Identificação do Tipo de Fibra do Músculo Esquelético Humano

Resumo

Este protocolo demonstra o isolamento de fibra única do músculo esquelético humano liofilizado e a classificação do tipo de fibra de acordo com a isoforma da cadeia pesada da miosina (MHC) usando a técnica de dot blotting. Amostras de fibras MHC I e II identificadas podem então ser analisadas para diferenças específicas do tipo de fibra na expressão de proteínas usando western blotting.

Resumo

A técnica aqui descrita pode ser usada para identificar isoformas específicas da cadeia pesada de miosina (MHC) em segmentos de fibras musculares individuais usando dot blotting, doravante referido como detecção de cadeia pesada de Myosin por Do t Blotting for IDentification of muscle fiber type (MyDoBID). Este protocolo descreve o processo de liofilização do músculo esquelético humano e o isolamento de segmentos de fibras musculares únicas. Usando MyDoBID, as fibras do tipo I e II são classificadas com anticorpos MHCI- e IIa-específicos, respectivamente. As fibras classificadas são então combinadas em amostras específicas do tipo de fibra para cada biópsia.

A proteína total em cada amostra é determinada por eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil-sulfato de sódio (SDS-PAGE) e tecnologia de gel ativado por UV. O tipo de fibra das amostras é validado usando western blotting. A importância de realizar a normalização da carga proteica para melhorar a detecção de proteínas-alvo em vários western blots também é descrita. Os benefícios da consolidação de fibras classificadas em amostras específicas do tipo de fibra em comparação com as blots ocidentais de fibra única incluem versatilidade da amostra, maior rendimento da amostra, menor investimento de tempo e medidas de economia de custos, tudo isso enquanto retém informações valiosas específicas do tipo de fibra que são frequentemente negligenciadas usando amostras musculares homogeneizadas. O objetivo do protocolo é obter a identificação precisa e eficiente de fibras tipo I e tipo II isoladas de amostras de músculo esquelético humano liofilizado.

Essas fibras individuais são posteriormente combinadas para criar amostras específicas do tipo I e do tipo II de fibras. Além disso, o protocolo é estendido para incluir a identificação de fibras do tipo IIx, usando Actina como marcador para fibras negativas para MHCI e MHCIIa, que são confirmadas como fibras IIx por western blotting. Cada amostra específica do tipo de fibra é então usada para quantificar a expressão de várias proteínas-alvo usando técnicas de western blotting.

Introdução

O músculo esquelético é um tecido heterogêneo, com propriedades metabólicas e contráteis celulares distintas que dependem se a célula (fibra) é de contração lenta (tipo I) ou contração rápida (tipo II). O tipo de fibra pode ser identificado examinando-se as isoformas da cadeia pesada da miosina (MHC), que diferem entre si de várias maneiras, incluindo tempo de contração, velocidade de encurtamento e resistência à fadiga¹. As principais isoformas de MHC incluem tipo I, tipo IIa, tipo IIb e tipo IIx e seus perfis metabólicos são oxidativos (tipo I e IIa) ou glicolíticos (IIx, IIb)¹. A proporção desses tipos de fibras varia no tipo muscular e entre as espécies. O tipo IIb é amplamente encontrado no músculo de roedores. A musculatura humana não contém fibras do tipo IIb e é constituída predominantemente pelas isoformas MHC do tipo I e IIa, com pequena proporção de fibras IIx². Os perfis de expressão proteica variam entre os diferentes tipos de fibras e podem ser alterados com o envelhecimento³, exercício ^4,5 e doença 6.

A medição das respostas celulares em diferentes tipos de fibras musculares esqueléticas é frequentemente negligenciada ou não é possível devido ao exame de homogeneizados musculares (uma mistura de todos os tipos de fibras). O western blot de fibra única permite a investigação de múltiplas proteínas em fibras musculares individuais⁷. Esta metodologia foi previamente utilizada para produzir características novas e informativas de monofibra que não foram possíveis de obter usando preparações homogeneizadas. No entanto, existem algumas limitações da metodologia original de western blot de fibra única, incluindo a natureza demorada, a incapacidade de gerar réplicas de amostra e o uso de reagentes de quimioluminescência aprimorada (ECL) caros e sensíveis. Se o tecido fresco está sendo usado, este método é ainda mais limitado devido às restrições de tempo da necessidade de isolar fibras individuais dentro de um período de tempo limitado (ou seja, 1-2 h). Felizmente, essa restrição é atenuada pelo isolamento de segmentos monofibrosos do tecido liofilizado⁸. No entanto, a coleta de fibras de amostras liofilizadas é limitada pelo tamanho e qualidade do tecido biopsiado.

