Desenvolvimento e Otimização de um Modelo Organoide Derivado de Pacientes com Carcinoma Hepatocelular Humano para Identificação de Alvos Potenciais e Descoberta de Drogas

Resumo

Fornecemos uma visão abrangente e refinamento dos protocolos existentes para a formação de organoides de carcinoma hepatocelular (CHC), abrangendo todas as etapas do cultivo de organoides. Esse sistema serve como um modelo valioso para a identificação de potenciais alvos terapêuticos e a avaliação da efetividade de candidatos a fármacos.

Resumo

O carcinoma hepatocelular (CHC) é um tumor altamente prevalente e letal em todo o mundo e sua descoberta tardia e a falta de agentes terapêuticos específicos eficazes requerem mais pesquisas sobre sua patogênese e tratamento. Os organoides, um novo modelo que se assemelha muito ao tecido tumoral nativo e pode ser cultivado in vitro, têm despertado interesse significativo nos últimos anos, com numerosos relatos sobre o desenvolvimento de modelos organoides para câncer de fígado. Neste estudo, otimizamos com sucesso o procedimento e estabelecemos um protocolo de cultura que permite a formação de organoides de CHC de maior tamanho com condições estáveis de passagem e cultura. Descrevemos de forma abrangente cada etapa do procedimento, cobrindo todo o processo de dissociação tecidual do CHC, plaqueamento organoide, cultura, passagem, criopreservação e ressuscitação, e fornecemos precauções detalhadas neste artigo. Esses organoides exibem similaridade genética com os tecidos originais do CHC e podem ser utilizados para diversas aplicações, incluindo a identificação de potenciais alvos terapêuticos para tumores e subsequente desenvolvimento de drogas.

Introdução

O carcinoma hepatocelular (CHC), um tumor prevalente e extensamente^diverso1, tem recebido considerável atenção na comunidade médica. A presença de plasticidade de linhagem e heterogeneidade substancial no CHC sugere que células tumorais originadas de vários pacientes e mesmo lesões distintas dentro de um mesmo paciente podem manifestar características moleculares e fenotípicas diferentes, apresentando obstáculos formidáveis no avanço de abordagens terapêuticas inovadoras2,3,4,5. Consequentemente, é imperiosa a necessidade de maior compreensão dos atributos biológicos e mecanismos de resistência às drogas no CHC para subsidiar a formulação de estratégias de tratamento mais eficazes.

Nas últimas décadas, pesquisadores têm dedicado seus esforços ao desenvolvimento de modelos in vitro com a finalidade de estudar o CHC ^3,4. Apesar de alguns avanços, as limitações persistem. Esses modelos englobam uma variedade de técnicas, como a utilização de linhagens celulares, células primárias e xenoenxertos derivados do paciente (PDX). As linhagens celulares servem como modelos in vitro para cultura a longo prazo de células tumorais obtidas de pacientes com CHC, oferecendo os benefícios de conveniência e fácil expansão. Os modelos celulares primários envolvem o isolamento direto e o cultivo de células tumorais primárias de tecidos tumorais dos pacientes, fornecendo assim uma representação de características biológicas que se assemelham muito às dos próprios pacientes. Os modelos PDX envolvem o transplante de tecidos tumorais de pacientes em camundongos, com o objetivo de simular mais fielmente o crescimento e a resposta tumoral. Esses modelos têm sido fundamentais na pesquisa do CHC, mas possuem certas limitações, incluindo a heterogeneidade das linhagens celulares e a incapacidade de replicar totalmente as condições in vivo. Além disso, o cultivo in vitro prolongado pode resultar na deterioração das características e funcionalidades originais das células, colocando desafios na representação precisa das propriedades biológicas do CHC. Além disso, a utilização de modelos PDX é demorada e dispendiosa³.

Para abordar essas limitações e replicar com mais precisão os atributos fisiológicos do CHC, a utilização da tecnologia organoide tem sido introduzida como uma plataforma de pesquisa promissora capaz de superar restrições anteriores. Os organoides, que são modelos celulares tridimensionais cultivados in vitro, têm a capacidade de replicar a estrutura e a funcionalidade de órgãos reais. No entanto, no contexto do CHC, existem alguns desafios no estabelecimento de modelos organoides. Esses desafios incluem descrições insuficientemente detalhadas dos procedimentos de construção de organoides de CHC, falta de protocolos abrangentes para todo o processo de construção de organoides de CHC e o tamanho tipicamente pequeno de organoides cultivados ^6,7,8. À luz das dimensões tipicamente limitadas dos organoides cultivados, nós nos esforçamos para enfrentar esses desafios através do desenvolvimento de um protocolo abrangente abrangendo a totalidade da construção de organoides de CHC⁶. Esse protocolo engloba dissociação tecidual, plaqueamento organoide, cultura, passaging, criopreservação e ressuscitação. Otimizando as etapas do procedimento e refinando a composição do meio de cultura, estabelecemos com sucesso modelos organoides de CHC capazes de crescimento sustentado e passaging a longo prazo ^6,8. Nas seções subsequentes, um relato abrangente dos meandros operacionais e fatores pertinentes envolvidos na construção de organoides de CHC será apresentado.

