인체 골격근의 섬유 유형 식별

요약

이 프로토콜은 동결 건조된 인간 골격근에서 단일 섬유 분리 및 도트 블로팅 기술을 사용하여 미오신 중쇄(MHC) 동형에 따른 섬유 유형 분류를 보여줍니다. 확인된 MHC I 및 II 섬유 샘플은 웨스턴 블로팅을 사용하여 단백질 발현의 섬유 유형별 차이에 대해 추가로 분석할 수 있습니다.

초록

여기에 설명된 기술은 도트 블로팅(dot blotting)을 사용하여 개별 근육 섬유의 세그먼트에서 특정 미오신 중쇄(MHC) 동형을 식별하는 데 사용할 수 있으며, 이하 MyDoBID(Do t Blotting for IDentification of muscle fiber type)에 의한 Myosin 중쇄 검출이라고 합니다. 이 프로토콜은 인간의 골격근을 동결 건조시키고 단일 근육 섬유의 세그먼트를 분리하는 과정을 설명합니다. MyDoBID를 사용하여 유형 I 및 II 섬유는 각각 MHCI 및 IIa 특이적 항체로 분류됩니다. 그런 다음 분류된 섬유는 각 생검을 위해 섬유 유형별 샘플로 결합됩니다.

각 샘플의 총 단백질은 SDS-PAGE(Sodium Dodecyl-Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis) 및 UV 활성 겔 기술에 의해 결정됩니다. 섬유 유형의 샘플은 웨스턴 블로팅을 사용하여 검증됩니다. 여러 웨스턴 블롯에서 표적 단백질 검출을 향상시키기 위해 단백질 로딩 정규화를 수행하는 것의 중요성도 설명합니다. 단일 섬유 웨스턴 블롯과 비교하여 분류된 섬유를 섬유 유형별 샘플로 통합하면 시료의 다양성, 시료 처리량 증가, 투자 시간 단축 및 비용 절감 조치의 이점이 있으며, 균질화된 근육 시료를 사용하여 자주 간과되는 중요한 섬유 유형별 정보를 유지할 수 있습니다. 프로토콜의 목적은 동결 건조된 인간 골격근 샘플에서 분리된 유형 I 및 유형 II 섬유를 정확하고 효율적으로 식별하는 것입니다.

이러한 개별 섬유는 이후에 결합되어 유형 I 및 유형 II 섬유 유형별 샘플을 생성합니다. 또한, 프로토콜은 웨스턴 블로팅에 의해 IIx 섬유로 확인된 MHCI 및 MHCIIa에 대해 음성인 섬유에 대한 마커로 Actin을 사용하여 IIx 유형 섬유의 식별을 포함하도록 확장됩니다. 그런 다음 각 섬유 유형별 샘플을 사용하여 웨스턴 블로팅 기법을 사용하여 다양한 표적 단백질의 발현을 정량화합니다.

서문

골격근은 세포(섬유)가 느린 경련(유형 I)인지 빠른 경련(유형 II)인지에 따라 달라지는 뚜렷한 세포 대사 및 수축 특성을 가진 이질적인 조직입니다. 섬유 유형은 수축 시간, 단축 속도 및 피로 저항을 포함하여 여러 면에서 서로 다른 미오신 중쇄(MHC) 동형을 검사하여 식별할 수 있습니다¹. 주요 MHC 동형에는 유형 I, 유형 IIa, 유형 IIb 및 유형 IIx가 포함되며 대사 프로파일은 산화(유형 I 및 IIa) 또는 해당작용(IIx, IIb)^입니다1. 이러한 섬유 유형의 비율은 근육 유형과 종에 따라 다릅니다. IIb형은 설치류 근육에서 널리 발견됩니다. 인체 근육은 IIb형 섬유를 포함하지 않으며 주로 MHC 동형 I형 및 IIa 섬유로 구성되며 IIx 섬유의 비율은 적습니다². 단백질 발현 프로파일은 섬유질 유형에 따라 다르며 노화^{3, 운동4,5} 및 질병⁶에 따라 변경될 수 있습니다.

다양한 골격근 섬유 유형에서 세포 반응을 측정하는 것은 근육 균질화(모든 섬유 유형의 혼합)의 검사로 인해 종종 간과되거나 불가능합니다. 단일 섬유 웨스턴 블롯은 개별 근육 섬유에서 여러 단백질을 조사할 수 있습니다⁷. 이 방법론은 이전에 균질한 제제를 사용하여 얻을 수 없었던 새롭고 유익한 단일 섬유 특성을 생성하는 데 활용되었습니다. 그러나 원래의 단일 섬유 웨스턴 블롯 방법론에는 시간이 많이 걸리는 특성, 샘플 복제를 생성할 수 없음, 고가의 고감도 ECL(enhanced chemiluminescence) 시약 사용 등 몇 가지 한계가 있습니다. 신선한 조직을 사용하는 경우 이 방법은 제한된 시간(즉, 1-2시간) 내에 개별 섬유를 분리해야 하는 시간 제약으로 인해 더욱 제한됩니다. 다행히도, 이러한 억제는 동결 건조된 조직으로부터 단일 섬유 분절을 분리함으로써 완화된다⁸. 그러나 동결 건조된 샘플에서 섬유를 수집하는 것은 생검 조직의 크기와 품질에 의해 제한됩니다.