A identificação do tipo de fibra usando o método dot blotting⁹ foi significativamente elaborada e expandida neste protocolo abrangente. Previamente, foi demonstrado que apenas ~2-10 mg de tecido muscular de peso úmido é adequado para liofilização e análise de proteína de isoforma MHC de fibra única⁹. Christensen et ^al.9 utilizaram 30% de um segmento de fibra de ~1 mm para detectar a isoforma MHC presente por dot blotting, o que foi confirmado por western blotting. Este trabalho mostrou que, ao substituir o western blotting pelo dot blotting, os custos totais foram reduzidos em ~40 vezes (para 50 segmentos de fibra). As fibras foram então "agrupadas" em amostras do tipo I e tipo II, o que permitiu a replicação experimental⁹. No entanto, uma limitação foi que apenas duas amostras específicas do tipo de fibra foram obtidas: tipo I (MHCI positivo) e tipo II (MHCII positivo), com amostras do tipo II contendo uma mistura de MHCIIa e MHCIIx ^6,10. Notavelmente, o protocolo atual demonstra como as fibras do tipo IIx puras podem ser identificadas e fornece um fluxo de trabalho altamente detalhado (resumido na Figura 1), incluindo estratégias de solução de problemas para problemas comuns de protocolo.

Protocolo

Amostras de músculo humano foram obtidas do vasto lateral de n = 3 (2 homens, 1 mulher), com idade entre 70 e 74 anos, em condições estéreis, utilizando-se anestesia local (xilocaína) e agulha de Bergstrom modificada para sucção manual^11,12. As amostras foram um subconjunto de um estudo prévio aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos da Victoria University (HRETH11/221) e conduzido de acordo com a Declaração de Helsinque¹³. Os participantes assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido para participar deste estudo. Todos os detalhes de todos os materiais necessários para este protocolo são mostrados na Tabela de Materiais. Além disso, uma lista de estratégias de solução de problemas que abordam problemas comuns de protocolo é fornecida na Tabela 1.

1. Liofilização

1. Enquanto mantém as amostras musculares biopsiadas congeladas em gelo seco, pesar e amarrar um tubo congelado vazio na balança.
2. Pesar rapidamente um mínimo de 10 mg de tecido congelado de peso úmido. Registre o peso com uma casa decimal.
3. Deposite o tecido no tubo de microcentrífuga pré-resfriado que teve 3-4 furos perfurados na tampa e coloque-o em um pequeno copo com 2-3 pellets de gelo seco.
4. Siga as instruções de operação do fabricante do liofilizador.
5. Certifique-se de que todas as válvulas do liofilizador estão fechadas e ligue o liofilizador.
6. Use o painel de controle para verificar se o ponto de ajuste de vácuo está programado para condições ideais de liofilização para o tecido humano, 0,12 milibar (mBar) (Figura 2).
7. Pressione manualmente no liofilizador e aguarde até que a câmara tenha esfriado a -40 ^oC.
8. Uma vez que a câmara tenha atingido essa temperatura, remova a tampa, depois a câmara de vidro e coloque o copo (com amostra muscular) no palco de metal.
9. Substitua a câmara de vidro e a tampa. Feche a válvula de liberação de vácuo na tampa e aguarde até que a luz da balança de vácuo fique verde para garantir que o secador esteja selado a vácuo.
10. Liofilizar as amostras musculares por 48 h. Quando a liofilização estiver concluída, desligue a bomba de vácuo pressionando o botão de vácuo e abra a válvula de liberação de vácuo na tampa.
11. Retire a tampa da câmara e recolha a amostra liofilizada. Pese o tecido e registre o peso com uma casa decimal.
12. Calcular a porcentagem de perda de peso; ~75% de diminuição no peso indica que o tecido é liofilizado com sucesso (neste trabalho, média ± DP, 76 ± 9%, n = 11 amostras musculares).
13. Pressione AUTO para desligar a bomba de vácuo e o freezer. Permita que a unidade atinja a temperatura ambiente.
14. Limpe as bobinas de resfriamento de acordo com as instruções do fabricante e escorra o líquido acumulado do coletor.
    NOTA: A coleta de fibra pode começar imediatamente. Quando o tecido não estiver sendo usado para isolamento de fibras, mantenha a amostra liofilizada a -80 °C em um recipiente selado com esferas de exsicador.  CUIDADO: O gelo seco é perigoso (Classe 9); consulte a FISPQ para obter o manuseio seguro recomendado.

