잠재적 표적 식별 및 약물 발견을 위한 인간 간세포 암종 환자 유래 오가노이드 모델의 개발 및 최적화

요약

당사는 오가노이드 배양의 모든 단계를 포괄하는 간세포 암종(HCC) 오가노이드 형성에 대한 기존 프로토콜에 대한 포괄적인 개요와 개선을 제공합니다. 이 시스템은 잠재적인 치료 표적을 식별하고 약물 후보 물질의 효과를 평가하는 데 유용한 모델 역할을 합니다.

초록

간세포 암종(HCC)은 전 세계적으로 매우 유병률이 높고 치명적인 종양이며, 늦은 발견과 효과적인 특이적 치료제의 부족으로 인해 발병 기전 및 치료에 대한 추가 연구가 필요합니다. 오가노이드는 천연 종양 조직과 매우 유사하며 체외에서 배양할 수 있는 새로운 모델로, 최근 몇 년 동안 간암에 대한 오가노이드 모델 개발에 대한 수많은 보고와 함께 상당한 관심을 받고 있습니다. 이 연구에서는 절차를 성공적으로 최적화하고 안정적인 패시에이징 및 배양 조건을 가진 더 큰 크기의 간세포암 오가노이드를 형성할 수 있는 배양 프로토콜을 확립했습니다. 간세포암 조직 해리, 오가노이드 도금, 배양, 패로징, 동결 보존 및 소생술의 전체 과정을 포괄하는 절차의 각 단계를 포괄적으로 설명했으며 이 논문에서 자세한 예방 조치를 제공했습니다. 이러한 오가노이드는 원래 간세포암 조직과 유전적 유사성을 나타내며 종양에 대한 잠재적 치료 표적 식별 및 후속 약물 개발을 포함한 다양한 응용 분야에 활용될 수 있습니다.

서문

간세포암(Hepatocellular carcinoma, HCC)은 널리 퍼져 있고 매우 다양한 종양¹으로, 의학계에서 상당한 주목을 받고 있다. 간세포암에서 계통 가소성과 상당한 이질성의 존재는 다양한 환자에서 유래한 종양 세포와 동일한 환자 내의 뚜렷한 병변이 서로 다른 분자 및 표현형 형질을 나타낼 수 있음을 시사하며, 따라서 혁신적인 치료 접근법의 발전에 만만치 않은 장애물을 제시할 수 있습니다 2,3,4,5 . 결과적으로, 보다 효과적인 치료 전략의 공식화에 정보를 제공하기 위해 간세포암에서 약물 내성의 생물학적 특성과 메커니즘에 대한 이해를 높일 필요가 있습니다.

최근 수십 년 동안 연구자들은 HCC ^3,4를 연구하기 위한 목적으로 체외 모델 개발에 전념해 왔습니다. 일부 발전에도 불구하고 한계는 여전히 남아 있습니다. 이러한 모델에는 세포주, 일차 세포 및 환자 유래 이종이식(PDX)의 활용과 같은 다양한 기술이 포함됩니다. 세포주는 간세포암 환자로부터 얻은 종양 세포의 장기 배양을 위한 in vitro 모델 역할을 하며, 편의성과 손쉬운 확장의 이점을 제공합니다. 일차 세포 모델은 환자 종양 조직에서 원발성 종양 세포를 직접 분리하고 배양하여 환자 자신과 매우 유사한 생물학적 특성을 나타냅니다. PDX 모델은 종양의 성장과 반응을 보다 충실하게 시뮬레이션하기 위해 환자의 종양 조직을 마우스에 이식하는 것을 수반합니다. 이러한 모델은 간세포암 연구에서 중요한 역할을 해왔지만, 세포주의 이질성과 in vivo 조건에서 완전히 복제할 수 없다는 등 특정 한계가 있습니다. 또한, 체외 배양이 장기화되면 세포 본래의 특성과 기능이 저하되어 간세포암의 생물학적 특성을 정확하게 표현하는 데 어려움이 있을 수 있습니다. 또한 PDX 모델을 활용하려면 시간과 비용이 많이 듭니다³.

