Разработка и оптимизация модели органоида гепатоцеллюлярной карциномы человека, полученной от пациента, для идентификации потенциальных мишеней и поиска лекарств

Резюме

Мы предоставляем всесторонний обзор и уточнение существующих протоколов формирования органоидов гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК), охватывающих все этапы культивирования органоидов. Эта система служит ценной моделью для идентификации потенциальных терапевтических мишеней и оценки эффективности препаратов-кандидатов.

Аннотация

Гепатоцеллюлярная карцинома (ГЦК) является широко распространенной и смертельной опухолью во всем мире, и ее позднее обнаружение и отсутствие эффективных специфических терапевтических агентов требуют дальнейших исследований ее патогенеза и лечения. Органоиды, новая модель, которая очень похожа на нативную опухолевую ткань и может быть культивирована in vitro, вызвали значительный интерес в последние годы, с многочисленными сообщениями о разработке органоидных моделей для рака печени. В этом исследовании мы успешно оптимизировали процедуру и разработали протокол культивирования, который позволяет формировать органоиды ГЦК более крупного размера со стабильными условиями пассажа и культивирования. В этой статье мы подробно описали каждый этап процедуры, охватывая весь процесс диссоциации тканей ГЦК, органоидного покрытия, культивирования, пассажа, криоконсервации и реанимации, а также подробно описали меры предосторожности. Эти органоиды демонстрируют генетическое сходство с исходными тканями ГЦК и могут быть использованы для различных применений, включая идентификацию потенциальных терапевтических мишеней для опухолей и последующую разработку лекарств.

Введение

Гепатоцеллюлярная карцинома (ГЦК), широко распространенная и широко разнообразная опухоль¹, привлекла значительное внимание в медицинском сообществе. Наличие линейной пластичности и существенной гетерогенности в ГЦК позволяет предположить, что опухолевые клетки, происходящие от разных пациентов, и даже различные поражения у одного и того же пациента могут проявлять несхожие молекулярные и фенотипические признаки, тем самым создавая огромные препятствия для продвижения инновационных терапевтических подходов 2,3,4,5 . Следовательно, существует настоятельная необходимость в более глубоком понимании биологических свойств и механизмов лекарственной устойчивости при ГЦК для разработки более эффективных стратегий лечения.

В последние десятилетия исследователи посвятили свои усилия разработке моделей in vitro с целью изучения ГЦК ^3,4. Несмотря на некоторые достижения, ограничения сохраняются. Эти модели охватывают целый ряд методов, таких как использование клеточных линий, первичных клеток и ксенотрансплантатов, полученных от пациента (PDX). Клеточные линии служат моделями in vitro для долгосрочного культивирования опухолевых клеток, полученных от пациентов с ГЦК, предлагая преимущества удобства и легкого расширения. Модели первичных клеток предполагают прямое выделение и культивирование первичных опухолевых клеток из опухолевых тканей пациента, тем самым обеспечивая представление биологических характеристик, которые очень похожи на характеристики самих пациентов. PDX-модели предполагают трансплантацию опухолевых тканей пациента мышам с целью более точного моделирования роста опухоли и ответной реакции. Эти модели сыграли важную роль в исследованиях ГЦК, но они обладают определенными ограничениями, включая гетерогенность клеточных линий и неспособность полностью реплицироваться в условиях in vivo. Кроме того, длительное культивирование in vitro может привести к ухудшению исходных характеристик и функциональности клеток, что создает проблемы с точным представлением биологических свойств ГЦК. Кроме того, использование моделей PDX отнимает много времени и средств³.

Для устранения этих ограничений и более точного воспроизведения физиологических свойств ГЦК было введено использование органоидной технологии в качестве перспективной исследовательской платформы, способной превзойти предыдущие ограничения. Органоиды, которые представляют собой трехмерные клеточные модели, культивируемые in vitro, обладают способностью воспроизводить структуру и функциональность реальных органов. Тем не менее, в контексте ГЦК существуют определенные проблемы в создании органоидных моделей. Эти проблемы включают в себя недостаточно подробное описание процедур конструирования органоидов ГЦК, отсутствие всеобъемлющих протоколов для всего процесса конструирования органоидов ГЦК и, как правило, небольшой размер культивируемых органоидов ^6,7,8. В свете обычно ограниченных размеров культивируемых органоидов мы попытались решить эти проблемы путем разработки всеобъемлющего протокола, охватывающего всю конструкцию органоида ГЦК⁶. Этот протокол включает в себя диссоциацию тканей, органоидное покрытие, культивирование, пассаж, криоконсервацию и реанимацию. Оптимизировав технологические этапы и уточнив состав питательной среды, мы успешно создали модели органоидов ГЦК, способные к устойчивому росту и длительному пассажу ^6,8. В последующих разделах будет представлен всесторонний отчет об эксплуатационных тонкостях и соответствующих факторах, участвующих в построении органоидов ГЦК.