2. Coleta de fibras

1. Preparação da coleta de fibras
   1. Rotular um mínimo de 50 tubos de microfuga (Fibra 1 a 50) e pipetar 10 μL de tampão desnaturante para cada tubo.
   2. Preparar a área de coleta com dois pares de pinças dissecadoras de tecido fino, tecido sem fiapos, lâmpada de bancada, estereomicroscópio (com o estágio preto para cima), vórtice e centrífuga de bancada.
   3. Coloque a amostra de músculo liofilizado em uma tampa de placa de Petri. Coloque a tampa no palco do microscópio dissecante.
   4. Assista ao vídeo da dissecção de fibra única. Pratique o protocolo completo desde a coleta de fibras até a identificação do tipo de fibra única pelo menos duas vezes antes de iniciar um estudo.
   5. Antes da coleta de fibras, calcule o volume total necessário para uma amostra do tipo fibra de cada biópsia da seguinte maneira. Por exemplo, se o volume inicial de 1 fibra = 10 μL e o volume restante após MyDoBID for (1 fibra × 10 μL) - 1 μL usado para dot blotting = 9 μL (volume de amostra), calcule o volume total de amostra necessário multiplicando o volume de amostra (μL) pelo número total de western blots que serão executados e dobre esse valor para explicar a redundância: (9 μL × 4 western blots) × 2 = 72 μL. Calcule o número de fibras necessárias por amostra tipada dividindo o volume final de amostra necessário (μL) pelo volume de amostra por amostra específica do tipo de fibra (por exemplo, 72 μL ÷ 9 μL = 8 fibras por amostra específica do tipo de fibra). Para que isso seja alcançado, colete um total de 50 fibras.
      NOTA: O volume de amostra necessário é a concentração mínima de proteína necessária para executar o MyDoBID e o western blotting se a quantidade de proteína carregada for equivalente a uma fibra de ~3 mm (~12 μg de peso úmido) para cada amostra (consulte o Arquivo Suplementar 1 para obter detalhes). No entanto, esse volume não leva em consideração se géis repetidos são necessários para uma determinada proteína.  CUIDADO: As pinças são afiadas; Manuseiá-los com cuidado para evitar o risco de perfuração da pele.
2. Isolamento de fibra única
   1. Em um pequeno pedaço de papel de 5 cm x 1 cm, use uma régua para desenhar uma linha de 1 cm. Marque a cada 1 mm nessa linha.
   2. Inserir sob a tampa da placa de Petri como guia para estimar o comprimento das fibras coletadas.
   3. Colocar a amostra de músculo liofilizado sob o estereomicroscópio em pequena magnificação (x 7,5). Use um par de pinças dissecadoras de tecido fino para manter o músculo liofilizado no lugar e com o outro comece a separar pequenos feixes de fibras (como visto no vídeo).
   4. Isole um feixe de fibras e continue a separar até que segmentos únicos de fibra sejam isolados do feixe.
   5. Coletar um mínimo de 50 fibras que tenham pelo menos ~1 mm de comprimento.
   6. Mova a fibra para um espaço vazio na placa de Petri. Inspecione segmentos de fibra única sob maior ampliação (x 50). Certifique-se de que é uma única fibra, separando ainda mais a fibra na extremidade. Se a fibra quebra em vez de se separar, é uma única fibra.
3. Desnaturação de fibras
   1. Usando pinças, colete suavemente a fibra e coloque-a diretamente no tampão desnaturante aliquotado (não deixe a pinça encontrar o tampão).
   2. Verifique a pinça sob o microscópio para garantir que a fibra foi removida com sucesso. Feche o tubo e bata firmemente o fundo do tubo no banco três vezes para garantir que a fibra se mova para o tampão.
   3. Limpe a pinça usando tecido sem fiapos antes de passar para a próxima fibra. Repita esse processo até que todas as fibras sejam coletadas.
   4. Vórtice as amostras de fibra e centrifugue brevemente por 5 s a 2.500 × g para puxar a amostra para o fundo do tubo.
      NOTA: A duração da centrifugação (5 s) é cronometrada desde o início (0 × g) até que a velocidade atinja ~2.500 × g.
   5. Deixar as amostras à temperatura ambiente durante 1 h. Conservar a -80 °C para utilização futura. Congelar e depois descongelar as amostras antes de usar.

