Desarrollo y optimización de un modelo de organoide derivado de pacientes con carcinoma hepatocelular humano para la identificación de posibles dianas y el descubrimiento de fármacos

Resumen

Proporcionamos una visión general completa y el perfeccionamiento de los protocolos existentes para la formación de organoides de carcinoma hepatocelular (CHC), que abarcan todas las etapas del cultivo de organoides. Este sistema sirve como un modelo valioso para la identificación de posibles dianas terapéuticas y la evaluación de la eficacia de los candidatos a fármacos.

Resumen

El carcinoma hepatocelular (CHC) es un tumor altamente prevalente y letal en todo el mundo, y su descubrimiento tardío y la falta de agentes terapéuticos específicos eficaces requieren más investigación sobre su patogénesis y tratamiento. Los organoides, un modelo novedoso que se asemeja mucho al tejido tumoral nativo y que puede cultivarse in vitro, han despertado un gran interés en los últimos años, con numerosos informes sobre el desarrollo de modelos organoides para el cáncer de hígado. En este estudio, hemos optimizado con éxito el procedimiento y establecido un protocolo de cultivo que permite la formación de organoides de HCC de mayor tamaño con condiciones estables de paso y cultivo. Hemos descrito exhaustivamente cada paso del procedimiento, cubriendo todo el proceso de disociación del tejido del CHC, la siembra de organoides, el cultivo, el paseo, la criopreservación y la reanimación, y hemos proporcionado precauciones detalladas en este documento. Estos organoides exhiben similitud genética con los tejidos originales del CHC y se pueden utilizar para diversas aplicaciones, incluida la identificación de posibles dianas terapéuticas para tumores y el posterior desarrollo de fármacos.

Introducción

El carcinoma hepatocelular (CHC), un tumor prevalente y muy diverso¹, ha atraído una atención considerable dentro de la comunidad médica. La presencia de plasticidad de linaje y heterogeneidad sustancial en el CHC sugiere que las células tumorales que se originan en varios pacientes e incluso lesiones distintas dentro del mismo paciente pueden manifestar rasgos moleculares y fenotípicos diferentes, lo que presenta obstáculos formidables en el avance de enfoques terapéuticos innovadores 2,3,4,5 . En consecuencia, existe una necesidad imperiosa de mejorar la comprensión de los atributos biológicos y los mecanismos de la resistencia a los medicamentos en el CHC para informar la formulación de estrategias de tratamiento más eficaces.

En las últimas décadas, los investigadores han dedicado sus esfuerzos al desarrollo de modelos in vitro con el fin de estudiar el HCC ^3,4. A pesar de algunos avances, persisten las limitaciones. Estos modelos abarcan una variedad de técnicas, como la utilización de líneas celulares, células primarias y xenoinjertos derivados del paciente (PDX). Las líneas celulares sirven como modelos in vitro para el cultivo a largo plazo de células tumorales obtenidas de pacientes con CHC, lo que ofrece los beneficios de la conveniencia y la expansión fácil. Los modelos celulares primarios implican el aislamiento y cultivo directo de células tumorales primarias de los tejidos tumorales de los pacientes, lo que proporciona una representación de las características biológicas que se asemejan mucho a las de los propios pacientes. Los modelos PDX implican el trasplante de tejidos tumorales de pacientes en ratones, con el objetivo de simular más fielmente el crecimiento y la respuesta tumoral. Estos modelos han sido fundamentales en la investigación del CHC, pero poseen ciertas limitaciones, incluida la heterogeneidad de las líneas celulares y la incapacidad de replicarse completamente en condiciones in vivo. Además, el cultivo in vitro prolongado puede provocar el deterioro de las características y funcionalidades originales de las células, lo que plantea dificultades para representar con precisión las propiedades biológicas del CHC. Además, la utilización de los modelos PDX requiere mucho tiempo y es costosa³.