이러한 한계를 극복하고 간세포암의 생리학적 특성을 보다 정확하게 재현하기 위해 오가노이드 기술의 활용은 이전의 제약을 뛰어넘을 수 있는 유망한 연구 플랫폼으로 도입되었습니다. 체외에서 배양된 3차원 세포 모델인 오가노이드는 실제 장기의 구조와 기능을 복제할 수 있습니다. 그러나 HCC의 맥락에서 오가노이드 모델을 확립하는 데에는 몇 가지 문제가 있습니다. 이러한 문제에는 간세포암 오가노이드 구성 절차에 대한 불충분한 설명, 간세포형 오가노이드 구성의 전체 프로세스에 대한 포괄적인 프로토콜의 부족, 일반적으로 배양된 오가노이드의 크기가 작다는 점^{등이 포함됩니다 6,7,8}. 배양된 오가노이드의 일반적으로 제한된 차원에 비추어 우리는 HCC 오가노이드 구성 전체를 포괄하는 포괄적인 프로토콜의 개발을 통해 이러한 문제를 해결하기 위해 노력했습니다⁶. 이 프로토콜에는 조직 해리, 오가노이드 도금, 배양, 패시징, 동결 보존 및 소생이 포함됩니다. 절차적 단계를 최적화하고 배양 배지의 조성을 개선함으로써 지속적인 성장과 장기적인 통과가 가능한 HCC 오가노이드 모델을 성공적으로 확립했습니다 ^6,8. 다음 섹션에서는 간세포암 오가노이드의 구성과 관련된 운영상의 복잡성 및 관련 요인에 대한 포괄적인 설명이 제시됩니다.

프로토콜

광저우 의과대학 부속 암 병원 및 연구소의 각 환자로부터 인간 생검 조직을 얻었고 환자로부터 정보에 입각한 동의를 얻었습니다. 이 프로토콜에 사용되는 모든 재료, 시약 및 기기에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.

1. 수술 샘플에서 환자 유래 간세포암 오가노이드 확립

참고: 간세포암 오가노이드의 확립은 조직 해리, 오가노이드 도금, 배양, 패징, 동결 보존 및 소생과 같은 다양한 단계를 포함합니다. 조직 해리 과정에는 2시간의 시간이 필요하며 플레이트에 오가노이드를 파종하는 데는 약 40분이 걸립니다. 그 후, HCC 오가노이드의 초기 생성은 HCC 분리 배지를 사용하여 10-14일의 배양 기간을 거칩니다. 만족스러운 밀도에 도달하면 1시간이 필요한 오가노이드 통로가 전도됩니다. 그런 다음 오가노이드의 후속 배양은 7-10일 동안 HCC 확장 배지를 사용하여 유지되며, 이는 오가노이드의 성장 속도와 상태에 따라 달라질 수 있습니다.