도트 블로팅 방법(dot blotting method⁾⁹을 이용한 섬유 유형 식별은 이 포괄적인 프로토콜에서 상당히 정교화되고 확장되었다. 이전에, 2~10 mg의 습식 근육 조직이 동결 건조 및 단일 섬유 MHC 동형 단백질 분석에 적합하다는 것이 입증되었다⁹. Christensen et ^al.9은 ~1mm 섬유 세그먼트의 30%를 사용하여 도트 블로팅에 의해 존재하는 MHC 동형을 검출했으며, 이는 웨스턴 블로팅으로 확인되었습니다. 이 연구는 웨스턴 블로팅을 도트 블로팅으로 대체함으로써 전체 비용이 ~40배(50개 섬유 세그먼트의 경우) 감소했음을 보여주었습니다. 그런 다음 섬유를 유형 I 및 유형 II 샘플로 "통합"하여 실험적 복제를 허용했습니다⁹. 그럼에도 불구하고 한계는 유형 I(MHCI 양성) 및 유형 II(MHCII 양성 섬유)의 두 가지 섬유 유형 특이적 샘플만 획득되었으며 유형 II 샘플에는 MHCIIa와 MHCIIx ^6,10의 혼합물이 포함되어 있습니다. 특히, 현재 프로토콜은 순수 IIx 유형 광섬유를 식별하는 방법을 보여주며 일반적인 프로토콜 문제에 대한 문제 해결 전략을 포함하여 매우 상세한 워크플로(그림 1에 요약됨)를 제공합니다.

프로토콜

인간 근육 샘플은 국소 마취 (Xylocaine) 및 수동 흡입을 위해 수정 된 Bergstrom 바늘을 사용하여 무균 조건에서 70-74 세의 n = 3 (남성 2 명, 여성 1 명)의 vastus lateralis에서 얻었다^11,12. 샘플은 빅토리아 대학교 인간 연구 윤리 위원회(HRETH11/221)에서 승인하고 헬싱키 선언¹³에 따라 수행된 이전 연구의 하위 집합이었습니다. 참가자는 이 연구에 참여하기 위해 서면 동의서를 제공했습니다. 이 프로토콜에 필요한 모든 재료에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나와 있습니다. 또한 일반적인 프로토콜 문제를 해결하는 문제 해결 전략 목록이 표 1에 나와 있습니다.

1. 동결 건조

1. 생검된 근육 샘플을 드라이아이스에 냉동 상태로 유지하면서 체중을 측정하고 저울에 빈 냉동 튜브를 올려 놓습니다.
2. 최소 10mg의 습식 냉동 티슈를 빠르게 계량합니다. 가중치를 소수점 이하 한 자리까지 기록합니다.
3. 뚜껑에 3-4개의 구멍이 뚫린 미리 냉각된 미세 원심분리기 튜브에 조직을 넣고 드라이아이스 펠릿 2-3개가 있는 작은 비커에 넣습니다.
4. 동결 건조기 제조업체의 작동 지침을 따르십시오.
5. 동결 건조기의 모든 밸브가 닫혀 있는지 확인하고 동결 건조기를 켭니다.
6. 제어판을 사용하여 진공 설정점이 인체 조직에 대한 최적의 동결 건조 조건( 0.12mBar) 으로 프로그래밍되었는지 확인합니다(그림 2).
7. 동결 건조기의 설명서를 누르고 챔버가 -40 ^oC로 냉각될 때까지 기다립니다.
8. 챔버가 해당 온도에 도달하면 뚜껑을 제거한 다음 유리 챔버를 제거하고 비커(근육 샘플 포함)를 금속 스테이지에 놓습니다.
9. 유리 챔버와 뚜껑을 교체합니다. 뚜껑의 진공 해제 밸브를 닫고 진공 눈금 표시등이 녹색으로 바뀔 때까지 기다렸다가 건조기가 진공 밀봉되었는지 확인합니다.
10. 근육 샘플을 48시간 동안 동결 건조합니다. 동결 건조가 완료되면 진공 버튼을 눌러 진공 펌프를 끄고 뚜껑의 진공 해제 밸브를 엽니다.
11. 챔버의 뚜껑을 제거하고 동결 건조된 샘플을 수집합니다. 조직의 무게를 측정하고 소수점 이하 한 자리까지 무게를 기록합니다.
12. 체중 손실 비율을 계산하십시오. ~75%의 체중 감소는 조직이 성공적으로 동결 건조되었음을 나타냅니다(이 연구에서 평균 ± SD, 76 ± 9%, n = 11개의 근육 샘플).
13. AUTO를 눌러 진공 펌프와 냉동고를 끕니다. 장치가 주변 온도에 도달하도록 합니다.
14. 제조업체의 지침에 따라 냉각 코일을 청소하고 수집기에서 축적된 액체를 배출하십시오.
    알림: 섬유 수집은 즉시 시작할 수 있습니다. 섬유 분리를 위해 조직을 사용하지 않을 때는 동결 건조된 샘플을 -80°C에서 건조 비드가 있는 밀봉된 용기에 보관하십시오.  주의 : 드라이 아이스는 위험합니다 (클래스 9). 권장되는 안전한 취급을 위해 MSDS를 참조하십시오.

