Desarrollo y optimización de un modelo de organoide derivado de pacientes con carcinoma hepatocelular humano para la identificación de posibles dianas y el descubrimiento de fármacos

Resumen

Proporcionamos una visión general completa y el perfeccionamiento de los protocolos existentes para la formación de organoides de carcinoma hepatocelular (CHC), que abarcan todas las etapas del cultivo de organoides. Este sistema sirve como un modelo valioso para la identificación de posibles dianas terapéuticas y la evaluación de la eficacia de los candidatos a fármacos.

Resumen

El carcinoma hepatocelular (CHC) es un tumor altamente prevalente y letal en todo el mundo, y su descubrimiento tardío y la falta de agentes terapéuticos específicos eficaces requieren más investigación sobre su patogénesis y tratamiento. Los organoides, un modelo novedoso que se asemeja mucho al tejido tumoral nativo y que puede cultivarse in vitro, han despertado un gran interés en los últimos años, con numerosos informes sobre el desarrollo de modelos organoides para el cáncer de hígado. En este estudio, hemos optimizado con éxito el procedimiento y establecido un protocolo de cultivo que permite la formación de organoides de HCC de mayor tamaño con condiciones estables de paso y cultivo. Hemos descrito exhaustivamente cada paso del procedimiento, cubriendo todo el proceso de disociación del tejido del CHC, la siembra de organoides, el cultivo, el paseo, la criopreservación y la reanimación, y hemos proporcionado precauciones detalladas en este documento. Estos organoides exhiben similitud genética con los tejidos originales del CHC y se pueden utilizar para diversas aplicaciones, incluida la identificación de posibles dianas terapéuticas para tumores y el posterior desarrollo de fármacos.

Introducción

El carcinoma hepatocelular (CHC), un tumor prevalente y muy diverso¹, ha atraído una atención considerable dentro de la comunidad médica. La presencia de plasticidad de linaje y heterogeneidad sustancial en el CHC sugiere que las células tumorales que se originan en varios pacientes e incluso lesiones distintas dentro del mismo paciente pueden manifestar rasgos moleculares y fenotípicos diferentes, lo que presenta obstáculos formidables en el avance de enfoques terapéuticos innovadores 2,3,4,5 . En consecuencia, exist....

Protocolo

Se obtuvieron tejidos de biopsia humana de los respectivos pacientes en el Hospital Oncológico Afiliado y el Instituto de la Universidad Médica de Guangzhou, y se obtuvo el consentimiento informado de los pacientes. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre todos los materiales, reactivos e instrumentos utilizados en este protocolo.

1. Establecimiento de organoides de CHC derivados del paciente a partir de muestras quirúrgicas

NOTA: El establecimiento de organoides de HCC abarca varias etapas, a saber, disociación de tejidos, siembra de organoides, cultivo, paseo,....

Discusión

Un beneficio notable de los modelos de organoides derivados de pacientes radica en su capacidad para replicar fielmente las características biológicas de los tumores, abarcando la estructura del tejido y el paisaje genómico. Estos modelos demuestran un notable nivel de precisión y reflejan eficazmente la heterogeneidad y progresión de los tumores, incluso durante largos períodos de cultivo ^6,8,9. A través de la utilizaci?.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
[Leu15]-gastrin I human	Merck	G9145
1.5 mL Microtubes	Merck	AXYMCT150LC
A8301 (TGFβ inhibitor)	Tocris Bioscience	2939
B27 Supplement (503), minus vitamin A	Thermo Fisher Scientific	12587010
B-27 Supplement (503), serum-free	Thermo Fisher Scientific	17504044
BMP7	Peprotech	120-03P
Cell strainer size 100 μm	Merck	CLS352360
CHIR99021	Merck	SML1046
Collagenase D	Merck	11088858001
Corning Costar Ultra-Low	Merck	CLS3473
Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile	Corning	3473
Costar 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile	Corning	3471
Cultrex Organoid Harvesting Solution	R&D SYSTEMS	3700-100-01	Organoid harvesting solution
Cultrex Reduced Growth Factor BME, Type 2 PathClear (BME)	Merck	3533-005-02
DAPT	Merck	D5942
Dexamethasone	Merck	D4902
DMSO	Merck	C6164
DNaseI	Merck	DN25
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12	Thermo Fisher Scientific	12634028	Advanced DMEM/F-12
Earle’s balanced salt solution (EBSS)	Thermo Fisher Scientific	24010043
Forceps	N/A	N/A
Forskolin	Tocris Bioscience	1099
GlutaMAX supplement	Thermo Fisher Scientific	35050061
HEPES, 1 M	Thermo Fisher Scientific	15630080
Leica DM6 B Fluorescence Motorized Microscope	Leica	N/A
N2 supplement (1003)	Thermo Fisher Scientific	17502048
N-acetylcysteine	Merck	A0737-5MG
Nicotinamide	Merck	N0636
Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	339651
Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	339653
Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122
Recombinant human EGF	Peprotech	AF-100-15
Recombinant human FGF10	Peprotech	100-26
Recombinant human FGF19	Peprotech	100-32
Recombinant human HGF	Peprotech	100-39
Recombinant human Noggin	Peprotech	120-10C
Rho kinase inhibitor Y-27632 dihydrochloride	Merck	Y0503
R-spodin1-conditioned medium	(Broutier et al.)	N/A	Secretion of cell lines
Surgical scissors	N/A	N/A
Surgical specimen of tumor removed from HCC patients	Affiliated Cancer Hospital and Institute of Guangzhou Medical University	N/A
TNFα	Peprotech	315-01A
TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red	Thermo Fisher Scientific	12604013	Trypsin substitute
Wnt-3a-conditioned medium	(Broutier et al.)	N/A	Secretion of cell lines