Identifizierung des Fasertyps der menschlichen Skelettmuskulatur

Zusammenfassung

Dieses Protokoll demonstriert die Einzelfaserisolierung aus gefriergetrocknetem menschlichem Skelettmuskel und die Klassifizierung von Fasertypen gemäß der Myosin-Schwerketten-Isoform (MHC) unter Verwendung der Dot-Blotting-Technik. Identifizierte MHC I- und II-Faserproben können dann mittels Western Blot weiter auf fasertypspezifische Unterschiede in der Proteinexpression analysiert werden.

Zusammenfassung

Die hier beschriebene Technik kann verwendet werden, um spezifische Myosin-Schwerketten-Isoformen (MHC) in Segmenten einzelner Muskelfasern unter Verwendung von Dot-Blotting zu identifizieren, im Folgenden als My-Osin-Schwerketten-Detektion durch Do-t-B-Lotting zur Identifizierungdes Muskelfasertyps (MyDoBID) bezeichnet. Dieses Protokoll beschreibt den Prozess der Gefriertrocknung der menschlichen Skelettmuskulatur und der Isolierung von Segmenten einzelner Muskelfasern. Mit MyDoBID werden Typ-I- und Typ-II-Fasern mit MHCI- bzw. IIa-spezifischen Antikörpern klassifiziert. Klassifizierte Fasern werden dann für jede Biopsie zu fasertypspezifischen Proben kombiniert.

Das Gesamtprotein in jeder Probe wird durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) und UV-aktivierte Geltechnologie bestimmt. Der Fasertyp der Proben wird mittels Western Blot validiert. Es wird auch beschrieben, wie wichtig es ist, eine Normalisierung der Proteinbeladung durchzuführen, um die Detektion von Zielproteinen über mehrere Western Blots hinweg zu verbessern. Zu den Vorteilen der Konsolidierung klassifizierter Fasern in fasertypspezifischen Proben im Vergleich zu Western Blots mit einer Faser gehören die Vielseitigkeit der Proben, der erhöhte Probendurchsatz, die kürzere Zeitinvestition und die Kosteneinsparungsmaßnahmen, während wertvolle fasertypspezifische Informationen erhalten bleiben, die bei homogenisierten Muskelproben häufig übersehen werden. Der Zweck des Protokolls besteht darin, eine genaue und effiziente Identifizierung von Typ-I- und Typ-II-Fasern zu erreichen, die aus gefriergetrockneten menschlichen Skelettmuskelproben isoliert wurden.

Diese einzelnen Fasern werden anschließend zu typ- und typ-II-fasertypspezifischen Proben kombiniert. Darüber hinaus wird das Protokoll um die Identifizierung von Typ-IIx-Fasern erweitert, wobei Aktin als Marker für Fasern verwendet wird, die negativ für MHCI und MHCIIa waren, die durch Western Blot als IIx-Fasern bestätigt werden. Jede fasertypspezifische Probe wird dann verwendet, um die Expression verschiedener Zielproteine mit Hilfe von Western-Blotting-Techniken zu quantifizieren.

Einleitung

Der Skelettmuskel ist ein heterogenes Gewebe mit ausgeprägten zellulären metabolischen und kontraktilen Eigenschaften, die davon abhängen, ob die Zelle (Faser) langsam zuckt (Typ I) oder schnell zuckt (Typ II). Der Fasertyp kann durch die Untersuchung der Myosin-Schwerketten-Isoformen (MHC) identifiziert werden, die sich in mehrfacher Hinsicht voneinander unterscheiden, einschließlich Kontraktionszeit, Verkürzungsgeschwindigkeit und Ermüdungsbeständigkeit¹. Zu den wichtigsten MHC-Isoformen gehören Typ I, Typ IIa, Typ IIb und Typ IIx, und ihre metabolischen Profile sind entweder oxidativ (Typ I und IIa) oder glykolytisch (IIx, IIb)

Protokoll

Menschliche Muskelproben wurden aus dem Vastus lateralis von n = 3 (2 Männer, 1 Frau) im Alter von 70-74 Jahren unter sterilen Bedingungen unter örtlicher Betäubung (Xylocain) und einer für die manuelle Absaugung modifizierten Bergstrom-Nadel gewonnen^11,12. Bei den Proben handelte es sich um eine Teilmenge einer früheren Studie, die vom Ethikkomitee für Humanforschung der Universität Victoria genehmigt wurde (HRETH11/221) und in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki¹³ durchgeführt wurde. Die Teilnehmer gaben eine schriftliche, informierte Einwilligung zur Teilnahme a....