2. 섬유 수집

1. 섬유 수집 준비
   1. 최소 50개의 미세분리 튜브(Fiber 1 - 50)와 피펫 10μL의 변성 완충액을 각 튜브에 라벨링합니다.
   2. 두 쌍의 미세 조직 해부 집게, 보푸라기가 없는 조직, 탁상용 램프, 실체현미경(검은색 스테이지가 위로 향함), 소용돌이 및 탁상용 원심분리기로 수집 영역을 준비합니다.
   3. 동결 건조된 근육 샘플을 페트리 접시 뚜껑에 놓습니다. s에 뚜껑을 놓습니다.tage 해부 현미경의.
   4. 단일 섬유 해부 비디오를 시청하십시오. 연구를 시작하기 전에 섬유 수집에서 단일 섬유 유형 식별에 이르는 전체 프로토콜을 최소 두 번 연습하십시오.
   5. 섬유를 채취하기 전에 다음과 같이 각 생검에서 섬유형 검체에 필요한 총 부피 를 계산합니다. 예를 들어, 1 fiber의 시작 부피 = 10 μL이고 MyDoBID 후 남은 부피가 (1 fiber × 10 μL) - 도트 블로팅에 사용된 1 μL = 9 μL(샘플 부피)인 경우, 샘플 부피(μL)에 실행할 총 웨스턴 블롯 수를 곱하고 중복성을 고려하여 이 양을 두 배로 늘려 필요한 총 샘플 부피 를 계산합니다. (9 μL × 4 웨스턴 블롯) × 2 = 72 μL. 필요한 최종 샘플 부피(μL)를 섬유 유형별 샘플당 샘플 부피로 나누어 유형화된 샘플당 필요한 섬유 수를 계산합니다(예: 72μL ÷ 9μL = 섬유 유형별 샘플당 8개의 섬유). 이를 위해서는 총 50개의 섬유를 수집해야 합니다.
      참고: 로드된 단백질의 양이 각 샘플에 대해 ~3mm 섬유(~12μg의 습식 중량)와 동일한 경우 필요한 샘플 부피는 MyDoBID와 웨스턴 블로팅을 모두 실행하는 데 필요한 최소 단백질 농도입니다(자세한 내용은 보충 파일 1 참조). 그러나, 이 양은 반복 젤이 주어진 단백질을 위해 요구된다는 것을 고려하지 않습니다.  주의 : 집게는 날카롭습니다. 피부 펑크의 위험을 피하기 위해 주의해서 다루십시오.
2. 단일 광섬유 절연
   1. 5cm x 1cm의 작은 종이에 자를 사용하여 1cm 선을 그립니다. 그 선에 1mm마다 표시하십시오.
   2. 수집된 섬유의 길이를 추정하기 위한 가이드로 이것을 페트리 접시 뚜껑 아래에 삽입하십시오.
   3. 동결 건조된 근육 샘플을 실체현미경 아래에 저배율(x 7.5)로 놓습니다. 한 쌍의 미세 조직 해부 집게를 사용하여 동결 건조된 근육을 제자리에 고정하고 다른 쌍으로 작은 섬유 다발을 분리하기 시작합니다(비디오에서 볼 수 있음).
   4. 섬유 다발 하나를 분리하고 단일 섬유 세그먼트가 다발에서 분리될 때까지 계속 떼어냅니다.
   5. 길이가 최소 ~50mm인 섬유를 1개 이상 수집합니다.
   6. 섬유질을 페트리 접시의 빈 공간으로 옮깁니다. 단일 섬유 세그먼트를 더 높은 배율(x 50)에서 검사합니다. 끝에서 섬유를 추가로 분리하여 단일 섬유인지 확인하십시오. 섬유가 분리되지 않고 끊어지면 단일 섬유입니다.
3. 섬유의 변성
   1. 겸자를 사용하여 섬유를 부드럽게 모아 분취된 변성 완충액에 직접 넣습니다(겸자가 완충액에 닿지 않도록 하십시오).
   2. 현미경으로 집게를 확인하여 섬유가 성공적으로 제거되었는지 확인하십시오. 튜브를 닫고 튜브 바닥을 벤치에 세 번 단단히 두드려 섬유가 완충액으로 이동하는지 확인합니다.
   3. 다음 섬유로 이동하기 전에 보푸라기가 없는 티슈를 사용하여 집게를 깨끗이 닦으십시오. 모든 섬유가 수집될 때까지 이 과정을 반복합니다.
   4. 섬유 샘플을 소용돌이치고 2,500× g 에서 5초 동안 잠시 원심분리하여 샘플을 튜브 바닥으로 끌어당깁니다.
      알림: 원심분리 시간(5초)은 시작(0 ×g)부터 속도가 ~2,500×g에 도달할 때까지 시간이 정해집니다.
   5. 샘플을 실온에 1시간 동안 그대로 둡니다. 나중에 사용할 수 있도록 -80 °C에서 보관하십시오. 사용하기 전에 샘플을 얼렸다가 해동하십시오.