Para abordar estas limitaciones y replicar con mayor precisión los atributos fisiológicos del CHC, se ha introducido la utilización de la tecnología de organoides como una plataforma de investigación prometedora capaz de superar las limitaciones anteriores. Los organoides, que son modelos celulares tridimensionales cultivados in vitro, tienen la capacidad de replicar la estructura y funcionalidad de los órganos reales. Sin embargo, en el contexto del CHC, existen ciertos desafíos en el establecimiento de modelos de organoides. Estos desafíos incluyen descripciones insuficientemente detalladas de los procedimientos de construcción de organoides de HCC, la falta de protocolos integrales para todo el proceso de construcción de organoides de HCC y el tamaño típicamente pequeño de los organoides cultivados ^6,7,8. A la luz de las dimensiones típicamente limitadas de los organoides cultivados, nos esforzamos por abordar estos desafíos mediante el desarrollo de un protocolo integral que abarque la totalidad de la construcción de organoides HCC⁶. Este protocolo abarca la disociación de tejidos, la colocación de placas en organoides, el cultivo, el pase, la criopreservación y la reanimación. Al optimizar los pasos del procedimiento y refinar la composición del medio de cultivo, hemos establecido con éxito modelos de organoides HCC capaces de un crecimiento sostenido y un paso a largo plazo ^6,8. En las secciones siguientes, se presentará una descripción completa de las complejidades operativas y los factores pertinentes que intervienen en la construcción de organoides de HCC.

Protocolo

Se obtuvieron tejidos de biopsia humana de los respectivos pacientes en el Hospital Oncológico Afiliado y el Instituto de la Universidad Médica de Guangzhou, y se obtuvo el consentimiento informado de los pacientes. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre todos los materiales, reactivos e instrumentos utilizados en este protocolo.

1. Establecimiento de organoides de CHC derivados del paciente a partir de muestras quirúrgicas

NOTA: El establecimiento de organoides de HCC abarca varias etapas, a saber, disociación de tejidos, siembra de organoides, cultivo, paseo, criopreservación y reanimación. El proceso de disociación de los tejidos requiere una duración de 2 h, mientras que la siembra de organoides en una placa dura aproximadamente 40 min. Después de esto, la generación inicial de organoides de HCC se somete a un período de cultivo de 10-14 días utilizando un medio de aislamiento de HCC. Una vez que se alcanza una densidad satisfactoria, se realizan pasajes de organoides, lo que requiere 1 h. Los cultivos posteriores de los organoides se mantienen utilizando un medio de expansión de HCC durante 7-10 días, que puede variar según la tasa de crecimiento y la condición de los organoides.