Ergebnisse

Identifizierung einzelner MHCI-, MHCIIa- und MHCIIx-Muskelfasern mittels Dot Blot
Ein Merkmal von MyDoBID ist die Kategorisierung der variierenden MHC- und Aktin-Signalintensitätsstärke in einer bestimmten Faser (Abbildung 4A). Der Fasertyp wurde durch das Vorhandensein oder Fehlen von MHCI- und IIa-Isoformen identifiziert (Abbildung 4B). Sechs Fasern zeigten keine MHC- oder Aktin-Detektion, was darauf hindeutet, dass keine Faser gesammelt .......

Diskussion

Sammlung von Fasern
Basierend auf mehrjähriger Erfahrung können die meisten Forscher diese Technik beherrschen; Die Praxis führt jedoch zu einer schnelleren und effizienteren Fasersammlung für nachgelagerte Analysen. Um 30 einzelne Fasersegmente einer Qualität für das Pooling isolieren zu können, wird empfohlen, 50 Fasersegmente pro Probe zu sammeln. Es wird empfohlen, das Video zur Fasersammlung sorgfältig und nach Durchführung von zwei Übungssitzungen (~50 Fasern pro Sitzung) zu studieren,.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x Denaturing buffer	Make according to recipe	Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributing companies	1x denaturing buffer is made by diluting 3x denaturing buffer 1 in 3 v/v with 1X Tris-HCl (pH 6.8). Store at -20 °C.
3x Denaturing buffer	Make according to recipe	Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributors	3x denaturing buffer contains: 0.125M Tris-HCI, 10% glycerol, 4% SDS, 4 M urea, 10% 2-mercaptoethanol, and 0.001% bromophenol blue, pH 6.8.  Store at -20 °C.
95% Ethanol	N/A	100% ethanol can be sourced from any company	Diluted to 95% with ultra-pure H2O.
Actin rabbit polyclonal antibody	Sigma-Aldrich	A2066	Dilute 1 in 1,000 with BSA buffer.
Analytical scales	Mettler Toledo	Model number: MSZ042101
Antibody enhancer	Thermo Fischer Scientific	32110	Product name is Miser Antibody Extender Solution NC.
Beaker (100 mL)	N/A	N/A
Benchtop centrifuge	Eppendorf	5452	Model name: Mini Spin.
Blocking buffer: 5% Skim milk in Wash buffer.	Diploma	Store bought
BSA buffer: 1 % BSA/PBST, 0.02 % NaN3	BSA: Sigma-Aldrich              PBS: Bio-Rad Laboratories. NaN3 : Sigma-Aldrich	BSA: A6003-25G                         10x PBS: 1610780                       NaN3: S2002	Bovine serum albumin (BSA), Phosphate-buffered saline (PBS), and Sodium azide (NaN3). Store at 4 °C.
Cassette opening lever	Bio-Rad Laboratories	4560000	Used to open the precast gel cassettes.
Chemidoc MP Imager	Bio-Rad Laboratories	Model number: Universal hood III	Any imaging system with Stain-Free gel imaging capabilities.
Criterion blotter	Bio-Rad Laboratories	1704070	Includes ice pack, transfer tray, roller, 2 cassette holders, filter paper, foam pads and lid with cables.
Criterion Cell (Bio-Rad)	Bio-Rad Laboratories	1656001
ECL (enhanced chemiluminescence)	Bio-Rad Laboratories	1705062	Product name: Clarity Max Western ECL Substrate.
Electrophoresis buffer 1x Tris Glycine SDS (TGS)	Bio-Rad Laboratories	1610772	Dilute 10x TGS 1 in 10 with ultra-pure H2O.
Filter paper, 0.34 mm thick	Whatmann	3030917	Bulk size 3 MM, pack 100 sheets, 315 x 335 mm.
Fine tissue dissecting forceps	Dumont	F6521-1EA	Jeweller’s forceps no. 5.
