Identification du type de fibre du muscle squelettique humain

Résumé

Ce protocole démontre l’isolement d’une seule fibre à partir de muscles squelettiques humains lyophilisés et la classification du type de fibre selon l’isoforme de la chaîne lourde de myosine (CMH) à l’aide de la technique de transfert de points. Les échantillons de fibres CMH I et II identifiés peuvent ensuite être analysés plus en détail pour détecter les différences spécifiques au type de fibre dans l’expression des protéines à l’aide du transfert Western.

Résumé

La technique décrite ici peut être utilisée pour identifier des isoformes spécifiques de la chaîne lourde de myosine (CMH) dans des segments de fibres musculaires individuelles à l’aide du transfert de points, ci-après dénommé détection de la chaîne lourde de l’osine par lotting Dot Bpour l’identificationdu type defibre musculaire (MyDoBID). Ce protocole décrit le processus de lyophilisation des muscles squelettiques humains et l’isolement de segments de fibres musculaires individuelles. À l’aide de MyDoBID, les fibres de type I et II sont classées avec des anticorps spécifiques de l’ICM et de l’IIa, respectivement. Les fibres classées sont ensuite combinées dans des échantillons spécifiques au type de fibre pour chaque biopsie.

La protéine totale dans chaque échantillon est déterminée par électrophorèse sur gel de polyacrylamide de dodécylsulfate de sodium (SDS-PAGE) et par la technologie de gel activé par les UV. Le type de fibre des échantillons est validé à l’aide du Western Blot. L’importance d’effectuer la normalisation de la charge protéique pour améliorer la détection des protéines cibles sur plusieurs Western blots est également décrite. Les avantages de la consolidation des fibres classées dans des échantillons spécifiques au type de fibre par rapport aux Western Blots à fibre unique comprennent la polyvalence des échantillons, l’augmentation du débit des échantillons, la réduction de l’investissement en temps et les mesures d’économie, tout en conservant des informations précieuses spécifiques au type de fibre qui sont souvent négligées à l’aide d’échantillons musculaires homogénéisés. L’objectif du protocole est d’obtenir une identification précise et efficace des fibres de type I et de type II isolées à partir d’échantillons de muscles squelettiques humains lyophilisés.

Ces fibres individuelles sont ensuite combinées pour créer des échantillons spécifiques au type de fibre de type I et de type II. De plus, le protocole est étendu pour inclure l’identification des fibres de type IIx, en utilisant l’actine comme marqueur pour les fibres qui étaient négatives pour MHCI et MHCIIa, qui sont confirmées comme des fibres IIx par western blot. Chaque échantillon spécifique au type de fibre est ensuite utilisé pour quantifier l’expression de diverses protéines cibles à l’aide de techniques de transfert Western.

Introduction

Le muscle squelettique est un tissu hétérogène, avec des propriétés métaboliques et contractiles cellulaires distinctes qui dépendent du fait que la cellule (fibre) soit à contraction lente (type I) ou à contraction rapide (type II). Le type de fibre peut être identifié en examinant les isoformes de la chaîne lourde de myosine (CMH), qui diffèrent les unes des autres de plusieurs façons, notamment par le temps de contraction, la vitesse de raccourcissement et la résistance à la fatigue¹. Les principales isoformes du CMH comprennent le type I, le type IIa, le type IIb et le type IIx et leurs profils métaboliques sont soit oxydatifs (type I et II....

Protocole

Des échantillons de muscles humains ont été prélevés dans le vaste latéral de n = 3 (2 hommes, 1 femme), âgés de 70 à 74 ans dans des conditions stériles sous anesthésie locale (xylocaïne) et une aiguille de Bergstrom modifiée pour une aspiration manuelle^11,12. Les échantillons étaient un sous-ensemble d’une étude antérieure approuvée par le Comité d’éthique de la recherche humaine de l’Université Victoria (HRETH11/221) et menée conformément à la Déclaration d’Helsinki¹³. Les participants ont donné leur consentement écrit et éclairé pour participer à cette étude. Tous les détai....

