluted to 95% with ultra-pure H2O.
Actin rabbit polyclonal antibody	Sigma-Aldrich	A2066	Dilute 1 in 1,000 with BSA buffer.
Analytical scales	Mettler Toledo	Model number: MSZ042101
Antibody enhancer	Thermo Fischer Scientific	32110	Product name is Miser Antibody Extender Solution NC.
Beaker (100 mL)	N/A	N/A
Benchtop centrifuge	Eppendorf	5452	Model name: Mini Spin.
Blocking buffer: 5% Skim milk in Wash buffer.	Diploma	Store bought
BSA buffer: 1 % BSA/PBST, 0.02 % NaN3	BSA: Sigma-Aldrich              PBS: Bio-Rad Laboratories. NaN3 : Sigma-Aldrich	BSA: A6003-25G                         10x PBS: 1610780                       NaN3: S2002	Bovine serum albumin (BSA), Phosphate-buffered saline (PBS), and Sodium azide (NaN3). Store at 4 °C.
Cassette opening lever	Bio-Rad Laboratories	4560000	Used to open the precast gel cassettes.
Chemidoc MP Imager	Bio-Rad Laboratories	Model number: Universal hood III	Any imaging system with Stain-Free gel imaging capabilities.
Criterion blotter	Bio-Rad Laboratories	1704070	Includes ice pack, transfer tray, roller, 2 cassette holders, filter paper, foam pads and lid with cables.
Criterion Cell (Bio-Rad)	Bio-Rad Laboratories	1656001
ECL (enhanced chemiluminescence)	Bio-Rad Laboratories	1705062	Product name: Clarity Max Western ECL Substrate.
Electrophoresis buffer 1x Tris Glycine SDS (TGS)	Bio-Rad Laboratories	1610772	Dilute 10x TGS 1 in 10 with ultra-pure H2O.
Filter paper, 0.34 mm thick	Whatmann	3030917	Bulk size 3 MM, pack 100 sheets, 315 x 335 mm.
Fine tissue dissecting forceps	Dumont	F6521-1EA	Jeweller’s forceps no. 5.
Flat plastic tray/lid	N/A	N/A	Large enough to place the membrane on. Ensure the surface is completely flat.
Freeze-drying System	Labconco	7750030	Freezone 4.5 L with glass chamber sample stage.
Freezer -80 oC	N/A	N/A	Any freezer with a constant temperature of -80 °C is suitable.
Gel releasers	1653320	Bio-Rad	Slide under the membrane to gather or move the membrane.
Grey lead pencil	N/A	N/A
Image lab software	Bio-Rad Laboratories	N/A	Figures refers to software version 5.2.1 but other versions can used.
Incubator	Bio-Rad Laboratories	1660521	Any incubator that can be set to 37 °C would suffice.
Lamp	N/A	N/A
Magnetic stirrer with flea	N/A	N/A
Membrane roller	Bio-Rad Laboratories	1651279	Can be purchased in the Transfer bundle pack. However, if this product is not available, any smooth surface cylindrical tube long enough to roll over the membrane would suffice.
Microcentrifuge tubes  (0.6 mL)	N/A	N/A
Mouse IgG HRP secondary	Thermo Fisher Scientific	31430	Goat anti-Mouse IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilute at 1 in 20,000 in blocking buffer.
Mouse IgM HRP secondary	Abcam	ab97230	Goat Anti-Mouse IgM mu chain. Use at the same dilution as mouse IgG.
Myosin Heavy Chain I (MHCI) primary antibody	DSHB	A4.840	Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.
Myosin Heavy Chain IIa (MHCIIa) primary antibody	DSHB	A4.74	Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.
Myosin Heavy Chain IIx (MHCIIx) primary antibody	DSHB	6H1	Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.
Nitrocellulose Membrane 0.45 µm	Bio-Rad Laboratories	1620115	For Western blotting.
Petri dish lid	N/A	N/A
Plastic tweezers	N/A	N/A
Power Pack	Bio-Rad Laboratories	164-5050	Product name: Basic power supply.
Protein ladder	Thermo Fisher Scientific	26616	PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa.
PVDF Membrane 0.2 µm	Bio-Rad Laboratories	1620177
Rabbit HRP secondary	Thermo Fisher Scientific	31460	Goat anti-Rabbit IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilution same as mouse secondary antibodies.
Rocker	N/A	N/A
Ruler	N/A	N/A
Scissors	N/A	N/A
Stereomicroscope	Motic	SMZ-168
Stripping buffer	Thermo Fisher Scientific	21059	Product name: Restore Western Blot Stripping Buffer.
Tissue (lint free)	Kimberly-Clark professional	34120	Product name: Kimwipe.
Transfer buffer (1x Tris Glycine buffer (TG), 20% Methanol)	TG: Bio-Rad Laboratories   Methanol: Merck	TG buffer: 1610771           Methanol: 1.06018	dilute 10x TG buffer with ultra-pure H2O to 1x. Add 100% Methanol to a final concentration of 20% Methanol. Store at 4 °C.
Transfer tray	Bio-Rad Laboratories	1704089
UV-activation precast gel	Bio-Rad Laboratories	5678085	Gel type: 4–15% Criterion TGX Stain-Free Protein Gel, 26 well, 15 µL.
Vortex	N/A	N/A
Wash buffer (1x TBST)	10x TBS: Astral Scientific  Tween 20: Sigma	BIOA0027-4L	1x TBST recipe: 10x Tris-buffered saline (TBS) is diluted down to 1x with ultra-pure H2O, Tween 20 is added to a final concentration of 0.1%. Store buffer at 4 °C.
Wash containers	Sistema	Store bought	Any tupperware container, that suits the approximate dimensions of the membrane would suffice.