1. Disociación tisular
   1. Preparación de insumos y materiales
      1. Recolectar 1-2^cm3 de tejido de CHC de pacientes que no han recibido ningún tratamiento local o sistémico previo antes de la operación. Después de la resección quirúrgica, mantener el tejido a 4 °C en solución de preservación de tejido (Tabla 1) hasta el procesamiento.
         NOTA: Las muestras de tejido fresco de alta calidad son esenciales para el establecimiento exitoso de organoides. Es importante procesar las muestras con prontitud, idealmente dentro de 1-4 h después de la resección quirúrgica para mantener la viabilidad del tejido. Realizar todos los procedimientos posteriores en un entorno aséptico utilizando materiales y reactivos estériles.
      2. Precalentar placas de cultivo celular de superficie de fijación ultra baja (24 pocillos) durante 1 h en una incubadora a 37 °C. Descongele el extracto de membrana basal congelado (BME) durante la noche a 4 °C hasta justo antes de su uso.
         NOTA: Para asegurar la descongelación completa del BME, debe colocarse en hielo durante al menos 3 h. La fusión completa del BME es esencial para el éxito del cultivo de organoides en los pasos siguientes.
      3. Antes de su uso, asegúrese de que la solución de digestión (Tabla 1) esté calentada a una temperatura de 37 °C.
         NOTA: Prepare la solución de digestión recién hecha en un ambiente aséptico y utilícela con prontitud.
   2. Flujo de procesamiento organizativo
      1. En una cabina de flujo laminar, corte el tejido tumoral en trozos pequeños (0,5-1^mm3) con unas tijeras quirúrgicas en una placa de Petri. Transfiera el tejido recortado a un tubo cónico de 15 mL y agregue 5-10 mL de medio basal (Tabla 1).
         NOTA: El medio basal (Tabla 1) puede almacenarse a 4 °C hasta por 1 mes.
      2. Use una pipeta barotrópica para eliminar la mayor cantidad de sangre posible y déjela reposar durante 1-2 minutos para eliminar parte del sobrenadante, incluidas las células sanguíneas y los coágulos de grasa flotantes. Repita este procedimiento dos veces.
      3. Centrifugar la mezcla a 300 × g durante 5 min a temperatura ambiente y retirar con cuidado el sobrenadante. Agregue 5 ml de la solución de digestión precalentada (Tabla 1) al tejido recortado.
      4. Gire el tubo a 37 °C para la digestión.
      5. Después de 30 minutos de digestión inicial, busque pequeños grupos de células bajo el microscopio. Revise cada 5-10 minutos para evitar la digestión excesiva.
         NOTA: El tiempo requerido para la digestión de los tejidos dependerá del tamaño y tipo de tejido. La digestión de los tejidos no debe exceder los 90 min. El tejido sobredigerido aparecerá bajo el microscopio como una gran lámina de células individuales. El nivel adecuado de digestión está indicado por el hecho de que la mayoría de estos son grupos celulares y tienen una apariencia similar a la de una uva.
      6. Detenga la digestión agregando medio basal frío (Tabla 1) y filtre en un nuevo tubo de 50 ml con un filtro celular de 100 μm. Agregue medio basal frío a un volumen de 50 mL.
      7. Centrifugar las células a 2 × g durante 10 min a 8 °C. Retire con cuidado el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo añadiendo otros 50 ml de medio basal frío (Tabla 1). Repita este paso dos veces.
         NOTA: La centrifugación a baja velocidad se utiliza para permitir que los grupos de células pequeñas se asienten, mientras que las células sanguíneas y los restos celulares aún están suspendidos en el sobrenadante; El proceso se repite varias veces para obtener una masa celular de tejido relativamente pura.
2. Recubrimiento de organoides
   1. Después del segundo lavado, retire la mayor cantidad posible del sobrenadante y vuelva a suspender el número deseado de células (1.000-5.000 células por pocillo de una placa de 24 pocillos) en el BME apropiado para la siembra.
      NOTA: Mantenga siempre el BME a 4 °C antes de usarlo.
   2. Agregue BME y suspenda grupos de células pequeñas en Advanced DMEM/F-12 agregando BME y pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo hasta que los agregados de células estén completamente suspendidos. Controlar la concentración del BME entre el 30% y el 50%.
   3. Siembre gotas de BME de 50 μL mezcladas con grupos celulares en el centro de placas de cultivo de 24 pocillos.
      NOTA: En la medida de lo posible, no permita que las gotas se esparzan a la pared lateral de la placa del pocillo. La pared lateral de la placa de baja adsorción no está en un estado de baja adsorción, y el contacto entre las gotas y la pared lateral conducirá a la adhesión, lo que no es propicio para la incubación posterior.