1. 조직 해리
   1. 소모품 및 재료 준비
      1. 수술 전에 국소 또는 전신 치료를 받은 적이 없는 환자로부터 1-2cm3의 간세포 조직을 수집합니다. 외과적 절제 후 처리할 때까지 조직 보존 용액(표 1)에서 조직을 4°C로 유지하십시오.
         참고: 고품질의 신선한 조직 샘플은 오가노이드의 성공적인 확립에 필수적입니다. 시료를 신속하게 처리하는 것이 중요하며, 이상적으로는 조직 생존력을 유지하기 위해 외과적 절제 후 1-4시간 이내에 처리해야 합니다. 멸균 재료와 시약을 사용하여 무균 환경에서 모든 후속 절차를 수행합니다.
      2. 초저 부착 표면 세포 배양 플레이트(24웰)를 37°C의 인큐베이터에서 1시간 동안 예열합니다. 냉동 기저막 추출물(BME)을 사용 직전까지 4°C에서 밤새 해동합니다.
         알림: BME를 완전히 해동하려면 최소 3시간 동안 얼음 위에 놓아야 합니다. BME의 완전한 용융은 후속 단계에서 성공적인 오가노이드 배양을 위해 필수적입니다.
      3. 사용하기 전에 분해 용액(표 1)이 37°C의 온도로 예열되었는지 확인하십시오.
         알림: 무균 환경에서 소화액을 신선하게 준비하고 즉시 사용하십시오.
   2. 조직 처리 흐름
      1. 층류 캐비닛에서 페트리 접시에 수술용 가위를 사용하여 종양 조직을 작은 조각(0.5-1mm3)으로 자릅니다. 잘린 조직을 15mL 원뿔형 튜브에 옮기고 5-10mL의 기초 배지를 추가합니다(표 1).
         참고: 기초 배지(표 1)는 4°C에서 최대 1개월 동안 보관할 수 있습니다.
      2. 기압 피펫을 사용하여 가능한 한 많은 혈액을 씻어내고 1-2분 동안 그대로 두어 혈액 세포와 부유 지방 혈전을 포함한 일부 상층액을 제거합니다. 이 절차를 두 번 반복합니다.
      3. 혼합물을 실온에서 300× g 에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 미리 예열된 분해 용액(표 1) 5mL를 손질된 조직에 추가합니다.
      4. 분해를 위해 튜브를 37°C로 회전시킵니다.
      5. 초기 분해 30분 후 현미경으로 작은 세포 클러스터를 찾습니다. 과소화를 피하기 위해 5-10분마다 확인하십시오.
         알림: 조직 소화에 필요한 시간은 조직의 크기와 유형에 따라 다릅니다. 조직 분해는 90분을 초과해서는 안 됩니다. 과소화된 조직은 현미경에서 개별 세포의 큰 시트로 나타납니다. 적절한 소화 수준은 이들 대부분이 세포 클러스터이며 포도와 같은 모양을 가지고 있다는 사실로 알 수 있습니다.
      6. 차가운 기초 배지(표 1)를 추가하여 분해를 중지하고 100μm 셀 필터가 있는 새 50mL 튜브에 여과합니다. 저온 기초 배지를 50mL 부피로 추가합니다.
      7. 2 × g 에서 8 °C에서 10 분 동안 세포를 원심 분리합니다. 상층액을 조심스럽게 제거하고 50mL의 차가운 기초 배지를 추가하여 펠릿을 재현탁시킵니다(표 1). 이 단계를 두 번 반복합니다.
         알림: 저속 원심분리는 혈액 세포와 세포 파편이 여전히 상층액에 부유하는 동안 작은 세포 클러스터가 가라앉도록 하는 데 사용됩니다. 이 과정을 여러 번 반복하여 비교적 순수한 조직 세포 덩어리를 얻습니다.
2. 오가노이드 도금
   1. 두 번째 세척 후 가능한 한 많은 상층액을 제거하고 원하는 수의 셀(24웰 플레이트의 웰당 1,000-5,000셀)을 도금을 위한 적절한 BME에 재현탁시킵니다.
      알림: 사용하기 전에 항상 BME를 4°C로 유지하십시오.
   2. BME를 추가하고 셀 응집체가 완전히 중단될 때까지 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 BME를 추가하고 Advanced DMEM/F-12에서 소형 셀 클러스터를 일시 중단합니다. BME의 농도를 30%에서 50% 사이로 조절합니다.
   3. 24웰 배양 플레이트 중앙에서 세포 클러스터와 혼합된 시드 50μL BME 방울.
      알림: 가능한 한 물방울이 웰 플레이트의 측벽으로 퍼지지 않도록 하십시오. 저흡착판의 측벽은 저흡착 상태가 아니며 액적과 측벽 사이의 접촉은 접착을 유발하여 후속 배양에 도움이 되지 않습니다.
   4. 물방울이 추가된 플레이트를 37°C에서 20분 동안 응고시킵니다. 배양이 끝나면 500μL의 예열된 배지(표 1)를 각 웰에 추가하고 37°C의 세포 인큐베이터에서 배양합니다.