Protocolo

Tecidos biopsiados por humanos foram obtidos do respectivo paciente no Hospital e Instituto de Câncer Afiliado da Universidade de Medicina de Guangzhou, e consentimento informado foi obtido dos pacientes. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre todos os materiais, reagentes e instrumentos usados neste protocolo.

1. Estabelecimento de organoides de CHC derivados do paciente a partir de amostras cirúrgicas

NOTA: O estabelecimento dos organoides de CHC engloba várias etapas, nomeadamente dissociação tecidual, plaqueamento organoide, cultura, passagem, criopreserva e ressuscitação. O processo de dissociação do tecido requer uma duração de 2 h, enquanto a semeadura de organoides em uma placa leva aproximadamente 40 min. Em seguida, a geração inicial de organoides de CHC passa por um período de cultura de 10-14 dias usando meio de isolamento de CHC. Uma vez alcançada uma densidade satisfatória, são conduzidas passagens organoides, o que requer 1 h. Culturas subsequentes dos organoides são então mantidas usando meio de expansão de CHC por 7-10 dias, que podem variar dependendo da taxa de crescimento e condição dos organoides.

1. Dissociação tecidual
   1. Preparação de suprimentos e materiais
      1. Coletar 1-2 cm³ de tecido de CHC de pacientes que não receberam nenhum tratamento local ou sistêmico prévio antes da operação. Após a ressecção cirúrgica, manter o tecido a 4 °C em solução de preservação tecidual (Tabela 1) até o processamento.
         NOTA: Amostras de tecido fresco de alta qualidade são essenciais para o estabelecimento bem-sucedido de organoides. É importante processar as amostras prontamente, idealmente dentro de 1-4 h após a ressecção cirúrgica para manter a viabilidade tecidual. Realizar todos os procedimentos subsequentes em ambiente asséptico utilizando materiais estéreis e reagentes.
      2. Pré-aqueça placas de cultura de células de superfície de fixação ultrabaixa (24 poços) por 1 h em uma incubadora a 37 °C. Descongelar o extrato congelado da membrana basal (BME) durante a noite a 4 °C até pouco antes do uso.
         OBS: Para garantir o descongelamento completo da EMB, esta deve ser colocada no gelo por pelo menos 3 h. O derretimento completo da EMB é essencial para o sucesso da cultura de organoides nas etapas subsequentes.
      3. Antes da utilização, certifique-se de que a solução de digestão (quadro 1) é aquecida a uma temperatura de 37 °C.
         NOTA: Prepare a solução de digestão na hora em um ambiente asséptico e utilize-a prontamente.
   2. Fluxo de processamento organizacional
      1. Em uma cabine de fluxo laminar, cortar o tecido tumoral em pequenos pedaços (0,5-1 mm³) usando tesoura cirúrgica em uma placa de Petri. Transferir o tecido clipado para um tubo cônico de 15 mL e adicionar 5-10 mL de meio basal (Tabela 1).
         NOTA: O meio basal (Tabela 1) pode ser armazenado a 4 °C por até 1 mês.
      2. Use uma pipeta barotrópica para lavar o máximo de sangue possível e deixe-o repousar por 1-2 minutos para remover parte do sobrenadante, incluindo quaisquer células sanguíneas e coágulos de gordura flutuantes. Repita este procedimento duas vezes.
      3. Centrifugar a mistura a 300 × g durante 5 minutos à temperatura ambiente e remover cuidadosamente o sobrenadante. Adicionar 5 mL da solução de digestão pré-aquecida (Tabela 1) ao tecido aparado.
      4. Girar o tubo a 37 °C para digestão.
      5. Após 30 minutos de digestão inicial, procure pequenos aglomerados de células ao microscópio. Verifique a cada 5-10 minutos para evitar a digestão excessiva.
         NOTA: O tempo necessário para a digestão do tecido dependerá do tamanho e do tipo de tecido. A digestão dos tecidos não deve exceder 90 min. O tecido superdigerido aparecerá sob o microscópio como uma grande folha de células individuais. O nível adequado de digestão é indicado pelo fato de que a maioria deles são cachos de células e têm uma aparência semelhante à uva.
      6. Interromper a digestão adicionando meio basal frio (Tabela 1) e filtrar em um novo tubo de 50 mL com um filtro de células de 100 μm. Adicionar meio basal frio a um volume de 50 mL.
      7. Centrifugar as células a 2 × g durante 10 min a 8 °C. Retirar cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender o pellet adicionando mais 50 mL de meio basal gelado (Tabela 1). Repita esta etapa duas vezes.
         NOTA: A centrifugação de baixa velocidade é usada para permitir que pequenos aglomerados de células se estabeleçam, enquanto as células sanguíneas e os detritos celulares ainda estão suspensos no sobrenadante; O processo é repetido várias vezes para obter uma massa celular de tecido relativamente pura.
2. Revestimento organoide
   1. Após a segunda lavagem, remova o máximo possível do sobrenadante e ressuspenda o número desejado de células (1.000-5.000 células por poço de uma placa de 24 poços) na EMB apropriada para plaqueamento.
      NOTA: Mantenha sempre o EMB a 4 °C antes da utilização.
   2. Adicione BME e suspenda clusters de células pequenas no Advanced DMEM/F-12 adicionando BME e pipetando suavemente para cima e para baixo até que os agregados celulares sejam completamente suspensos. Controlar a concentração do EMB entre 30% e 50%.