   4. Deje que las placas con las gotas añadidas se solidifiquen a 37 °C durante 20 min. Al final de la incubación, añadir 500 μL de medio precalentado (Tabla 1) a cada pocillo e incubar en una incubadora celular a 37 °C.
3. Cultivo de organoides
   1. Refresque el medio de cultivo (Tabla 1) una vez cada 2-3 días. Al inicio del cultivo, se cultivaron los organoides de HCC en medio de aislamiento de HCC (Tabla 1) durante 2 semanas.
   2. Después de 2 semanas de incubación con medio de aislamiento de CHC, reemplace el medio con medio de expansión de organoides de HCC (Tabla 1) (almacenado a 4 °C durante un máximo de 2 semanas).
   3. Refresque el medio de cultivo una vez cada 3 días.
   4. Después de 7-10 días de cultivo con medio de expansión de CHC, cuando el organoide haya alcanzado la densidad o el tamaño adecuados, iniciar intervenciones experimentales o pasar o liofilizar los organoides según sea necesario.
4. Pasaje de organoides
   1. Preparación de insumos y materiales
      1. Precalentar placas de cultivo celular de superficie de fijación ultra baja (24 pocillos) durante 1 h en una incubadora a 37 °C. Descongele el BME congelado durante la noche a 4 °C hasta justo antes de su uso.
      2. Precalentar la solución de cosecha de organoides y el sustituto de tripsina a 37 °C durante 30 min.
   2. Proceso de paso
      1. Después de retirar el medio de cultivo de la placa de pocillos, transfiera la suspensión de organoides a un tubo de 15 ml.
      2. Agregue la solución de recolección de organoides de acuerdo con la cantidad de BME (500 μL de solución de recolección de organoides por 50 μL de BME) raspando y pipeteando hacia arriba y hacia abajo con una pistola de pipetas de 1,000 μL.
         NOTA: Evite las burbujas de aire durante todo el proceso para evitar la pérdida de organoides, ya que la presencia de burbujas de aire indica una mayor presión de pipeteo.
      3. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente.
      4. Aspire suavemente el BME con una pipeta de 1.000 μL y observe que el BME se disuelve por completo. Observe cada 10 minutos hasta que se observe un grupo de células organoides claras, luego centrifugue a 400 × g durante 5 minutos a temperatura ambiente y elimine la mayor cantidad posible del sobrenadante.
         NOTA: En esta etapa, el organoide se puede congelar y conservar.
      5. Para la digestión enzimática de organoides, añadir 1-5 mL del sustituto de tripsina (según el número de organoides) e incubar a 37 °C durante 2 min. Observe bajo el microscopio el grado de digestión enzimática para determinar si los organoides se disocian en pequeños grupos de 2 a 10 células; Si no es así, continúe con la digestión enzimática.
         NOTA: La digestión excesiva dará lugar a la lisis de grupos de células organoides en células individuales, disminuyendo su viabilidad y prolongando el tiempo de cultivo posterior.
      6. Añadir el volumen adecuado de medio basal frío (Tabla 1) para detener la digestión.
      7. Centrifugar los organoides a 400 × g durante 5 min a 8 °C; Retire el sobrenadante tanto como sea posible.
      8. Vuelva a suspender el número deseado de organoides (1.000-5.000 organoides por pocillo de una placa de 24 pocillos) en la matriz apropiada para la siembra. Siga los mismos pasos que en la sección 1.2.
         NOTA: La densidad de recubrimiento debe optimizarse de acuerdo con la tasa de crecimiento y el tamaño de los organoides.
      9. Pasar los organoides cada 10 días en una proporción de 1:3 o 1:4 dependiendo de la densidad de crecimiento de los organoides.
5. Criopreservación y reanimación de organoides
   1. Criopreservación de organoides
      1. Prepare tubos de liofilización, cada tubo confluente con dos pocillos de una placa de 24 pocillos que contenga organoides.
      2. Siga los pasos 1.4.2.1 a 1.4.2.4 para el paso de organoides para obtener organoides sin BME, y vuelva a suspender suavemente los organoides añadiendo 500 μL/pocillo de solución de liofilización de organoides a una placa de 24 pocillos.
         NOTA: Dependiendo del estado de crecimiento y tamaño de los organoides, se recomienda criopreservar los organoides en cultivo hasta la tercera generación.
      3. Transfiera la suspensión a tubos de liofilización y colóquela en una caja enfriada por gradiente a -80 °C. Después de enfriar en gradiente a -80 °C durante al menos 24 h, transfiera los tubos a nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo.
   2. Reanimación de organoides
      1. Incubar los tubos liofilizados en un baño de agua a 37 °C y detener la incubación cuando solo quede un pequeño bloque de hielo.
      2. Centrifugar a 400 × g durante 5 min a 8 °C para eliminar completamente el sobrenadante.
      3. Siga las secciones 1.2 y 1.3 para las operaciones posteriores.