3. Ponto blotting

1. Preparo e ativação de membranas
   1. Meça, rotule e corte para dimensionar uma membrana de difluoreto de polivinilideno (PVDF) (tamanho de poro de 0,2 μm) para caber 50 amostras (~10,5 cm x 5,5 cm).
   2. Marque a borda esquerda numericamente de cima para baixo (1 a 10) e a borda superior em ordem alfabética da esquerda para a direita (A a E) espaçada 1 cm de distância.
   3. Prepare quatro folhas de papel filtro com as dimensões de 12,5 cm x 7,5 cm.
   4. Amontoe duas folhas para formar uma pilha. Pré-mergulhe a pilha de papel de filtro em 1x buffer de transferência.
   5. Coloque a membrana em um recipiente. Despeje etanol 95% sobre a membrana, com volume suficiente para imergir totalmente a membrana (10-15 mL). Agite no balancim por 1 min.
   6. Recolha novamente o etanol, mergulhe a membrana em 1x tampão de transferência (~15 mL) e rocha por mais 2 min.
      NOTA: Tanto o etanol quanto o tampão de transferência podem ser reutilizados para futuros experimentos de dot blotting até que a sedimentação se forme (mudança após seis usos).
   7. Coloque a pilha de papel de filtro embebida em buffer de transferência em uma superfície plana móvel, como uma tampa grande, e achate com o rolo. Posicione a membrana de PVDF na pilha usando um liberador de gel ou uma pinça.
   8. Coloque uma única folha de papel de filtro seco sobre a membrana e mova o rolo sobre o papel de filtro para absorver qualquer excesso de tampão na superfície da membrana. Retire o papel de filtro superior sem esfregar a membrana.
      CUIDADO: O metanol (Classe 3, sub-risco 6.1) e o etanol (Classe 3) são perigosos. Consulte a ficha de dados de segurança do material (FISPQ) para obter recomendações de manuseio seguro.
2. Absorção da amostra para a membrana
   1. Descongelar as amostras de fibras, efectuar uma breve centrifugação (5 s) à temperatura ambiente como no passo 2.3.4 e misturar bem a amostra.
   2. Sem tocar a membrana com a ponta da pipeta, deposite lentamente uma gota de ~1 μL de cada amostra na membrana na área designada. As dimensões da área designada por amostra de fibra são ~1 cm x 1 cm. Procure identificar a amostra no centro desta área.
   3. Deixe as gotículas da amostra de molho através da membrana por pelo menos 15 min. Certifique-se de que nenhum buffer de amostra permaneça e seja completamente absorvido.
   4. Usando pinças de plástico, levante cuidadosamente a membrana da pilha de papel de filtro úmida, coloque-a em uma única folha seca de papel de filtro e desidrate a membrana por pelo menos 5 minutos.
   5. Quando os pontos da amostra ficarem completamente brancos, reative a membrana.
3. Reativação e bloqueio da membrana
   1. Reactivar a membrana repetindo os passos 3.1.5 e 3.1.6.
   2. Coloque a membrana em tampão de lavagem e enxágue por 5 min com balanço. Descarte o tampão de lavagem.
   3. Incubar a membrana em tampão de bloqueio por 30 min enquanto balança.
   4. Enxágue a membrana 3x com tampão de lavagem até que o tampão não esteja mais turvo.
   5. Deixe a membrana na lavagem final no balancim.