протокол

Биопсия тканей человека была получена от соответствующего пациента в Аффилированной онкологической больнице и Институте Медицинского университета Гуанчжоу, и от пациентов было получено информированное согласие. Подробные сведения обо всех материалах, реагентах и инструментах, используемых в этом протоколе, см. в таблице материалов .

1. Получение органоидов ГЦК из хирургических образцов

ПРИМЕЧАНИЕ: Создание органоидов ГЦК включает в себя различные стадии, а именно диссоциацию тканей, покрытие органоидами, культивирование, пассаж, криоконсервацию и реанимацию. Процесс диссоциации тканей занимает 2 часа, в то время как посев органоидов на пластину занимает около 40 минут. После этого первоначальное поколение органоидов ГЦК подвергается культивированию продолжительностью 10-14 дней с использованием изоляционной среды ГЦК. После достижения удовлетворительной плотности проводятся органоидные пассажи, для которых требуется 1 ч. Последующие культуры органоидов затем выдерживают с помощью расширительной среды ГЦК в течение 7-10 дней, которые могут варьироваться в зависимости от скорости роста и состояния органоидов.

1. Диссоциация тканей
   1. Подготовка расходных материалов и материалов
      1. Возьмите 1-2^см3 ткани ГЦК у пациентов, которые ранее не получали местного или системного лечения до операции. После хирургической резекции ткань выдерживают при температуре 4 °С в тканкоконсервирующем растворе (табл. 1) до обработки.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Высококачественные образцы свежих тканей необходимы для успешного создания органоидов. Важно обрабатывать образцы быстро, в идеале в течение 1-4 ч после хирургической резекции, чтобы сохранить жизнеспособность тканей. Все последующие процедуры проводить в асептической среде с использованием стерильных материалов и реагентов.
      2. Предварительно нагрейте планшеты клеточных культур со сверхнизкой поверхностью присоединения (24 лунки) в течение 1 ч в инкубаторе при 37 °C. Разморозьте замороженный экстракт базальной мембраны (BME) в течение ночи при температуре 4 °C непосредственно перед использованием.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы обеспечить полное оттаивание BME, его необходимо поместить на лед не менее чем на 3 часа. Полное плавление БМЭ необходимо для успешного культивирования органоидов на последующих этапах.
      3. Перед применением убедитесь, что раствор для сбраживания (таблица 1) подогрет до температуры 37 °C.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте раствор для сбраживания свежим в асептической среде и немедленно утилизируйте его.
   2. Организационный поток обработки
      1. В ламинарном проточном кабинете хирургическими ножницами на чашке Петри разрезать опухолевую ткань на мелкие кусочки (0,5-1^мм3). Переложите обрезанную ткань в коническую пробирку объемом 15 мл и добавьте 5-10 мл базальной среды (табл. 1).
         ПРИМЕЧАНИЕ: Базальную среду (табл. 1) можно хранить при температуре 4 °C до 1 месяца.
      2. Используйте баротропную пипетку, чтобы смыть как можно больше крови, и дайте ей постоять 1-2 минуты, чтобы удалить часть надосадочной жидкости, включая любые клетки крови и плавающие жировые сгустки. Повторите эту процедуру дважды.
      3. Центрифужируют смесь при 300 × г в течение 5 мин при комнатной температуре и осторожно удаляют надосадочную жидкость. Добавьте 5 мл предварительно подогретого раствора для сбраживания (табл. 1) к обрезанной ткани.
      4. Поверните трубку на 37 °C для разложения.
      5. Через 30 минут после первоначального пищеварения ищите небольшие скопления клеток под микроскопом. Проверяйте каждые 5-10 минут, чтобы избежать переваривания.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Время, необходимое для переваривания тканей, будет зависеть от размера и типа ткани. Переваривание тканей не должно превышать 90 мин. Переваренная ткань будет выглядеть под микроскопом в виде большого листа отдельных клеток. На соответствующий уровень пищеварения указывает тот факт, что большинство из них представляют собой скопления клеток и имеют виноградоподобный вид.
      6. Остановите пищеварение, добавив холодную базальную среду (Таблица 1), и отфильтруйте в новую пробирку объемом 50 мл с клеточным фильтром 100 мкм. Добавить холодную базальную среду до объема 50 мл.
      7. Центрифугируют клетки при 2 × г в течение 10 мин при 8 °С. Осторожно удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу, добавив еще 50 мл холодной базальной среды (Таблица 1). Повторите этот шаг дважды.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Низкоскоростное центрифугирование используется для того, чтобы небольшие клеточные кластеры оседали, в то время как клетки крови и клеточный мусор все еще находятся во взвешенном состоянии в надосадочной жидкости; Процесс повторяют несколько раз для получения относительно чистой клеточной массы ткани.
2. Органоидное покрытие
   1. После второй промывки удалите как можно больше надосадочной жидкости и повторно суспендируйте желаемое количество клеток (1000-5000 клеток на лунку 24-луночного планшета) в соответствующем BME для покрытия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед использованием всегда держите BME при температуре 4 °C.
   2. Добавьте BME и приостановите кластеры малых сот в Advanced DMEM/F-12, добавив BME и осторожно пипетируя вверх и вниз до тех пор, пока агрегаты клеток не будут полностью приостановлены. Контролируйте концентрацию BME в диапазоне от 30% до 50%.