3. 오가노이드 배양
   1. 배양 배지(표 1)를 2-3일에 한 번씩 새로 고칩니다. 배양 시작 시, HCC 오가노이드를 HCC 분리 배지(표 1)에서 2주 동안 배양하였다.
   2. 간세포형 분리 배지로 2주 배양한 후 배지를 간세포형 오가노이드 확장 배지(표 1)로 교체합니다(4°C에서 최대 2주 동안 보관).
   3. 3일에 한 번씩 배양 배지를 새로 고칩니다.
   4. 7-10일 후 HCC 확장 배지로 배양 후 오가노이드가 적절한 밀도 또는 크기에 도달하면 실험적 개입 또는 통과를 시작하거나 필요에 따라 오가노이드를 동결건조합니다.
4. 오가노이드 통과
   1. 소모품 및 재료 준비
      1. 초저 부착 표면 세포 배양 플레이트(24웰)를 37°C의 인큐베이터에서 1시간 동안 예열합니다. 냉동 BME를 사용 직전까지 4°C에서 밤새 해동합니다.
      2. 오가노이드 채취 용액과 트립신 대체물을 37°C에서 30분 동안 예열합니다.
   2. 통과 과정
      1. 웰 플레이트에서 배양 배지를 제거한 후 오가노이드 현탁액을 15mL 튜브로 옮깁니다.
      2. 1,000 μL 피펫 건을 사용하여 위아래로 긁어내고 피펫팅하여 BME(BME 50μL당 오가노이드 수확 용액 500μL)의 양에 따라 오가노이드 수확 용액을 추가합니다.
         참고: 기포가 있으면 피펫팅 압력이 더 높음을 나타내므로 오가노이드 손실을 방지하기 위해 공정 전반에 걸쳐 기포를 피하십시오.
      3. 실온에서 30분 동안 배양합니다.
      4. 1,000μL 피펫으로 BME를 부드럽게 흡입하고 BME가 완전히 용해되는지 관찰합니다. 투명한 오가노이드 세포 클러스터가 관찰될 때까지 10분마다 관찰한 다음 실온에서 400× g 에서 5분 동안 원심분리하고 가능한 한 많은 상층액을 제거합니다.
         참고: 이 단계에서 오가노이드를 동결하고 보존할 수 있습니다.
      5. 오가노이드의 효소 분해를 위해 트립신 대체물 1-5mL(오가노이드 수에 따라)를 추가하고 37°C에서 2분 동안 배양합니다. 오가노이드가 2-10개의 세포로 구성된 작은 클러스터로 해리되는지 여부를 결정하기 위해 현미경으로 효소 분해 정도를 관찰합니다. 그렇지 않은 경우 효소 소화를 계속하십시오.
         참고: 과소화는 오가노이드 세포 클러스터를 단일 세포로 용해하여 생존율을 감소시키고 후속 배양 시간을 연장합니다.
      6. 소화를 중지하기 위해 적절한 양의 차가운 기초 배지(표 1)를 추가합니다.
      7. 오가노이드를 400× g 에서 8°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 가능한 한 상층액을 제거하십시오.
      8. 원하는 수의 오가노이드(24웰 플레이트의 웰당 1,000-5,000개의 오가노이드)를 적절한 도금용 매트릭스에 재현탁합니다. 섹션 1.2와 동일한 단계를 수행합니다.
         NOTE: 도금 밀도는 오가노이드의 성장 속도와 크기에 따라 최적화되어야 합니다.
      9. 오가노이드 성장의 밀도에 따라 1:3 또는 1:4의 비율로 10일마다 오가노이드를 통과시킵니다.
5. 오가노이드 동결 보존 및 소생술
   1. 오가노이드의 동결 보존
      1. 동결건조 튜브를 준비하고, 각 튜브는 오가노이드가 포함된 24웰 플레이트의 두 웰과 합류합니다.
      2. 오가노이드 통과를 위해 1.4.2.1 - 1.4.2.4 단계에 따라 BME가 없는 오가노이드를 얻고, 24웰 플레이트에 500μL/웰의 오가노이드 동결건조 용액을 추가하여 오가노이드를 부드럽게 재현탁합니다.
         NOTE: 오가노이드의 성장 상태와 크기에 따라 3세대까지 배양된 오가노이드를 냉동 보존하는 것이 좋습니다.
      3. 현탁액을 동결건조 튜브에 옮기고 -80°C의 그래디언트 냉각 상자에 넣습니다. -80°C에서 최소 24시간 동안 그래디언트 냉각한 후 장기 보관을 위해 튜브를 액체 질소로 옮깁니다.
   2. 오가노이드 소생술
      1. 37°C 수조에서 동결건조된 튜브를 배양하고 작은 얼음 덩어리만 남으면 배양을 중단합니다.
      2. 400× g 에서 8°C에서 5분 동안 원심분리하여 상층액을 완전히 제거합니다.
      3. 후속 작업을 위해 섹션 1.2 및 1.3을 따르십시오.