Resultados

Al implementar el procedimiento antes mencionado, la aparición de esferoides organoides de HCC es típicamente observable en un lapso de 3 días (Figura 1). La Figura 1A, B muestra el organoide de HCC establecido, que desarrolla rápidamente esferoides compactos caracterizados por bordes redondeados y citosol permeable en el día inicial de establecimiento. Durante el crecimiento de los organoides de HCC, el uso de diferentes concentraciones de...

Discusión

Un beneficio notable de los modelos de organoides derivados de pacientes radica en su capacidad para replicar fielmente las características biológicas de los tumores, abarcando la estructura del tejido y el paisaje genómico. Estos modelos demuestran un notable nivel de precisión y reflejan eficazmente la heterogeneidad y progresión de los tumores, incluso durante largos períodos de cultivo ^6,8,9. A través de la utilizaci?...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
[Leu15]-gastrin I human	Merck	G9145
1.5 mL Microtubes	Merck	AXYMCT150LC
A8301 (TGFβ inhibitor)	Tocris Bioscience	2939
B27 Supplement (503), minus vitamin A	Thermo Fisher Scientific	12587010
B-27 Supplement (503), serum-free	Thermo Fisher Scientific	17504044
BMP7	Peprotech	120-03P
Cell strainer size 100 μm	Merck	CLS352360
CHIR99021	Merck	SML1046
Collagenase D	Merck	11088858001
Corning Costar Ultra-Low	Merck	CLS3473
Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile	Corning	3473
Costar 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile	Corning	3471
Cultrex Organoid Harvesting Solution	R&D SYSTEMS	3700-100-01	Organoid harvesting solution
Cultrex Reduced Growth Factor BME, Type 2 PathClear (BME)	Merck	3533-005-02
DAPT	Merck	D5942
Dexamethasone	Merck	D4902
DMSO	Merck	C6164
DNaseI	Merck	DN25
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12	Thermo Fisher Scientific	12634028	Advanced DMEM/F-12
Earle’s balanced salt solution (EBSS)	Thermo Fisher Scientific	24010043
Forceps	N/A	N/A
Forskolin	Tocris Bioscience	1099
GlutaMAX supplement	Thermo Fisher Scientific	35050061
HEPES, 1 M	Thermo Fisher Scientific	15630080
Leica DM6 B Fluorescence Motorized Microscope	Leica	N/A
N2 supplement (1003)	Thermo Fisher Scientific	17502048
N-acetylcysteine	Merck	A0737-5MG
Nicotinamide	Merck	N0636
Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	339651
Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	339653
Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122
Recombinant human EGF	Peprotech	AF-100-15
Recombinant human FGF10	Peprotech	100-26
Recombinant human FGF19	Peprotech	100-32
Recombinant human HGF	Peprotech	100-39
Recombinant human Noggin	Peprotech	120-10C
Rho kinase inhibitor Y-27632 dihydrochloride	Merck	Y0503
R-spodin1-conditioned medium	(Broutier et al.)	N/A	Secretion of cell lines
Surgical scissors	N/A	N/A
Surgical specimen of tumor removed from HCC patients	Affiliated Cancer Hospital and Institute of Guangzhou Medical University	N/A
TNFα	Peprotech	315-01A
TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red	Thermo Fisher Scientific	12604013	Trypsin substitute
Wnt-3a-conditioned medium	(Broutier et al.)	N/A	Secretion of cell lines