Flat plastic tray/lid	N/A	N/A	Large enough to place the membrane on. Ensure the surface is completely flat.
Freeze-drying System	Labconco	7750030	Freezone 4.5 L with glass chamber sample stage.
Freezer -80 oC	N/A	N/A	Any freezer with a constant temperature of -80 °C is suitable.
Gel releasers	1653320	Bio-Rad	Slide under the membrane to gather or move the membrane.
Grey lead pencil	N/A	N/A
Image lab software	Bio-Rad Laboratories	N/A	Figures refers to software version 5.2.1 but other versions can used.
Incubator	Bio-Rad Laboratories	1660521	Any incubator that can be set to 37 °C would suffice.
Lamp	N/A	N/A
Magnetic stirrer with flea	N/A	N/A
Membrane roller	Bio-Rad Laboratories	1651279	Can be purchased in the Transfer bundle pack. However, if this product is not available, any smooth surface cylindrical tube long enough to roll over the membrane would suffice.
Microcentrifuge tubes  (0.6 mL)	N/A	N/A
Mouse IgG HRP secondary	Thermo Fisher Scientific	31430	Goat anti-Mouse IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilute at 1 in 20,000 in blocking buffer.
Mouse IgM HRP secondary	Abcam	ab97230	Goat Anti-Mouse IgM mu chain. Use at the same dilution as mouse IgG.
Myosin Heavy Chain I (MHCI) primary antibody	DSHB	A4.840	Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.
Myosin Heavy Chain IIa (MHCIIa) primary antibody	DSHB	A4.74	Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.
Myosin Heavy Chain IIx (MHCIIx) primary antibody	DSHB	6H1	Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.
Nitrocellulose Membrane 0.45 µm	Bio-Rad Laboratories	1620115	For Western blotting.
Petri dish lid	N/A	N/A
Plastic tweezers	N/A	N/A
Power Pack	Bio-Rad Laboratories	164-5050	Product name: Basic power supply.
Protein ladder	Thermo Fisher Scientific	26616	PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa.
PVDF Membrane 0.2 µm	Bio-Rad Laboratories	1620177
Rabbit HRP secondary	Thermo Fisher Scientific	31460	Goat anti-Rabbit IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilution same as mouse secondary antibodies.
Rocker	N/A	N/A
Ruler	N/A	N/A
Scissors	N/A	N/A
Stereomicroscope	Motic	SMZ-168
Stripping buffer	Thermo Fisher Scientific	21059	Product name: Restore Western Blot Stripping Buffer.
Tissue (lint free)	Kimberly-Clark professional	34120	Product name: Kimwipe.
Transfer buffer (1x Tris Glycine buffer (TG), 20% Methanol)	TG: Bio-Rad Laboratories   Methanol: Merck	TG buffer: 1610771           Methanol: 1.06018	dilute 10x TG buffer with ultra-pure H2O to 1x. Add 100% Methanol to a final concentration of 20% Methanol. Store at 4 °C.
Transfer tray	Bio-Rad Laboratories	1704089
UV-activation precast gel	Bio-Rad Laboratories	5678085	Gel type: 4–15% Criterion TGX Stain-Free Protein Gel, 26 well, 15 µL.
Vortex	N/A	N/A
Wash buffer (1x TBST)	10x TBS: Astral Scientific  Tween 20: Sigma	BIOA0027-4L	1x TBST recipe: 10x Tris-buffered saline (TBS) is diluted down to 1x with ultra-pure H2O, Tween 20 is added to a final concentration of 0.1%. Store buffer at 4 °C.
Wash containers	Sistema	Store bought	Any tupperware container, that suits the approximate dimensions of the membrane would suffice.