   3. Высевают 50 мкл капель BME, смешанных с клеточными кластерами, в центр 24-луночных культуральных планшетов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: По возможности не допускайте попадания капель на боковую стенку лунки. Боковая стенка низкоадсорбционной пластины не находится в низкоадсорбционном состоянии, и контакт между каплями и боковой стенкой приведет к адгезии, что не способствует последующей инкубации.
   4. Дайте пластинам с добавленными каплями затвердеть при температуре 37 °C в течение 20 минут. По окончании инкубации в каждую лунку добавляют по 500 мкл предварительно подогретой среды (табл. 1) и инкубируют в клеточном инкубаторе при температуре 37 °С.
3. Органоидная культура
   1. Обновляйте питательную среду (табл. 1) один раз в 2-3 дня. В начале культивирования культивируют органоиды ГЦК в изоляционной среде ГЦК (табл. 1) в течение 2 недель.
   2. После 2 недель инкубации с изолирующей средой ГЦК замените среду органоидным расширением ГЦК (Таблица 1) (хранить при 4 °C до 2 недель).
   3. Обновляйте питательную среду один раз в 3 дня.
   4. После 7-10 дней культивирования с помощью расширительной среды ГЦК, когда органоид достигнет соответствующей плотности или размера, начинайте экспериментальные вмешательства или пассаж или лиофилизацию органоидов по мере необходимости.
4. Органоидный пассаж
   1. Подготовка расходных материалов и материалов
      1. Предварительно нагрейте планшеты клеточных культур со сверхнизкой поверхностью присоединения (24 лунки) в течение 1 ч в инкубаторе при 37 °C. Разморозьте замороженный BME в течение ночи при температуре 4 °C непосредственно перед использованием.
      2. Раствор органоидов и заменитель трипсина разогреть при 37 °C в течение 30 минут.
   2. Процесс пассажа
      1. После извлечения питательной среды из луночного планшета переложите органоидную суспензию в пробирку объемом 15 мл.
      2. Добавьте раствор для забора органоидов в соответствии с количеством BME (500 мкл раствора для сбора органоидов на 50 мкл BME) путем соскабливания и пипетирования вверх и вниз с помощью пистолета-пипетки объемом 1 000 мкл.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте образования пузырьков воздуха на протяжении всего процесса, чтобы предотвратить потерю органоидов, так как наличие пузырьков воздуха указывает на более высокое давление пипетирования.
      3. Выдерживать 30 мин при комнатной температуре.
      4. Осторожно аспирируйте BME с помощью пипетки на 1 000 мкл и наблюдайте, что BME полностью растворился. Наблюдайте каждые 10 мин до появления прозрачного кластера органоидных клеток, затем центрифугируйте при 400 × г в течение 5 минут при комнатной температуре и удаляйте как можно больше надосадочной жидкости.
         ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе органоид можно заморозить и законсервировать.
      5. Для ферментативного расщепления органоидов добавляют 1-5 мл заменителя трипсина (в зависимости от количества органоидов) и инкубируют при 37 °С в течение 2 мин. Понаблюдайте под микроскопом за степенью ферментативного расщепления, чтобы определить, диссоциируют ли органоиды на небольшие кластеры по 2-10 клеток; Если нет, продолжайте ферментативное сбраживание.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Переваривание приводит к лизису кластеров органоидных клеток в отдельные клетки, снижая их жизнеспособность и продлевая время последующего культивирования.
      6. Добавьте соответствующий объем холодной базальной среды (табл. 1), чтобы остановить пищеварение.
      7. Центрифугируют органоиды при 400 × г в течение 5 мин при 8 °С; Удалите надосадочную жидкость по мере возможности.
      8. Ресуспендируйте желаемое количество органоидов (1000-5000 органоидов на лунку 24-луночного планшета) в соответствующую матрицу для гальванизации. Выполните те же действия, что и в разделе 1.2.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Плотность покрытия должна быть оптимизирована в соответствии со скоростью роста и размером органоидов.
      9. Пропускают органоиды каждые 10 дней в соотношении 1:3 или 1:4 в зависимости от плотности роста органоидов.
5. Криоконсервация и реанимация органоидов
   1. Криоконсервация органоидов
      1. Подготовьте пробирки для лиофилизации, каждая из которых сливается с двумя лунками 24-луночной пластины, содержащей органоиды.
      2. Выполните шаги 1.4.2.1 - 1.4.2.4 для пропуска органоидов для получения органоидов без BME и осторожно ресуспендируйте органоиды, добавив 500 мкл/лунку раствора лиофилизации органоидов в 24-луночный планшет.
         ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от статуса роста и размера органоидов рекомендуется криоконсервировать органоиды в культуре до третьего поколения.
      3. Перелейте суспензию в пробирки для лиофилизации и поместите ее в бокс с градиентным охлаждением при температуре -80 °C. После градиентного охлаждения при -80 °C в течение не менее 24 ч переведите пробирки в жидкий азот для длительного хранения.
   2. Реанимация органоидов
      1. Инкубируйте лиофилизированные пробирки на водяной бане с температурой 37 °C и прекратите инкубацию, когда останется только небольшой кусок льда.
      2. Центрифугу при 400 × г в течение 5 мин при 8 °C до полного удаления надосадочной жидкости.
      3. Следуйте разделам 1.2 и 1.3 для последующих операций.