4. Imunomarcação

1. Detecção de MHCIIa
   1. Diluir o anticorpo primário MHCIIa a 1 em 200 em 10 mL de tampão de albumina de soro bovino (BSA).
   2. Descarte o tampão de lavagem da membrana e, em seguida, despeje o anticorpo MHCIIa diluído na membrana.
   3. Coloque o recipiente (com a membrana em MHCIIa) no balancim à temperatura ambiente durante 2 h ou a 4 °C durante a noite.
   4. Recolher novamente o anticorpo MHCIIa e armazená-lo a 4 °C. Lave a membrana com tampão de bloqueio por 2 min no balancim.
      NOTA: Todos os anticorpos primários podem ser reutilizados até cinco vezes mais, desde que o tampão permaneça limpo.
   5. Enxágue mais duas vezes; 5 min de cada vez; três lavagens no total.
   6. Diluir o anticorpo secundário da Imunoglobulina G Horseradish Peroxidase (IgG-HRP) de camundongo a 1 em 20.000 em 10 mL de tampão de bloqueio e adicionar à membrana.
   7. Descarte o tampão de lavagem e incube a membrana em camundongo IgG-HRP secundário com balanço por 1 h.
   8. Descarte o secundário e lave a membrana em tampão de lavagem (2, 5, 5 min).
   9. Deixe a membrana de molho na lavagem final até ficar pronta para a aquisição de imagens.
   10. Ligue o imageador de gel, aguarde 15 minutos até que o imageador atinja a temperatura de operação necessária e, em seguida, abra o software de imagem (consulte a Tabela de Materiais).
   11. Na janela do software, clique em New Single Channel Protocol (Novo protocolo de canal único ) (Figura 3A). Para uma imagem de luz branca da membrana, em Aplicações | Manchas | clique em Colorimétrico (Figura 3B).
   12. Clique na área do gel; Cada opção é programada para dimensões específicas para se ajustar ao tamanho de vários tipos de gel. Selecione a opção apropriada para melhor se ajustar às dimensões da membrana (Figura 3C).
   13. Preparar a LCE combinando reagentes de luminol e peroxidase na proporção de 1:1. Faça um volume suficiente de mistura de ECL para cobrir toda a membrana, normalmente um volume total de 800-1.000 μL é necessário.
   14. Coloque a membrana em uma grande bandeja de plástico transparente e disperse a mistura de ECL na membrana.
   15. Coloque a membrana sobre a placa de imagem.
   16. Clique em Position Gel (botão amarelo) para uma visualização ao vivo da câmera. Clique em segurar e arraste o botão de zoom para maximizar a área de imagem da membrana. Neste ponto, endireitar a posição da membrana, se necessário.
   17. Clique em Executar protocolo (botão verde) e aguarde até que uma imagem colorimétrica da membrana seja produzida. Salve esta imagem para ajudar a combinar os pontos com a amostra de fibra correspondente.
   18. Sem mover a membrana, altere o aplicativo no software clicando na opção para um binning 2 x 2 (Chemi High Resolution) (Figura 3D).
   19. Em Exposição de imagem e software, otimize o tempo de exposição, clique em Bandas fracas (Figura 3E) | Modo de Acumulação de Sinais.
   20. Em Setup, digite 1 s para a primeira imagem, 30 s para a última imagem e 30 imagens totais (Figura 3F).
   21. Clique em Executar protocolo.
   22. Salve uma imagem nos seguintes estágios: antes da saturação do sinal (todos os pontos visíveis são pretos), saturação inicial do sinal (alguns pontos começam a saturar) e pontos supersaturados (todos os pontos com sinal forte detectado estão saturados).
   23. Salve todas as imagens necessárias antes de terminar o acúmulo de sinal. Retire a membrana do imageador.
   24. Usando o liberador de gel, coloque a membrana de volta no recipiente com o tampão de lavagem.
2. Detecção de MHCI
   1. Deite o tampão de lavagem e trate a membrana com tampão de remoção durante 30 minutos a 37 °C (certifique-se de que a membrana está completamente imersa).
   2. Recolha novamente o tampão de decapagem e lave a membrana em tampão de lavagem durante 5 minutos com balanço.
      NOTA: O buffer de remoção pode ser reutilizado 10x antes de descartar.
   3. Despeje o tampão de lavagem e, desta vez, aplique o anticorpo primário MHCI diluído em uma concentração inicial de 1 em 200 (intervalo: 1 em 200 a 1 em 500). Balançar a membrana à temperatura ambiente por 1 h.
   4. Após incubar no anticorpo primário MHCI, recolher novamente o anticorpo e lavar a membrana como nos passos 4.1.4 e 4.1.5.
   5. Diluir o anticorpo secundário HRP IgM de camundongo no tampão de bloqueio a 1 em 20.000. Despeje o tampão de bloqueio da membrana e incube na IgM secundária do camundongo como na etapa 4.1.7.
   6. A lavagem e captura de imagens detectou MHCI como nas etapas 4.1.8 a 4.1.24.
      CUIDADO: O tampão de decapagem contém Organo Phosphine 3-5% (Classe 8). Consulte a FISPQ para obter recomendações de manuseio seguro.
3. Detecção de MHCIIx potencial usando Actina
   1. Retire novamente a membrana (passos 4.2.1 e 4.2.2).
   2. Repetir a secção 4.1, desta vez aplicando o anticorpo primário Actin diluído a 1 em 500 em tampão BSA e, em seguida, o anticorpo secundário HRP de coelho diluído a 1 em 20.000 em tampão de bloqueio.