3. 도트 블로팅

1. 멤브레인 준비 및 활성화
   1. 50개의 샘플(~10.5cm x 5.5cm)에 맞도록 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 멤브레인 1개(0.2μm 공극 크기)를 측정, 라벨링 및 절단합니다.
   2. 왼쪽 테두리는 위에서 아래로(1-10) 숫자로 표시하고 위쪽 테두리는 왼쪽에서 오른쪽으로(A에서 E) 알파벳순으로 1cm 간격으로 표시합니다.
   3. 12.5cm x 7.5cm 크기의 여과지 4장을 준비합니다.
   4. 두 장을 함께 쌓아 쌓습니다. 필터 용지 스택을 1x 전사 버퍼에 미리 담그십시오.
   5. 멤브레인을 용기에 넣습니다. 멤브레인 위에 95% 에탄올을 붓고 멤브레인을 완전히 잠글 수 있는 충분한 양(10-15mL)을 붓습니다. 1분 동안 로커를 저어줍니다.
   6. 에탄올을 회수하고 멤브레인을 1x 전달 완충액(~15mL)에 담그고 2분 더 담급니다.
      참고: 에탄올과 전사 완충액은 침전물이 형성될 때까지 향후 도트 블로팅 실험에 재사용할 수 있습니다(6회 사용 후 변경).
   7. 전사 완충액에 적신 여과지 더미를 큰 뚜껑과 같은 평평하고 움직일 수 있는 표면에 놓고 롤러로 평평하게 펴십시오. 젤 이형제 또는 핀셋을 사용하여 스택에 PVDF 멤브레인을 배치합니다.
   8. 멤브레인 위에 마른 여과지 한 장을 놓고 롤러를 여과지 위로 움직여 멤브레인 표면의 과도한 완충액을 흡수합니다. 멤브레인을 문지르지 않고 상단 여과지를 제거합니다.
      주의: 메탄올(3등급, 하위 위험 6.1) 및 에탄올(3등급)은 위험합니다. 안전한 취급 권장 사항은 물질안전보건자료(MSDS)를 참조하십시오.
2. 멤브레인에 시료 흡수
   1. 섬유 샘플을 해동하고 5단계에서와 같이 실온에서 간단한 원심분리기(2.3.4초)를 수행하고 샘플을 완전히 혼합합니다.
   2. 피펫 팁으로 멤브레인을 건드리지 않고 각 샘플의 ~1μL 방울을 지정된 영역의 멤브레인에 천천히 증착합니다. 섬유 샘플당 지정된 영역의 치수는 ~1cm x 1cm입니다. 이 영역의 중앙에서 샘플을 찾는 것을 목표로 합니다.
   3. 샘플 방울이 멤브레인을 통해 최소 15분 동안 스며들도록 합니다. 샘플 버퍼가 남아 있지 않고 완전히 흡수되었는지 확인합니다.
   4. 플라스틱 핀셋을 사용하여 젖은 여과지 스택에서 멤브레인을 조심스럽게 들어 올려 마른 여과지 한 장 위에 놓고 멤브레인을 최소 5분 동안 탈수합니다.
   5. 샘플 스폿이 완전히 흰색으로 변하면 멤브레인을 다시 활성화합니다.
3. 멤브레인 재활성화 및 차단
   1. 3.1.5 및 3.1.6 단계를 반복하여 멤브레인을 다시 활성화합니다.
   2. 멤브레인을 세척 버퍼에 넣고 흔들어 5분 동안 헹굽니다. 세척 버퍼를 버리십시오.
   3. 흔들면서 30분 동안 차단 완충액에 멤브레인을 배양합니다.
   4. 버퍼가 더 이상 흐리지 않을 때까지 세척 버퍼로 멤브레인을 3번 헹굽니다.
   5. 로커의 최종 세척에 멤브레인을 그대로 두십시오.