Discussion

Collecte de fibres
Sur la base de plusieurs années d’expérience, la plupart des chercheurs peuvent maîtriser cette technique ; Cependant, la pratique permet une collecte plus rapide et plus efficace des fibres pour les analyses en aval. Pour pouvoir isoler 30 segments de fibres simples d’une qualité pour la mise en commun, il est recommandé de prélever 50 segments de fibres par échantillon. Il est recommandé d’étudier attentivement la vidéo de collecte de fibres et après avoir effectu.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x Denaturing buffer	Make according to recipe	Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributing companies	1x denaturing buffer is made by diluting 3x denaturing buffer 1 in 3 v/v with 1X Tris-HCl (pH 6.8). Store at -20 °C.
3x Denaturing buffer	Make according to recipe	Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributors	3x denaturing buffer contains: 0.125M Tris-HCI, 10% glycerol, 4% SDS, 4 M urea, 10% 2-mercaptoethanol, and 0.001% bromophenol blue, pH 6.8.  Store at -20 °C.
95% Ethanol	N/A	100% ethanol can be sourced from any company	Diluted to 95% with ultra-pure H2O.
Actin rabbit polyclonal antibody	Sigma-Aldrich	A2066	Dilute 1 in 1,000 with BSA buffer.
Analytical scales	Mettler Toledo	Model number: MSZ042101
Antibody enhancer	Thermo Fischer Scientific	32110	Product name is Miser Antibody Extender Solution NC.
Beaker (100 mL)	N/A	N/A
Benchtop centrifuge	Eppendorf	5452	Model name: Mini Spin.
Blocking buffer: 5% Skim milk in Wash buffer.	Diploma	Store bought
BSA buffer: 1 % BSA/PBST, 0.02 % NaN3	BSA: Sigma-Aldrich              PBS: Bio-Rad Laboratories. NaN3 : Sigma-Aldrich	BSA: A6003-25G                         10x PBS: 1610780                       NaN3: S2002	Bovine serum albumin (BSA), Phosphate-buffered saline (PBS), and Sodium azide (NaN3). Store at 4 °C.
Cassette opening lever	Bio-Rad Laboratories	4560000	Used to open the precast gel cassettes.
Chemidoc MP Imager	Bio-Rad Laboratories	Model number: Universal hood III	Any imaging system with Stain-Free gel imaging capabilities.
Criterion blotter	Bio-Rad Laboratories	1704070	Includes ice pack, transfer tray, roller, 2 cassette holders, filter paper, foam pads and lid with cables.
Criterion Cell (Bio-Rad)	Bio-Rad Laboratories	1656001
ECL (enhanced chemiluminescence)	Bio-Rad Laboratories	1705062	Product name: Clarity Max Western ECL Substrate.
Electrophoresis buffer 1x Tris Glycine SDS (TGS)	Bio-Rad Laboratories	1610772	Dilute 10x TGS 1 in 10 with ultra-pure H2O.
Filter paper, 0.34 mm thick	Whatmann	3030917	Bulk size 3 MM, pack 100 sheets, 315 x 335 mm.
Fine tissue dissecting forceps	Dumont	F6521-1EA	Jeweller’s forceps no. 5.
Flat plastic tray/lid	N/A	N/A	Large enough to place the membrane on. Ensure the surface is completely flat.
Freeze-drying System	Labconco	7750030	Freezone 4.5 L with glass chamber sample stage.
Freezer -80 oC	N/A	N/A	Any freezer with a constant temperature of -80 °C is suitable.
Gel releasers	1653320	Bio-Rad	Slide under the membrane to gather or move the membrane.
Grey lead pencil	N/A	N/A
Image lab software	Bio-Rad Laboratories	N/A	Figures refers to software version 5.2.1 but other versions can used.
Incubator	Bio-Rad Laboratories	1660521	Any incubator that can be set to 37 °C would suffice.
Lamp	N/A	N/A
Magnetic stirrer with flea	N/A	N/A
Membrane roller	Bio-Rad Laboratories	1651279	Can be purchased in the Transfer bundle pack. However, if this product is not available, any smooth surface cylindrical tube long enough to roll over the membrane would suffice.
Microcentrifuge tubes  (0.6 mL)	N/A	N/A
Mouse IgG HRP secondary	Thermo Fisher Scientific	31430	Goat anti-Mouse IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilute at 1 in 20,000 in blocking buffer.
Mouse IgM HRP secondary	Abcam	ab97230	Goat Anti-Mouse IgM mu chain. Use at the same dilution as mouse IgG.
Myosin Heavy Chain I (MHCI) primary antibody	DSHB	A4.840	Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.
Myosin Heavy Chain IIa (MHCIIa) primary antibody	DSHB	A4.74	Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.
Myosin Heavy Chain IIx (MHCIIx) primary antibody	DSHB	6H1	Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.
Nitrocellulose Membrane 0.45 µm	Bio-Rad Laboratories	1620115	For Western blotting.
Petri dish lid	N/A	N/A
Plastic tweezers	N/A	N/A
Power Pack	Bio-Rad Laboratories	164-5050	Product name: Basic power supply.
Protein ladder	Thermo Fisher Scientific	26616	PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa.
PVDF Membrane 0.2 µm	Bio-Rad Laboratories	1620177
Rabbit HRP secondary	Thermo Fisher Scientific	31460	Goat anti-Rabbit IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilution same as mouse secondary antibodies.
Rocker	N/A	N/A
Ruler	N/A	N/A
Scissors	N/A	N/A
Stereomicroscope	Motic	SMZ-168
Stripping buffer	Thermo Fisher Scientific	21059	Product name: Restore Western Blot Stripping Buffer.
Tissue (lint free)	Kimberly-Clark professional	34120	Product name: Kimwipe.
Transfer buffer (1x Tris Glycine buffer (TG), 20% Methanol)	TG: Bio-Rad Laboratories   Methanol: Merck	TG buffer: 1610771           Methanol: 1.06018	dilute 10x TG buffer with ultra-pure H2O to 1x. Add 100% Methanol to a final concentration of 20% Methanol. Store at 4 °C.
Transfer tray	Bio-Rad Laboratories	1704089
UV-activation precast gel	Bio-Rad Laboratories	5678085	Gel type: 4–15% Criterion TGX Stain-Free Protein Gel, 26 well, 15 µL.
Vortex	N/A	N/A
Wash buffer (1x TBST)	10x TBS: Astral Scientific  Tween 20: Sigma	BIOA0027-4L	1x TBST recipe: 10x Tris-buffered saline (TBS) is diluted down to 1x with ultra-pure H2O, Tween 20 is added to a final concentration of 0.1%. Store buffer at 4 °C.
Wash containers	Sistema	Store bought	Any tupperware container, that suits the approximate dimensions of the membrane would suffice.