   3. Sementes de 50 μL de gotículas de BME misturadas com aglomerados celulares no centro de placas de cultura de 24 poços.
      OBS: Na medida do possível, não deixe as gotículas se espalharem para a parede lateral da placa do poço. A parede lateral da placa de baixa adsorção não está em um estado de baixa adsorção, e o contato entre as gotículas e a parede lateral levará à adesão, o que não é propício para a incubação subsequente.
   4. Deixe as placas com as gotículas adicionadas solidificarem a 37 °C por 20 min. Ao final da incubação, adicionar 500 μL de meio pré-aquecido (Tabela 1) a cada poço e incubar em incubadora celular a 37 °C.
3. Cultura de organoides
   1. Atualizar o meio de cultura (Tabela 1) uma vez a cada 2-3 dias. No início do cultivo, cultivar os organoides do CHC em meio de isolamento de CHC (Tabela 1) por 2 semanas.
   2. Após 2 semanas de incubação com meio de isolamento de CHC, substituir o meio por meio de expansão organoide HCC (Tabela 1) (armazenado a 4 °C por até 2 semanas).
   3. Refrescar o meio de cultura uma vez a cada 3 dias.
   4. Após 7-10 dias de cultivo com meio de expansão de CHC, quando o organoide tiver atingido a densidade ou tamanho apropriado, iniciar intervenções experimentais ou passar ou liofilizar os organoides conforme necessário.
4. Passaging organoide
   1. Preparação de suprimentos e materiais
      1. Pré-aqueça placas de cultura de células de superfície de fixação ultrabaixa (24 poços) por 1 h em uma incubadora a 37 °C. Descongelar BME congelado durante a noite a 4 °C até pouco antes da utilização.
      2. Pré-aquecer solução de colheita organoide e substituto de tripsina a 37 °C por 30 min.
   2. processo de passagem
      1. Após a remoção do meio de cultura da placa do poço, transferir a suspensão organoide para um tubo de 15 mL.
      2. Adicionar solução de colheita de organoides de acordo com a quantidade de BME (500 μL de solução de colheita de organoides por 50 μL de BME) raspando e pipetando para cima e para baixo usando uma pistola de pipeta de 1.000 μL.
         NOTA: Evite bolhas de ar durante todo o processo para evitar a perda de organoides, pois a presença de bolhas de ar indica maior pressão de pipetagem.
      3. Incubar durante 30 min à temperatura ambiente.
      4. Aspirar suavemente a EMB com uma pipeta de 1.000 μL e observar se a EMB está completamente dissolvida. Observe a cada 10 min até que um aglomerado de células organoides claro seja observado, em seguida, centrifugar a 400 × g por 5 min à temperatura ambiente e remover o máximo possível do sobrenadante.
         NOTA: Nesta fase, o organoide pode ser congelado e preservado.
      5. Para digestão enzimática de organoides, adicionar 1-5 mL do substituto de tripsina (de acordo com o número de organoides) e incubar a 37 °C por 2 min. Observar ao microscópio o grau de digestão enzimática para determinar se os organoides se dissociam em pequenos aglomerados de 2-10 células; Caso contrário, continue a digestão enzimática.
         NOTA: A superdigestão resultará na lise de aglomerados de células organoides em células únicas, diminuindo sua viabilidade e prolongando o tempo de cultura subsequente.
      6. Adicionar o volume adequado de meio basal frio (Tabela 1) para interromper a digestão.
      7. Centrifugar os organoides a 400 × g durante 5 min a 8 °C; Remova o sobrenadante tanto quanto possível.
      8. Ressuspender o número desejado de organoides (1.000-5.000 organoides por poço de uma placa de 24 poços) na matriz apropriada para plaqueamento. Siga os mesmos passos da secção 1.2.
         NOTA: A densidade de revestimento deve ser otimizada de acordo com a taxa de crescimento e tamanho dos organoides.
      9. Passe os organoides a cada 10 dias na proporção de 1:3 ou 1:4, dependendo da densidade de crescimento organoidal.
5. Criopreservação e ressuscitação organoide
   1. Criopreservação de organoides
      1. Preparar tubos de liofilização, cada tubo confluente com dois poços de uma placa de 24 poços contendo organoides.
      2. Siga os passos 1.4.2.1 a 1.4.2.4 para a passagem de organoides para obter organoides sem EMB e ressuspenda suavemente os organoides adicionando 500 μL/poço de solução de liofilização organoide a uma placa de 24 poços.
         NOTA: Dependendo do estado de crescimento e tamanho dos organoides, recomenda-se criopreservar os organoides em cultura até a terceira geração.
      3. Transfira a suspensão para tubos de liofilização e coloque-a numa caixa de arrefecimento gradiente a -80 °C. Após o resfriamento do gradiente a -80 °C por pelo menos 24 h, transfira os tubos para nitrogênio líquido para armazenamento de longo prazo.
   2. Ressuscitação de organoides
      1. Incubar tubos liofilizados em banho-maria a 37 °C e interromper a incubação quando restar apenas um pequeno bloco de gelo.
      2. Centrifugar a 400 × g durante 5 min a 8 °C para remover completamente o sobrenadante.
      3. Siga as seções 1.2 e 1.3 para operações subsequentes.