4. 면역표지

1. MHCIIa 검출
   1. MHCIIa 1차 항체를 소 혈청 알부민(BSA) 완충액 10mL에 200분의 1로 희석합니다.
   2. 멤브레인에서 세척 완충액을 버리고 희석된 MHCIIa 항체를 멤브레인에 붓습니다.
   3. 용기(MHCIIa의 멤브레인 포함)를 실온에서 2시간 또는 4°C에서 밤새 로커에 놓습니다.
   4. MHCIIa 항체를 회수하여 4°C에서 보관합니다. 차단 완충액으로 로커에서 2분 동안 멤브레인을 세척합니다.
      참고: 모든 1차 항체는 완충액이 투명하게 유지되는 한 최대 5배까지 재사용할 수 있습니다.
   5. 두 번 더 헹굽니다. 매번 5분; 총 3 회 세탁.
   6. 마우스 면역글로불린 G 서양고추냉이 과산화효소(IgG-HRP) 2차 항체를 10mL의 차단 완충액에 20,000분의 1로 희석하여 막에 첨가합니다.
   7. 세척 완충액을 버리고 1시간 동안 흔들면서 2차 마우스 IgG-HRP에서 멤브레인을 배양합니다.
   8. 2 차는 버리고 멤브레인을 세척 완충액으로 세척합니다 (2, 5, 5 분).
   9. 이미징할 준비가 될 때까지 멤브레인을 최종 세척에 담그십시오.
   10. 겔 이미저를 켜고 이미저가 필요한 작동 온도에 도달할 때까지 15분 동안 기다린 다음 이미징 소프트웨어를 엽니다( 재료 표 참조).
   11. 소프트웨어 창에서 New Single Channel Protocol(새 단일 채널 프로토콜)을 클릭합니다(그림 3A). 멤브레인의 백색광 이미지의 경우 Applications | 얼룩 | Colorimetric(색도계)을 클릭합니다(그림 3B).
   12. 젤 영역을 클릭하십시오. 각 옵션은 다양한 겔 유형의 크기에 맞게 특정 치수에 맞게 프로그래밍됩니다. 멤브레인의 치수에 가장 잘 맞는 적절한 옵션을 선택합니다(그림 3C).
   13. 루미놀과 과산화효소 시약을 1:1 비율로 결합하여 ECL을 준비합니다. 전체 멤브레인을 덮을 수 있는 충분한 양의 ECL 혼합물을 만들며, 일반적으로 800-1,000μL의 총 부피가 필요합니다.
   14. 멤브레인을 크고 투명한 플라스틱 트레이에 놓고 ECL 혼합물을 멤브레인에 분산시킵니다.
   15. 멤브레인을 이미징 플레이트에 놓습니다.
   16. Position Gel(노란색 버튼)을 클릭하면 라이브 카메라 뷰를 볼 수 있습니다. zoom 버튼을 클릭한 상태로 드래그하여 멤브레인의 이미징 영역을 최대화합니다. 이 시점에서 필요한 경우 멤브레인의 위치를 곧게 펴십시오.
   17. Run Protocol(프로토콜 실행)(녹색 버튼)을 클릭하고 멤브레인의 비색 이미지가 생성될 때까지 기다립니다. 이 이미지를 저장하면 해당 섬유 샘플과 점을 일치시키는 데 도움이 됩니다.
   18. 멤브레인을 이동하지 않고 2 x 2 비닝 (Chemi High Resolution) 옵션을 클릭하여 소프트웨어에서 응용 프로그램을 변경할 수 있습니다(그림 3D).
   19. Image exposure and software(이미지 노출 및 소프트웨어)에서 노출 시간 최적화(Optimize the exposure time)에서 Faint Bands(희미한 밴드)를 클릭합니다(그림 3E) | 신호 축적 모드.
   20. Setup(설정)에서 첫 번째 이미지에 1초, 마지막 이미지에 30초, 총 30개의 이미지를 입력합니다(그림 3F).
   21. Run Protocol(프로토콜 실행)을 클릭합니다.
   22. 신호 포화 전(보이는 모든 도트가 검은색으로 표시됨), 초기 신호 포화 전(일부 도트가 포화 상태가 시작됨) 및 과포화 스폿(강한 신호가 감지된 모든 스폿이 포화 상태임) 단계에서 이미지를 저장합니다.
   23. 신호 축적을 종료하기 전에 필요한 모든 이미지를 저장하십시오. 이미저에서 멤브레인을 꺼냅니다.
   24. 젤 이형제를 사용하여 멤브레인을 세척 버퍼가 있는 용기에 다시 넣습니다.
2. MHCI 검출
   1. 세척 버퍼를 붓고 멤브레인을 스트리핑 버퍼로 30°C에서 37분 동안 처리합니다(멤브레인이 완전히 잠겼는지 확인).
   2. 스트리핑 버퍼를 회수하고 세척 버퍼에서 멤브레인을 흔들면서 5분 동안 헹굽니다.
      알림: 스트리핑 버퍼는 폐기하기 전에 10번 재사용할 수 있습니다.
   3. 세척 완충액을 붓고 이번에는 200분의 1(범위: 200분의 1에서 500분의 1)의 시작 농도로 희석된 MHCI 1차 항체를 적용합니다. 멤브레인을 실온에서 1시간 동안 흔듭니다.
   4. MHCI 1차 항체에서 배양한 후, 항체를 회수하고 단계 4.1.4 및 4.1.5에서와 같이 멤브레인을 세척합니다.
   5. 차단 완충액에 마우스 IgM HRP 2차 항체를 20,000분의 1로 희석합니다. 막에서 차단 완충액을 붓고 단계 4.1.7에서와 같이 마우스 IgM 2차에서 배양합니다.
   6. 세척 및 이미지 캡처는 4.1.8 - 4.1.24 단계에서와 같이 MHCI를 감지했습니다.
      주의: 스트리핑 버퍼에는 유기 포스핀 3-5%(클래스 8)가 포함되어 있습니다. 안전한 취급 권장 사항은 MSDS를 참조하십시오.
3. Actin을 사용한 잠재적 MHCIIx 검출
   1. 멤브레인을 한 번 더 벗겨냅니다(4.2.1 및 4.2.2단계).
   2. 섹션 4.1을 반복하되, 이번에는 BSA 완충액에서 500분의 1로 희석한 액틴 1차 항체를 적용한 다음 차단 완충액에서 20,000분의 1로 희석한 토끼 HRP 2차 항체를 적용합니다.

