Potansiyel Hedef Belirleme ve İlaç Keşfi için İnsan Hepatoselüler Karsinomu Hasta Kaynaklı Organoid Modelinin Geliştirilmesi ve Optimizasyonu

Özet

Hepatoselüler karsinom (HCC) organoid oluşumu için organoid kültivasyonun tüm aşamalarını kapsayan mevcut protokollere kapsamlı bir genel bakış ve iyileştirme sunuyoruz. Bu sistem, potansiyel terapötik hedeflerin belirlenmesi ve ilaç adaylarının etkinliğinin değerlendirilmesi için değerli bir model görevi görmektedir.

Özet

Hepatosellüler karsinom (HCC) dünya çapında oldukça yaygın ve ölümcül bir tümördür ve geç keşfi ve etkili spesifik terapötik ajanların eksikliği, patogenezi ve tedavisi ile ilgili daha fazla araştırma yapılmasını gerektirmektedir. Doğal tümör dokusuna çok benzeyen ve in vitro kültürlenebilen yeni bir model olan organoidler, karaciğer kanseri için organoid modellerin geliştirilmesine ilişkin çok sayıda raporla son yıllarda büyük ilgi görmüştür. Bu çalışmada, prosedürü başarılı bir şekilde optimize ettik ve stabil pasajlama ve kültür koşulları ile daha büyük boyutlu HCC organoidlerinin oluşumunu sağlayan bir kültür protokolü oluşturduk. Bu yazıda, HCC doku ayrışması, organoid kaplama, kültür, pasaj, kriyoprezervasyon ve resüsitasyon sürecinin tamamını kapsayan prosedürün her adımını kapsamlı bir şekilde özetledik ve ayrıntılı önlemler sağladık. Bu organoidler, orijinal HCC dokularına genetik benzerlik gösterir ve tümörler için potansiyel terapötik hedeflerin belirlenmesi ve müteakip ilaç geliştirme dahil olmak üzere çeşitli uygulamalar için kullanılabilir.

Giriş

Yaygın ve çok çeşitli bir tümör^{olan hepatosellüler} karsinom (HCC) 1, tıp camiasında büyük ilgi görmüştür. HCC'de soy plastisitesinin ve önemli heterojenliğin varlığı, çeşitli hastalardan kaynaklanan tümör hücrelerinin ve hatta aynı hastadaki farklı lezyonların farklı moleküler ve fenotipik özellikler gösterebileceğini ve böylece yenilikçi terapötik yaklaşımların ilerlemesinde zorlu engeller oluşturabileceğini düşündürmektedir 2,3,4,5 . Sonuç olarak, daha etkili tedavi stratejilerinin formülasyonunu bilgilendirmek için....

Protokol

Guangzhou Tıp Üniversitesi'ne bağlı Kanser Hastanesi ve Enstitüsü'ndeki ilgili hastadan insan biyopsisi alınan dokular alındı ve hastalardan bilgilendirilmiş onam alındı. Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, reaktifler ve aletler hakkında ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.

1. Cerrahi örneklerden hasta kaynaklı HCC organoidlerinin oluşturulması

NOT: HCC organoidlerinin kurulması, doku ayrışması, organoid kaplama, kültür, pasaj, kriyoprezervasyon ve resüsitasyon gibi çeşitli aşamaları kapsar. Doku ayrışma işlemi 2 saatlik bir süre gerektirirken, organoidlerin bir plakaya to....

Tartışmalar

Hasta kaynaklı organoid modellerin dikkate değer bir yararı, doku yapısını ve genomik manzarayı kapsayan tümörlerin biyolojik özelliklerini aslına uygun olarak kopyalama kapasitelerinde yatmaktadır. Bu modeller dikkate değer bir doğruluk düzeyi gösterir ve uzun süreli ekim dönemlerinde bile tümörlerin heterojenliğini ve ilerlemesini etkili bir şekilde yansıtır ^6,8,9. Bu rafine organoid kültür protokolü.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
[Leu15]-gastrin I human	Merck	G9145
1.5 mL Microtubes	Merck	AXYMCT150LC
A8301 (TGFβ inhibitor)	Tocris Bioscience	2939
B27 Supplement (503), minus vitamin A	Thermo Fisher Scientific	12587010
B-27 Supplement (503), serum-free	Thermo Fisher Scientific	17504044
BMP7	Peprotech	120-03P
Cell strainer size 100 μm	Merck	CLS352360
CHIR99021	Merck	SML1046
Collagenase D	Merck	11088858001
Corning Costar Ultra-Low	Merck	CLS3473
Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile	Corning	3473
Costar 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile	Corning	3471
Cultrex Organoid Harvesting Solution	R&D SYSTEMS	3700-100-01	Organoid harvesting solution
Cultrex Reduced Growth Factor BME, Type 2 PathClear (BME)	Merck	3533-005-02
DAPT	Merck	D5942
Dexamethasone	Merck	D4902
DMSO	Merck	C6164
DNaseI	Merck	DN25
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12	Thermo Fisher Scientific	12634028	Advanced DMEM/F-12
Earle’s balanced salt solution (EBSS)	Thermo Fisher Scientific	24010043
Forceps	N/A	N/A
Forskolin	Tocris Bioscience	1099
GlutaMAX supplement	Thermo Fisher Scientific	35050061
HEPES, 1 M	Thermo Fisher Scientific	15630080
Leica DM6 B Fluorescence Motorized Microscope	Leica	N/A
N2 supplement (1003)	Thermo Fisher Scientific	17502048
N-acetylcysteine	Merck	A0737-5MG
Nicotinamide	Merck	N0636
Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	339651
Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	339653
Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122
Recombinant human EGF	Peprotech	AF-100-15
Recombinant human FGF10	Peprotech	100-26
Recombinant human FGF19	Peprotech	100-32
Recombinant human HGF	Peprotech	100-39
Recombinant human Noggin	Peprotech	120-10C
Rho kinase inhibitor Y-27632 dihydrochloride	Merck	Y0503
R-spodin1-conditioned medium	(Broutier et al.)	N/A	Secretion of cell lines
Surgical scissors	N/A	N/A
Surgical specimen of tumor removed from HCC patients	Affiliated Cancer Hospital and Institute of Guangzhou Medical University	N/A
TNFα	Peprotech	315-01A
TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red	Thermo Fisher Scientific	12604013	Trypsin substitute
Wnt-3a-conditioned medium	(Broutier et al.)	N/A	Secretion of cell lines