5. Identificação do tipo de fibra

1. Análise de sinais MHCI, MHCIIa e Actin
   1. Familiarize-se com o painel de intensidade de sinal (Figura 4A). Anote as etapas 5.1.2 a 5.1.4.
   2. Uma intensidade de sinal saturada qualitativamente indica que a detecção de proteínas é forte.
   3. Um moderado indica que a proteína-alvo está presente em um nível médio.
   4. Um sinal fraco indica que pouca proteína alvo está presente.
   5. Use o painel de intensidade de sinal para categorizar as fibras com intensidade de sinal 'saturada', 'moderada' ou 'fraca' (Figura 4A).
   6. Realizar a identificação do tipo de fibra comparando primeiro os resultados de MHCIIa e MHCI (Figura 4B, borrões esquerdo e médio).
   7. Registrar fibras com intensidade de sinal saturada ou moderada de apenas uma isoforma do MHC.
   8. Se o sinal da isoforma MHC for "fraco", deixe a fibra sem marcação (ver Figura 4B).
   9. Por fim, quando a actina for observada (intensidade de sinal moderada ou saturada) nas fibras sem MHCI ou IIa detectadas, registe-a como uma potencial fibra do tipo IIx (Figura 4B, right blot).
   10. Registrar fibras com fraco sinal de isoforma MHC, mas Actina detectada (intensidade moderada ou saturada) como não identificada.
   11. Descarte amostras com detecção fraca ou nenhuma (nenhuma fibra coletada) para as três proteínas-alvo (Figura 4C).
   12. Grave qualquer fibra onde os sinais MHCI e MHCII são detectados com um sinal "saturado" ou moderado. Essas amostras não são para uso em preparação específica do tipo de fibra.
2. Preparação de amostras específicas do tipo de fibra
   1. Preparar uma amostra separada do tipo I e do tipo II para cada biópsia. Para uma amostra do tipo II, combinar o número mínimo necessário de fibras (calculado no passo 2.1.5) em que o MHCIIa é detectado em níveis saturados ou moderados.
   2. Em um tubo separado marcado como tipo I, repita esse processo para as fibras nas quais MHCI é detectado (Figura 4D).
   3. Use fibras com intensidade de sinal moderada se não houver fibras suficientes com sinais saturados.
   4. Combine quaisquer fibras IIx potenciais.
   5. Use imediatamente amostras específicas do tipo de fibra para western blotting ou armazene-as a -80 °C para uso futuro.

6. Confirmação do tipo de fibra Western blot

1. Utilizar 10 μL de cada amostra específica do tipo de fibra (o volume mínimo de amostra necessário, ver passo 2.1.5).
2. Separe as amostras usando o gel pré-moldado especificado via SDS-PAGE de acordo com o protocolo do fabricante.
3. Use um imageador de gel para detectar a proteína no gel de acordo com o protocolo do fabricante.
4. Coloque o gel em tampão de transferência frio de 1x por 10 min.
5. A umidade transfere as proteínas para uma membrana de nitrocelulose de 0,45 μm (9,5 cm x 13,5 cm) de acordo com o protocolo do fabricante.
6. Após a transferência, lave brevemente a membrana com H₂O ultrapuro em um recipiente. Despeje a água ultrapura.
7. Adicionar 10 mL de solução intensificadora de sinal de anticorpos à membrana e rocha à temperatura ambiente por 10 min.
8. Recolher a solução potenciadora de sinal de anticorpos e lavar 5x (5 s por lavagem) com H₂O ultrapuro.
   NOTA: A solução realçadora de sinal de anticorpos pode ser usada 5x antes de descartar.
9. Despeje a última lavagem, adicione a solução de bloqueio e agite em temperatura ambiente por 1 h.
10. Use uma lâmina de bisturi ou tesoura limpa para cortar horizontalmente a membrana a um peso molecular que garanta que as proteínas com 180 kDa ou acima estejam na seção superior da membrana.
11. Use esta seção superior para confirmação adicional do tipo de fibra.
12. Use a porção abaixo de 180 kDa para detectar diferentes proteínas-alvo.
13. Na secção superior da membrana, siga a secção 4.1 com MHCIIx primário e anticorpo secundário HRP para a imunoglobulina M (IgM) em ratinhos.
14. Retirar a membrana (conforme descrito nas secções 4.2.1 e 4.2.2) antes de repetir o processo com o anticorpo MHCIIa IgG primário e o anticorpo secundário IgG HRP de ratinho.
15. Retirar mais uma vez e, finalmente, aplicar o anticorpo MHCI IgM primário e o anticorpo secundário IgM HRP de camundongo.
    NOTA: Esta etapa é qualitativa e, portanto, qualquer perda de proteína devido à remoção de membrana não é uma preocupação.
16. Comparar o sinal detectado nas diferentes isoformas do MHC (como visto na Figura 5B). Quando a intensidade de sinal for detectada em níveis moderados a saturados na amostra esperada (MHCI - tipo I, MHCIIa - tipo II e MHCIIx - tipo IIx) as amostras específicas do tipo fibra serão registradas como confiáveis para uso em estudos futuros.
17. Registrar a amostra como não confiável quando mais de uma isoforma MHC é igualmente detectada em uma amostra.
    CUIDADO: Solução potenciadora de anticorpos contém hidróxido de sódio a 50%. Consulte a FISPQ para obter recomendações de manuseio seguro.