5. 섬유 유형 식별

1. MHCI, MHCIIa 및 Actin 신호 분석
   1. 신호 강도 패널에 익숙해지십시오(그림 4A). 5.1.2단계부터 5.1.4단계까지 기록해 둡니다.
   2. 포화 신호 강도는 단백질 검출이 강하다는 것을 정성적으로 나타냅니다.
   3. 보통은 표적 단백질이 중간 수준으로 존재함을 나타냅니다.
   4. 희미한 신호는 표적 단백질이 거의 존재하지 않음을 나타냅니다.
   5. 신호 강도 패널을 사용하여 신호 강도가 '포화', '보통' 또는 '희미한' 신호 강도로 광섬유를 분류합니다(그림 4A).
   6. MHCIIa와 MHCI 결과를 먼저 비교하여 섬유 유형 식별을 수행합니다(그림 4B, 왼쪽 및 중간 블롯).
   7. 하나의 MHC 동형의 포화 또는 중간 신호 강도를 가진 광섬유를 기록합니다.
   8. MHC 동형 신호가 '희미한' 경우 광섬유를 표시하지 않은 상태로 둡니다( 그림 4B 참조).
   9. 마지막으로, MHCI 또는 IIa가 검출되지 않은 광섬유에서 Actin이 관찰되는 경우(중간 또는 포화 신호 강도) 이를 잠재적인 IIx 광섬유로 기록합니다(그림 4B, 오른쪽 블롯).
   10. 희미한 MHC 동형 신호가 있는 섬유를 기록하지만 Actin이 식별되지 않은 것으로 감지됨(중간 또는 포화 강도).
   11. 세 가지 표적 단백질 모두에 대해 희미하거나 검출되지 않은 샘플(섬유가 수집되지 않음)은 폐기합니다(그림 4C).
   12. MHCI 및 MHCII 신호가 모두 '포화' 또는 중간 신호로 감지되는 광섬유를 기록합니다. 이 샘플은 섬유 유형별 준비에 사용할 수 없습니다.
2. 섬유 유형별 시료 준비
   1. 각 생검에 대해 별도의 유형 I 및 유형 II 샘플을 준비합니다. 유형 II 샘플의 경우 MHCIIa가 포화 또는 중간 수준에서 검출되는 최소 요구 섬유 수(2.1.5단계에서 계산)를 결합합니다.
   2. 유형 I로 표시된 별도의 튜브에서 MHCI가 검출되는 섬유에 대해 이 과정을 반복합니다(그림 4D).
   3. 포화 신호가 있는 광섬유가 충분하지 않은 경우 신호 강도가 중간 정도인 광섬유를 사용하십시오.
   4. 잠재적인 IIx 섬유를 결합합니다.
   5. 웨스턴 블로팅을 위해 섬유 유형별 샘플을 즉시 사용하거나 나중에 사용할 수 있도록 -80°C에서 보관하십시오.