결과

앞서 언급한 절차를 시행하면 일반적으로 3일 이내에 HCC 오가노이드 스페로이드의 출현을 관찰할 수 있습니다(그림 1). 그림 1A,B는 확립된 HCC 오가노이드를 보여주며, 확립 초기에 둥근 모서리와 투과성 세포질을 특징으로 하는 소형 스페로이드를 즉시 개발합니다. HCC 오가노이드가 성장하는 동안 다양한 농도의 BME를 사용하면 오가노이드?...

토론

환자 유래 오가노이드 모델의 주목할 만한 이점 중 하나는 조직 구조와 게놈 지형을 포괄하는 종양의 생물학적 특성을 충실하게 복제할 수 있다는 것입니다. 이러한 모델은 놀라운 수준의 정확도를 보여주며 장기간 배양 기간에도 종양의 이질성과 진행을 효과적으로 반영합니다 ^6,8,9. 이 정교한 오가노이드 배양 프로토콜의 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
[Leu15]-gastrin I human	Merck	G9145
1.5 mL Microtubes	Merck	AXYMCT150LC
A8301 (TGFβ inhibitor)	Tocris Bioscience	2939
B27 Supplement (503), minus vitamin A	Thermo Fisher Scientific	12587010
B-27 Supplement (503), serum-free	Thermo Fisher Scientific	17504044
BMP7	Peprotech	120-03P
Cell strainer size 100 μm	Merck	CLS352360
CHIR99021	Merck	SML1046
Collagenase D	Merck	11088858001
Corning Costar Ultra-Low	Merck	CLS3473
Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile	Corning	3473
Costar 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile	Corning	3471
Cultrex Organoid Harvesting Solution	R&D SYSTEMS	3700-100-01	Organoid harvesting solution
Cultrex Reduced Growth Factor BME, Type 2 PathClear (BME)	Merck	3533-005-02
DAPT	Merck	D5942
Dexamethasone	Merck	D4902
DMSO	Merck	C6164
DNaseI	Merck	DN25
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12	Thermo Fisher Scientific	12634028	Advanced DMEM/F-12
Earle’s balanced salt solution (EBSS)	Thermo Fisher Scientific	24010043
Forceps	N/A	N/A
Forskolin	Tocris Bioscience	1099
GlutaMAX supplement	Thermo Fisher Scientific	35050061
HEPES, 1 M	Thermo Fisher Scientific	15630080
Leica DM6 B Fluorescence Motorized Microscope	Leica	N/A
N2 supplement (1003)	Thermo Fisher Scientific	17502048
N-acetylcysteine	Merck	A0737-5MG
Nicotinamide	Merck	N0636
Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	339651
Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	339653
Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122
Recombinant human EGF	Peprotech	AF-100-15
Recombinant human FGF10	Peprotech	100-26
Recombinant human FGF19	Peprotech	100-32
Recombinant human HGF	Peprotech	100-39
Recombinant human Noggin	Peprotech	120-10C
Rho kinase inhibitor Y-27632 dihydrochloride	Merck	Y0503
R-spodin1-conditioned medium	(Broutier et al.)	N/A	Secretion of cell lines
Surgical scissors	N/A	N/A
Surgical specimen of tumor removed from HCC patients	Affiliated Cancer Hospital and Institute of Guangzhou Medical University	N/A
TNFα	Peprotech	315-01A
TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red	Thermo Fisher Scientific	12604013	Trypsin substitute
Wnt-3a-conditioned medium	(Broutier et al.)	N/A	Secretion of cell lines