Resultados

Ao implementar o procedimento supracitado, a emergência de esferoides organoides do CHC é tipicamente observável em um período de 3 dias (Figura 1). A Figura 1A,B mostra o organoide estabelecido do CHC, que prontamente desenvolve esferoides compactos caracterizados por bordas arredondadas e citosol permeável no dia inicial de estabelecimento. Durante o crescimento dos organoides HCC, o uso de diferentes concentrações de BME teve diferente...

Discussão

Um benefício notável dos modelos organoides derivados do paciente reside em sua capacidade de replicar fielmente as características biológicas dos tumores, abrangendo a estrutura do tecido e a paisagem genômica. Esses modelos demonstram um notável nível de acurácia e refletem efetivamente a heterogeneidade e a progressão dos tumores, mesmo durante longos períodos de^cultivo6,8,9. Através da utilização deste refinado ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
[Leu15]-gastrin I human	Merck	G9145
1.5 mL Microtubes	Merck	AXYMCT150LC
A8301 (TGFβ inhibitor)	Tocris Bioscience	2939
B27 Supplement (503), minus vitamin A	Thermo Fisher Scientific	12587010
B-27 Supplement (503), serum-free	Thermo Fisher Scientific	17504044
BMP7	Peprotech	120-03P
Cell strainer size 100 μm	Merck	CLS352360
CHIR99021	Merck	SML1046
Collagenase D	Merck	11088858001
Corning Costar Ultra-Low	Merck	CLS3473
Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile	Corning	3473
Costar 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile	Corning	3471
Cultrex Organoid Harvesting Solution	R&D SYSTEMS	3700-100-01	Organoid harvesting solution
Cultrex Reduced Growth Factor BME, Type 2 PathClear (BME)	Merck	3533-005-02
DAPT	Merck	D5942
Dexamethasone	Merck	D4902
DMSO	Merck	C6164
DNaseI	Merck	DN25
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12	Thermo Fisher Scientific	12634028	Advanced DMEM/F-12
Earle’s balanced salt solution (EBSS)	Thermo Fisher Scientific	24010043
Forceps	N/A	N/A
Forskolin	Tocris Bioscience	1099
GlutaMAX supplement	Thermo Fisher Scientific	35050061
HEPES, 1 M	Thermo Fisher Scientific	15630080
Leica DM6 B Fluorescence Motorized Microscope	Leica	N/A
N2 supplement (1003)	Thermo Fisher Scientific	17502048
N-acetylcysteine	Merck	A0737-5MG
Nicotinamide	Merck	N0636
Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	339651
Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	339653
Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122
Recombinant human EGF	Peprotech	AF-100-15
Recombinant human FGF10	Peprotech	100-26
Recombinant human FGF19	Peprotech	100-32
Recombinant human HGF	Peprotech	100-39
Recombinant human Noggin	Peprotech	120-10C
Rho kinase inhibitor Y-27632 dihydrochloride	Merck	Y0503
R-spodin1-conditioned medium	(Broutier et al.)	N/A	Secretion of cell lines
Surgical scissors	N/A	N/A
Surgical specimen of tumor removed from HCC patients	Affiliated Cancer Hospital and Institute of Guangzhou Medical University	N/A
TNFα	Peprotech	315-01A
TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red	Thermo Fisher Scientific	12604013	Trypsin substitute
Wnt-3a-conditioned medium	(Broutier et al.)	N/A	Secretion of cell lines