6. 웨스턴 블롯 섬유 유형 확인

1. 각 섬유 유형별 샘플 10μL를 활용합니다(필요한 최소 샘플 부피, 2.1.5단계 참조).
2. 제조업체의 프로토콜에 따라 SDS-PAGE를 통해 지정된 프리캐스트 겔을 사용하여 샘플을 분리합니다.
3. 겔 이미저를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 겔의 단백질을 검출합니다.
4. 겔을 차가운 1x 전사 버퍼에 10분 동안 넣습니다.
5. 제조업체의 프로토콜에 따라 단백질을 0.45μm 니트로셀룰로오스 막(9.5cm x 13.5cm)에 습식 전사합니다.
6. 이송 후 용기에 초순수 H₂O로 멤브레인을 잠시 헹굽니다. 초순수를 붓습니다.
7. 멤브레인에 항체 신호 증진제 용액 10mL를 넣고 실온에서 10분 동안 담급합니다.
8. 항체 신호 증진제 용액을 회수하고 초순수 H_2O로 5 회 세척 (세척 당 5 초)합니다.
   알림: 항체 신호 강화제 용액은 폐기하기 전에 5번 사용할 수 있습니다.
9. 마지막 세척을 붓고 차단 용액을 추가하고 실온에서 1시간 동안 흔들어 줍니다.
10. 깨끗한 메스 칼날이나 가위를 사용하여 180kDa 이상의 단백질이 막의 상단 부분에 오도록 분자량으로 막을 가로질러 수평으로 자릅니다.
11. 추가 섬유 유형 확인을 위해 이 상단 섹션을 사용하십시오.
12. 180kDa 미만의 부분을 사용하여 다양한 표적 단백질을 검출합니다.
13. 멤브레인의 상단 섹션에서 MHCIIx 1차 및 마우스 면역글로불린 M(IgM) HRP 2차 항체로 섹션 4.1을 따릅니다.
14. MHCIIa IgG 1차 및 마우스 IgG HRP 2차 항체로 이 과정을 반복하기 전에 멤브레인을 벗겨냅니다(섹션 4.2.1 및 4.2.2에 설명된 대로).
15. 한 번 더 벗겨내고 마지막으로 MHCI IgM 1차 항체 및 마우스 IgM HRP 2차 항체를 적용합니다.
    참고: 이 단계는 정성적이므로 멤브레인 박리로 인한 단백질 손실은 문제가 되지 않습니다.
16. 서로 다른 MHC 동형에서 검출된 신호를 비교합니다( 그림 5B 참조). 신호 강도가 예상 샘플(MHCI - 유형 I, MHCIIa - 유형 II 및 MHCIIx - 유형 IIx)에서 중간에서 포화 수준으로 감지되면 광섬유 유형별 샘플은 향후 연구에서 사용할 수 있도록 신뢰할 수 있는 것으로 기록됩니다.
17. 샘플에서 둘 이상의 MHC 동형이 동일하게 검출되는 경우 샘플을 신뢰할 수 없는 것으로 기록합니다.
    주의: 항체 증강 용액에는 수산화나트륨 50%가 포함되어 있습니다. 안전한 취급 권장 사항은 MSDS를 참조하십시오.

결과

도트 블로팅을 사용한 개별 MHCI, MHCIIa 및 MHCIIx 근육 섬유 식별
MyDoBID의 특징은 주어진 광섬유에서 다양한 MHC 및 Actin 신호 강도 강도를 분류하는 것입니다(그림 4A). 섬유 유형은 MHCI 및 IIa 동형의 존재 유무에 의해 식별되었습니다(그림 4B). 6개의 섬유는 MHC 또는 액틴 검출이 나타나지 않았으며, 이는 수집된 섬유가 없음을 나타냅니다. 이 ?...