Resultados

Identificação de fibras musculares MHCI, MHCIIa e MHCIIx individuais usando dot blotting
Uma característica do MyDoBID é a categorização da variação da intensidade de sinal MHC e Actina em uma dada fibra (Figura 4A). O tipo de fibra foi identificado pela presença ou ausência das isoformas MHCI e IIa (Figura 4B). Seis fibras não apresentaram detecção de MHC ou actina, indicando que não houve coleta de fibras. Os resultados desse ...

Discussão

Coleção de fibras
Com base em vários anos de experiência, a maioria dos pesquisadores pode dominar essa técnica; no entanto, a prática leva a uma coleta de fibra mais rápida e eficiente para análises a jusante. Para poder isolar 30 segmentos de fibra única de qualidade para pooling, recomenda-se que sejam coletados 50 segmentos de fibra por amostra. Estudar o vídeo de coleta de fibras cuidadosamente e depois de realizar duas sessões de prática (~50 fibras por sessão) é recomendado para a...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x Denaturing buffer	Make according to recipe	Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributing companies	1x denaturing buffer is made by diluting 3x denaturing buffer 1 in 3 v/v with 1X Tris-HCl (pH 6.8). Store at -20 °C.
3x Denaturing buffer	Make according to recipe	Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributors	3x denaturing buffer contains: 0.125M Tris-HCI, 10% glycerol, 4% SDS, 4 M urea, 10% 2-mercaptoethanol, and 0.001% bromophenol blue, pH 6.8.  Store at -20 °C.
95% Ethanol	N/A	100% ethanol can be sourced from any company	Diluted to 95% with ultra-pure H2O.
Actin rabbit polyclonal antibody	Sigma-Aldrich	A2066	Dilute 1 in 1,000 with BSA buffer.
Analytical scales	Mettler Toledo	Model number: MSZ042101
Antibody enhancer	Thermo Fischer Scientific	32110	Product name is Miser Antibody Extender Solution NC.
Beaker (100 mL)	N/A	N/A
Benchtop centrifuge	Eppendorf	5452	Model name: Mini Spin.
Blocking buffer: 5% Skim milk in Wash buffer.	Diploma	Store bought
BSA buffer: 1 % BSA/PBST, 0.02 % NaN3	BSA: Sigma-Aldrich              PBS: Bio-Rad Laboratories. NaN3 : Sigma-Aldrich	BSA: A6003-25G                         10x PBS: 1610780                       NaN3: S2002	Bovine serum albumin (BSA), Phosphate-buffered saline (PBS), and Sodium azide (NaN3). Store at 4 °C.
Cassette opening lever	Bio-Rad Laboratories	4560000	Used to open the precast gel cassettes.
Chemidoc MP Imager	Bio-Rad Laboratories	Model number: Universal hood III	Any imaging system with Stain-Free gel imaging capabilities.
Criterion blotter	Bio-Rad Laboratories	1704070	Includes ice pack, transfer tray, roller, 2 cassette holders, filter paper, foam pads and lid with cables.
Criterion Cell (Bio-Rad)	Bio-Rad Laboratories	1656001
ECL (enhanced chemiluminescence)	Bio-Rad Laboratories	1705062	Product name: Clarity Max Western ECL Substrate.
Electrophoresis buffer 1x Tris Glycine SDS (TGS)	Bio-Rad Laboratories	1610772	Dilute 10x TGS 1 in 10 with ultra-pure H2O.
Filter paper, 0.34 mm thick	Whatmann	3030917	Bulk size 3 MM, pack 100 sheets, 315 x 335 mm.
Fine tissue dissecting forceps	Dumont	F6521-1EA	Jeweller’s forceps no. 5.