Результаты

После выполнения вышеупомянутой процедуры появление сфероидных сфероидов ГЦК обычно наблюдается в течение 3 дней (рис. 1). На рисунках 1А, Б показан установленный органоид ГЦК, который быстро развивает компактные сфероиды, характеризующиеся зак?...

Обсуждение

Одним из заметных преимуществ органоидных моделей, полученных от пациентов, является их способность точно воспроизводить биологические характеристики опухолей, охватывая структуру тканей и геномный ландшафт. Эти модели демонстрируют выдающийся уровень точности и эффективно отража?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
[Leu15]-gastrin I human	Merck	G9145
1.5 mL Microtubes	Merck	AXYMCT150LC
A8301 (TGFβ inhibitor)	Tocris Bioscience	2939
B27 Supplement (503), minus vitamin A	Thermo Fisher Scientific	12587010
B-27 Supplement (503), serum-free	Thermo Fisher Scientific	17504044
BMP7	Peprotech	120-03P
Cell strainer size 100 μm	Merck	CLS352360
CHIR99021	Merck	SML1046
Collagenase D	Merck	11088858001
Corning Costar Ultra-Low	Merck	CLS3473
Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile	Corning	3473
Costar 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile	Corning	3471
Cultrex Organoid Harvesting Solution	R&D SYSTEMS	3700-100-01	Organoid harvesting solution
Cultrex Reduced Growth Factor BME, Type 2 PathClear (BME)	Merck	3533-005-02
DAPT	Merck	D5942
Dexamethasone	Merck	D4902
DMSO	Merck	C6164
DNaseI	Merck	DN25
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12	Thermo Fisher Scientific	12634028	Advanced DMEM/F-12
Earle’s balanced salt solution (EBSS)	Thermo Fisher Scientific	24010043
Forceps	N/A	N/A
Forskolin	Tocris Bioscience	1099
GlutaMAX supplement	Thermo Fisher Scientific	35050061
HEPES, 1 M	Thermo Fisher Scientific	15630080
Leica DM6 B Fluorescence Motorized Microscope	Leica	N/A
N2 supplement (1003)	Thermo Fisher Scientific	17502048
N-acetylcysteine	Merck	A0737-5MG
Nicotinamide	Merck	N0636
Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	339651
Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	339653
Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122
Recombinant human EGF	Peprotech	AF-100-15
Recombinant human FGF10	Peprotech	100-26
Recombinant human FGF19	Peprotech	100-32
Recombinant human HGF	Peprotech	100-39
Recombinant human Noggin	Peprotech	120-10C
Rho kinase inhibitor Y-27632 dihydrochloride	Merck	Y0503
R-spodin1-conditioned medium	(Broutier et al.)	N/A	Secretion of cell lines
Surgical scissors	N/A	N/A
Surgical specimen of tumor removed from HCC patients	Affiliated Cancer Hospital and Institute of Guangzhou Medical University	N/A
TNFα	Peprotech	315-01A
TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red	Thermo Fisher Scientific	12604013	Trypsin substitute
Wnt-3a-conditioned medium	(Broutier et al.)	N/A	Secretion of cell lines