토론

섬유 수집
수년간의 경험을 바탕으로 대부분의 연구원은 이 기술을 마스터할 수 있습니다. 그러나 연습을 통해 다운스트림 분석을 위한 더 빠르고 효율적인 섬유 수집이 가능합니다. 풀링을 위해 품질의 단일 섬유 세그먼트 30개를 분리할 수 있으려면 샘플당 50개의 섬유 세그먼트를 수집하는 것이 좋습니다. 섬유 수집 비디오를 주의 깊게 연구하고 두 번의 연습 세션(세션당 ~50개의...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x Denaturing buffer	Make according to recipe	Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributing companies	1x denaturing buffer is made by diluting 3x denaturing buffer 1 in 3 v/v with 1X Tris-HCl (pH 6.8). Store at -20 °C.
3x Denaturing buffer	Make according to recipe	Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributors	3x denaturing buffer contains: 0.125M Tris-HCI, 10% glycerol, 4% SDS, 4 M urea, 10% 2-mercaptoethanol, and 0.001% bromophenol blue, pH 6.8.  Store at -20 °C.
95% Ethanol	N/A	100% ethanol can be sourced from any company	Diluted to 95% with ultra-pure H2O.
Actin rabbit polyclonal antibody	Sigma-Aldrich	A2066	Dilute 1 in 1,000 with BSA buffer.
Analytical scales	Mettler Toledo	Model number: MSZ042101
Antibody enhancer	Thermo Fischer Scientific	32110	Product name is Miser Antibody Extender Solution NC.
Beaker (100 mL)	N/A	N/A
Benchtop centrifuge	Eppendorf	5452	Model name: Mini Spin.
Blocking buffer: 5% Skim milk in Wash buffer.	Diploma	Store bought
BSA buffer: 1 % BSA/PBST, 0.02 % NaN3	BSA: Sigma-Aldrich              PBS: Bio-Rad Laboratories. NaN3 : Sigma-Aldrich	BSA: A6003-25G                         10x PBS: 1610780                       NaN3: S2002	Bovine serum albumin (BSA), Phosphate-buffered saline (PBS), and Sodium azide (NaN3). Store at 4 °C.
Cassette opening lever	Bio-Rad Laboratories	4560000	Used to open the precast gel cassettes.
Chemidoc MP Imager	Bio-Rad Laboratories	Model number: Universal hood III	Any imaging system with Stain-Free gel imaging capabilities.
Criterion blotter	Bio-Rad Laboratories	1704070	Includes ice pack, transfer tray, roller, 2 cassette holders, filter paper, foam pads and lid with cables.
Criterion Cell (Bio-Rad)	Bio-Rad Laboratories	1656001
ECL (enhanced chemiluminescence)	Bio-Rad Laboratories	1705062	Product name: Clarity Max Western ECL Substrate.
Electrophoresis buffer 1x Tris Glycine SDS (TGS)	Bio-Rad Laboratories	1610772	Dilute 10x TGS 1 in 10 with ultra-pure H2O.
Filter paper, 0.34 mm thick	Whatmann	3030917	Bulk size 3 MM, pack 100 sheets, 315 x 335 mm.
Fine tissue dissecting forceps	Dumont	F6521-1EA	Jeweller’s forceps no. 5.
Flat plastic tray/lid	N/A	N/A	Large enough to place the membrane on. Ensure the surface is completely flat.
Freeze-drying System	Labconco	7750030	Freezone 4.5 L with glass chamber sample stage.
Freezer -80 oC	N/A	N/A	Any freezer with a constant temperature of -80 °C is suitable.
Gel releasers	1653320	Bio-Rad	Slide under the membrane to gather or move the membrane.
Grey lead pencil	N/A	N/A
Image lab software	Bio-Rad Laboratories	N/A	Figures refers to software version 5.2.1 but other versions can used.
Incubator	Bio-Rad Laboratories	1660521	Any incubator that can be set to 37 °C would suffice.
Lamp	N/A	N/A
Magnetic stirrer with flea	N/A	N/A
Membrane roller	Bio-Rad Laboratories	1651279	Can be purchased in the Transfer bundle pack. However, if this product is not available, any smooth surface cylindrical tube long enough to roll over the membrane would suffice.
Microcentrifuge tubes  (0.6 mL)	N/A	N/A
Mouse IgG HRP secondary	Thermo Fisher Scientific	31430	Goat anti-Mouse IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilute at 1 in 20,000 in blocking buffer.
Mouse IgM HRP secondary	Abcam	ab97230	Goat Anti-Mouse IgM mu chain. Use at the same dilution as mouse IgG.
Myosin Heavy Chain I (MHCI) primary antibody	DSHB	A4.840	Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.
Myosin Heavy Chain IIa (MHCIIa) primary antibody	DSHB	A4.74	Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.
Myosin Heavy Chain IIx (MHCIIx) primary antibody	DSHB	6H1	Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.
Nitrocellulose Membrane 0.45 µm	Bio-Rad Laboratories	1620115	For Western blotting.
Petri dish lid	N/A	N/A
Plastic tweezers	N/A	N/A
Power Pack	Bio-Rad Laboratories	164-5050	Product name: Basic power supply.
Protein ladder	Thermo Fisher Scientific	26616	PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa.
PVDF Membrane 0.2 µm	Bio-Rad Laboratories	1620177
Rabbit HRP secondary	Thermo Fisher Scientific	31460	Goat anti-Rabbit IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilution same as mouse secondary antibodies.
Rocker	N/A	N/A
Ruler	N/A	N/A
Scissors	N/A	N/A
Stereomicroscope	Motic	SMZ-168
Stripping buffer	Thermo Fisher Scientific	21059	Product name: Restore Western Blot Stripping Buffer.
Tissue (lint free)	Kimberly-Clark professional	34120	Product name: Kimwipe.
Transfer buffer (1x Tris Glycine buffer (TG), 20% Methanol)	TG: Bio-Rad Laboratories   Methanol: Merck	TG buffer: 1610771           Methanol: 1.06018	dilute 10x TG buffer with ultra-pure H2O to 1x. Add 100% Methanol to a final concentration of 20% Methanol. Store at 4 °C.
Transfer tray	Bio-Rad Laboratories	1704089
UV-activation precast gel	Bio-Rad Laboratories	5678085	Gel type: 4–15% Criterion TGX Stain-Free Protein Gel, 26 well, 15 µL.
Vortex	N/A	N/A
Wash buffer (1x TBST)	10x TBS: Astral Scientific  Tween 20: Sigma	BIOA0027-4L	1x TBST recipe: 10x Tris-buffered saline (TBS) is diluted down to 1x with ultra-pure H2O, Tween 20 is added to a final concentration of 0.1%. Store buffer at 4 °C.
Wash containers	Sistema	Store bought	Any tupperware container, that suits the approximate dimensions of the membrane would suffice.