Flat plastic tray/lid	N/A	N/A	Large enough to place the membrane on. Ensure the surface is completely flat.
Freeze-drying System	Labconco	7750030	Freezone 4.5 L with glass chamber sample stage.
Freezer -80 oC	N/A	N/A	Any freezer with a constant temperature of -80 °C is suitable.
Gel releasers	1653320	Bio-Rad	Slide under the membrane to gather or move the membrane.
Grey lead pencil	N/A	N/A
Image lab software	Bio-Rad Laboratories	N/A	Figures refers to software version 5.2.1 but other versions can used.
Incubator	Bio-Rad Laboratories	1660521	Any incubator that can be set to 37 °C would suffice.
Lamp	N/A	N/A
Magnetic stirrer with flea	N/A	N/A
Membrane roller	Bio-Rad Laboratories	1651279	Can be purchased in the Transfer bundle pack. However, if this product is not available, any smooth surface cylindrical tube long enough to roll over the membrane would suffice.
Microcentrifuge tubes  (0.6 mL)	N/A	N/A
Mouse IgG HRP secondary	Thermo Fisher Scientific	31430	Goat anti-Mouse IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilute at 1 in 20,000 in blocking buffer.
Mouse IgM HRP secondary	Abcam	ab97230	Goat Anti-Mouse IgM mu chain. Use at the same dilution as mouse IgG.
Myosin Heavy Chain I (MHCI) primary antibody	DSHB	A4.840	Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.
Myosin Heavy Chain IIa (MHCIIa) primary antibody	DSHB	A4.74	Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.
Myosin Heavy Chain IIx (MHCIIx) primary antibody	DSHB	6H1	Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.
Nitrocellulose Membrane 0.45 µm	Bio-Rad Laboratories	1620115	For Western blotting.
Petri dish lid	N/A	N/A
Plastic tweezers	N/A	N/A
Power Pack	Bio-Rad Laboratories	164-5050	Product name: Basic power supply.
Protein ladder	Thermo Fisher Scientific	26616	PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa.
PVDF Membrane 0.2 µm	Bio-Rad Laboratories	1620177
Rabbit HRP secondary	Thermo Fisher Scientific	31460	Goat anti-Rabbit IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilution same as mouse secondary antibodies.
Rocker	N/A	N/A
Ruler	N/A	N/A
Scissors	N/A	N/A
Stereomicroscope	Motic	SMZ-168
Stripping buffer	Thermo Fisher Scientific	21059	Product name: Restore Western Blot Stripping Buffer.
Tissue (lint free)	Kimberly-Clark professional	34120	Product name: Kimwipe.
Transfer buffer (1x Tris Glycine buffer (TG), 20% Methanol)	TG: Bio-Rad Laboratories   Methanol: Merck	TG buffer: 1610771           Methanol: 1.06018	dilute 10x TG buffer with ultra-pure H2O to 1x. Add 100% Methanol to a final concentration of 20% Methanol. Store at 4 °C.
Transfer tray	Bio-Rad Laboratories	1704089
UV-activation precast gel	Bio-Rad Laboratories	5678085	Gel type: 4–15% Criterion TGX Stain-Free Protein Gel, 26 well, 15 µL.
Vortex	N/A	N/A
Wash buffer (1x TBST)	10x TBS: Astral Scientific  Tween 20: Sigma	BIOA0027-4L	1x TBST recipe: 10x Tris-buffered saline (TBS) is diluted down to 1x with ultra-pure H2O, Tween 20 is added to a final concentration of 0.1%. Store buffer at 4 °C.
Wash containers	Sistema	Store bought	Any tupperware container, that suits the approximate dimensions of the membrane would suffice.