Potansiyel Hedef Belirleme ve İlaç Keşfi için İnsan Hepatoselüler Karsinomu Hasta Kaynaklı Organoid Modelinin Geliştirilmesi ve Optimizasyonu

Özet

Hepatoselüler karsinom (HCC) organoid oluşumu için organoid kültivasyonun tüm aşamalarını kapsayan mevcut protokollere kapsamlı bir genel bakış ve iyileştirme sunuyoruz. Bu sistem, potansiyel terapötik hedeflerin belirlenmesi ve ilaç adaylarının etkinliğinin değerlendirilmesi için değerli bir model görevi görmektedir.

Özet

Hepatosellüler karsinom (HCC) dünya çapında oldukça yaygın ve ölümcül bir tümördür ve geç keşfi ve etkili spesifik terapötik ajanların eksikliği, patogenezi ve tedavisi ile ilgili daha fazla araştırma yapılmasını gerektirmektedir. Doğal tümör dokusuna çok benzeyen ve in vitro kültürlenebilen yeni bir model olan organoidler, karaciğer kanseri için organoid modellerin geliştirilmesine ilişkin çok sayıda raporla son yıllarda büyük ilgi görmüştür. Bu çalışmada, prosedürü başarılı bir şekilde optimize ettik ve stabil pasajlama ve kültür koşulları ile daha büyük boyutlu HCC organoidlerinin oluşumunu sağlayan bir kültür protokolü oluşturduk. Bu yazıda, HCC doku ayrışması, organoid kaplama, kültür, pasaj, kriyoprezervasyon ve resüsitasyon sürecinin tamamını kapsayan prosedürün her adımını kapsamlı bir şekilde özetledik ve ayrıntılı önlemler sağladık. Bu organoidler, orijinal HCC dokularına genetik benzerlik gösterir ve tümörler için potansiyel terapötik hedeflerin belirlenmesi ve müteakip ilaç geliştirme dahil olmak üzere çeşitli uygulamalar için kullanılabilir.

Giriş

Yaygın ve çok çeşitli bir tümör^{olan hepatosellüler} karsinom (HCC) 1, tıp camiasında büyük ilgi görmüştür. HCC'de soy plastisitesinin ve önemli heterojenliğin varlığı, çeşitli hastalardan kaynaklanan tümör hücrelerinin ve hatta aynı hastadaki farklı lezyonların farklı moleküler ve fenotipik özellikler gösterebileceğini ve böylece yenilikçi terapötik yaklaşımların ilerlemesinde zorlu engeller oluşturabileceğini düşündürmektedir 2,3,4,5 . Sonuç olarak, daha etkili tedavi stratejilerinin formülasyonunu bilgilendirmek için HCC'de ilaç direncinin biyolojik özelliklerinin ve mekanizmalarının daha iyi anlaşılmasına ihtiyaç vardır.

Son yıllarda, araştırmacılar çabalarını HCC ^3,4'ü incelemek amacıyla in vitro modellerin geliştirilmesine adamışlardır. Bazı gelişmelere rağmen, sınırlamalar devam etmektedir. Bu modeller, hücre hatlarının, birincil hücrelerin ve hastadan türetilen ksenogreftlerin (PDX) kullanımı gibi bir dizi tekniği kapsar. Hücre hatları, HCC hastalarından elde edilen tümör hücrelerinin uzun süreli kültürü için in vitro modeller olarak hizmet eder ve kolaylık ve kolay genişleme avantajları sunar. Primer hücre modelleri, primer tümör hücrelerinin hasta tümör dokularından doğrudan izolasyonunu ve kültürünü içerir, böylece hastaların kendilerine çok benzeyen biyolojik özelliklerin bir temsilini sağlar. PDX modelleri, tümör büyümesini ve yanıtını daha sadık bir şekilde simüle etmek amacıyla hasta tümör dokularının farelere nakledilmesini gerektirir. Bu modeller HCC araştırmalarında etkili olmuştur, ancak hücre hatlarının heterojenliği ve in vivo koşullarda tam olarak kopyalanamaması dahil olmak üzere belirli sınırlamalara sahiptirler. Ayrıca, uzun süreli in vitro kültivasyon, hücrelerin orijinal özelliklerinin ve işlevlerinin bozulmasına neden olabilir ve HCC'nin biyolojik özelliklerini doğru bir şekilde temsil etmede zorluklar ortaya çıkarabilir. Ek olarak, PDX modellerinin kullanımı hem zaman alıcı hem de maliyetlidir³.

Bu sınırlamaları ele almak ve HCC'nin fizyolojik özelliklerini daha doğru bir şekilde çoğaltmak için, organoid teknolojisinin kullanımı, önceki kısıtlamaları aşabilen umut verici bir araştırma platformu olarak tanıtılmıştır. İn vitro kültürlenmiş üç boyutlu hücre modelleri olan organoidler, gerçek organların yapısını ve işlevselliğini kopyalama yeteneğine sahiptir. Bununla birlikte, HCC bağlamında, organoid modellerin oluşturulmasında bazı zorluklar vardır. Bu zorluklar arasında HCC organoid yapım prosedürlerinin yeterince ayrıntılı olmayan açıklamaları, HCC organoid yapımının tüm süreci için kapsamlı protokollerin eksikliği ve tipik olarak küçük boyutlu kültürlenmiş organoidler ^6,7,8 yer almaktadır. Kültürlenmiş organoidlerin tipik olarak sınırlı boyutları ışığında, HCC organoid yapısının tamamını kapsayan kapsamlı bir protokol geliştirerek bu zorlukların üstesinden gelmeye çalıştık⁶. Bu protokol doku ayrışması, organoid kaplama, kültür, pasaj, kriyoprezervasyon ve resüsitasyonu kapsar. Prosedürel adımları optimize ederek ve kültür ortamının bileşimini iyileştirerek, sürekli büyüme ve uzun vadeli geçiş yapabilen HCC organoid modellerini başarıyla kurduk ^6,8. Sonraki bölümlerde, HCC organoidlerinin yapımında yer alan operasyonel karmaşıklıkların ve ilgili faktörlerin kapsamlı bir açıklaması sunulacaktır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Guangzhou Tıp Üniversitesi'ne bağlı Kanser Hastanesi ve Enstitüsü'ndeki ilgili hastadan insan biyopsisi alınan dokular alındı ve hastalardan bilgilendirilmiş onam alındı. Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, reaktifler ve aletler hakkında ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.

1. Cerrahi örneklerden hasta kaynaklı HCC organoidlerinin oluşturulması

NOT: HCC organoidlerinin kurulması, doku ayrışması, organoid kaplama, kültür, pasaj, kriyoprezervasyon ve resüsitasyon gibi çeşitli aşamaları kapsar. Doku ayrışma işlemi 2 saatlik bir süre gerektirirken, organoidlerin bir plakaya tohumlanması yaklaşık 40 dakika sürer. Bunu takiben, HCC organoidlerinin ilk nesli, HCC izolasyon ortamı kullanılarak 10-14 günlük bir kültür periyoduna tabi tutulur. Tatmin edici bir yoğunluğa ulaşıldığında, 1 saat gerektiren organoid geçişler gerçekleştirilir. Organoidlerin müteakip kültürleri daha sonra 7-10 gün boyunca HCC genişleme ortamı kullanılarak korunur, bu da organoidlerin büyüme hızına ve durumuna bağlı olarak değişebilir.

1. Doku ayrışması
   1. Sarf malzemeleri ve malzemelerin hazırlanması
      1. Operasyon öncesi daha önce herhangi bir lokal veya sistemik tedavi almamış hastalardan 1-2^cm3 HCC dokusu toplayın. Cerrahi rezeksiyondan sonra, işleme kadar dokuyu doku koruma solüsyonunda (Tablo 1) 4 ° C'de tutun.
         NOT: Organoidlerin başarılı bir şekilde oluşturulması için yüksek kaliteli taze doku örnekleri gereklidir. Doku canlılığını korumak için numunelerin derhal, ideal olarak cerrahi rezeksiyondan sonraki 1-4 saat içinde işlenmesi önemlidir. Sonraki tüm prosedürleri steril malzemeler ve reaktifler kullanarak aseptik bir ortamda gerçekleştirin.
      2. Ultra düşük ataşman yüzeyli hücre kültürü plakalarını (24 oyuk) 37 °C'de bir inkübatörde 1 saat önceden ısıtın. Dondurulmuş bazal membran ekstraktını (BME) gece boyunca 4 °C'de kullanımdan hemen öncesine kadar çözdürün.
         NOT: BME'nin tamamen çözülmesini sağlamak için en az 3 saat buz üzerine yerleştirilmelidir. BME'nin tamamen erimesi, sonraki adımlarda başarılı organoid kültürü için gereklidir.
      3. Kullanmadan önce, sindirim solüsyonunun (Tablo 1) 37 °C'ye kadar ısıtıldığından emin olun.
         NOT: Çürütme solüsyonunu aseptik bir ortamda taze olarak hazırlayın ve hemen kullanın.
   2. Organizasyonel işlem akışı
      1. Laminer akış kabininde, bir Petri kabı üzerinde cerrahi makas kullanarak tümör dokusunu küçük parçalara (0,5-1^mm3) kesin. Kırpılmış dokuyu 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın ve 5-10 mL bazal ortam ekleyin (Tablo 1).
         NOT: Bazal ortam (Tablo 1) 4 °C'de 1 aya kadar saklanabilir.
      2. Mümkün olduğunca fazla kanı yıkamak için barotropik bir pipet kullanın ve kan hücreleri ve yüzen yağ pıhtıları da dahil olmak üzere süpernatantın bir kısmını çıkarmak için 1-2 dakika bekletin. Bu işlemi iki kez tekrarlayın.
      3. Karışımı oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 × g'da santrifüjleyin ve süpernatanı dikkatlice çıkarın. Kesilmiş dokuya 5 mL önceden ısıtılmış sindirim solüsyonu (Tablo 1) ekleyin.
      4. Sindirim için tüpü 37 °C'de döndürün.
      5. 30 dakikalık ilk sindirimden sonra, mikroskop altında küçük hücre kümeleri arayın. Aşırı sindirimi önlemek için her 5-10 dakikada bir kontrol edin.
         NOT: Doku sindirimi için gereken süre, dokunun boyutuna ve türüne bağlı olacaktır. Doku sindirimi 90 dakikayı geçmemelidir. Aşırı sindirilmiş doku, mikroskop altında büyük bir hücre tabakası olarak görünecektir. Uygun sindirim seviyesi, bunların çoğunun hücre kümeleri olması ve üzüm benzeri bir görünüme sahip olması ile gösterilir.
      6. Soğuk bazal ortam ekleyerek sindirimi durdurun (Tablo 1) ve 100 μm hücre filtreli yeni bir 50 mL tüpe süzün. 50 mL'lik bir hacme soğuk bazal ortam ekleyin.
      7. Hücreleri 2 × g'da 8 ° C'de 10 dakika santrifüj edin. Süpernatanı dikkatlice çıkarın ve 50 mL daha soğuk bazal ortam ekleyerek peleti yeniden süspanse edin (Tablo 1). Bu adımı iki kez tekrarlayın.
         NOT: Düşük hızlı santrifüjleme, küçük hücre kümelerinin yerleşmesine izin vermek için kullanılırken, kan hücreleri ve hücre kalıntıları hala süpernatantta asılı kalır; Nispeten saf bir doku hücresi kütlesi elde etmek için işlem birkaç kez tekrarlanır.
2. Organoid kaplama
   1. İkinci yıkamadan sonra, süpernatanı mümkün olduğunca çıkarın ve istenen sayıda hücreyi (24 oyuklu bir plakanın oyuğu başına 1.000-5.000 hücre) kaplama için uygun BME'de yeniden süspanse edin.
      NOT: BME'yi kullanmadan önce daima 4 °C'de tutun.
   2. BME ekleyin ve BME ekleyerek ve hücre agregaları tamamen süspanse olana kadar hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek Gelişmiş DMEM/F-12'de küçük hücre kümelerini askıya alın. BME konsantrasyonunu %30 ile %50 arasında kontrol edin.
   3. Tohum 50 μL BME damlacıkları, 24 oyuklu kültür plakalarının merkezinde hücre kümeleri ile karıştırılır.
      NOT: Mümkün olduğunca, damlacıkların kuyu plakasının yan duvarına yayılmasına izin vermeyin. Düşük adsorpsiyonlu plakanın yan duvarı düşük adsorpsiyon durumunda değildir ve damlacıklar ile yan duvar arasındaki temas, sonraki inkübasyona elverişli olmayan yapışmaya yol açacaktır.
   4. Eklenen damlacıkların bulunduğu plakaların 37 °C'de 20 dakika katılaşmasına izin verin. İnkübasyonun sonunda, her bir oyuğa 500 μL önceden ısıtılmış ortam (Tablo 1) ekleyin ve 37 ° C'de bir hücre inkübatöründe inkübe edin.
3. Organoid kültür
   1. Kültür ortamını (Tablo 1) 2-3 günde bir yenileyin. Kültürün başlangıcında, HCC organoidlerini HCC izolasyon ortamında (Tablo 1) 2 hafta boyunca kültürleyin.
   2. HCC izolasyon ortamı ile 2 haftalık inkübasyondan sonra, ortamı HCC organoid genleşme ortamı (Tablo 1) ile değiştirin (4 ° C'de 2 haftaya kadar saklanır).
   3. Kültür ortamını her 3 günde bir yenileyin.
   4. HCC genleşme ortamı ile 7-10 günlük kültürlemeden sonra, organoid uygun yoğunluğa veya boyuta ulaştığında, deneysel müdahaleler veya geçiş başlatın veya organoidleri gerektiği gibi liyofilize edin.
4. Organoid pasaj
   1. Sarf malzemeleri ve malzemelerin hazırlanması
      1. Ultra düşük ataşman yüzeyli hücre kültürü plakalarını (24 oyuk) 37 °C'de bir inkübatörde 1 saat önceden ısıtın. Dondurulmuş BME'yi kullanımdan hemen öncesine kadar gece boyunca 4 °C'de çözdürün.
      2. Organoid hasat çözeltisini ve tripsin ikamesini 37 °C'de 30 dakika önceden ısıtın.
   2. Geçiş işlemi
      1. Kültür ortamını kuyu plakasından çıkardıktan sonra, organoid süspansiyonu 15 mL'lik bir tüpe aktarın.
      2. 1.000 μL'lik bir pipet tabancası kullanarak kazıyarak ve yukarı ve aşağı pipetleyerek BME miktarına göre organoid hasat solüsyonu (50 μL BME başına 500 μL organoid hasat solüsyonu) ekleyin.
         NOT: Hava kabarcıklarının varlığı daha yüksek pipetleme basıncına işaret ettiğinden, organoid kaybını önlemek için proses boyunca hava kabarcıklarından kaçının.
      3. Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
      4. BME'yi 1.000 μL'lik bir pipetle nazikçe aspire edin ve BME'nin tamamen çözündüğünü gözlemleyin. Berrak bir organoid hücre kümesi gözlenene kadar her 10 dakikada bir gözlemleyin, ardından oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 × g'da santrifüjleyin ve mümkün olduğunca süpernatanı çıkarın.
         NOT: Bu aşamada, organoid dondurulabilir ve korunabilir.
      5. Organoidlerin enzimatik sindirimi için, 1-5 mL tripsin ikamesi (organoid sayısına göre) ekleyin ve 37 ° C'de 2 dakika inkübe edin. Organoidlerin 2-10 hücreden oluşan küçük kümelere ayrılıp ayrışmadığını belirlemek için mikroskop altında enzimatik sindirim derecesini gözlemleyin; Değilse, enzimatik sindirime devam edin.
         NOT: Aşırı sindirim, organoid hücre kümelerinin tek hücrelere bölünmesine, canlılıklarının azalmasına ve sonraki kültür süresinin uzamasına neden olacaktır.
      6. Sindirimi durdurmak için uygun hacimde soğuk bazal ortam ekleyin (Tablo 1).
      7. Organoidleri 400 × g'da 8 °C'de 5 dakika santrifüjleyin; Süpernatanı mümkün olduğunca çıkarın.
      8. İstenilen sayıda organoidi (24 oyuklu bir plakanın oyuğu başına 1.000-5.000 organoid) kaplama için uygun matriste yeniden süspanse edin. Bölüm 1.2'deki adımların aynısını izleyin.
         NOT: Kaplama yoğunluğu, organoidlerin büyüme hızına ve boyutuna göre optimize edilmelidir.
      9. Organoidleri, organoid büyümesinin yoğunluğuna bağlı olarak her 10 günde bir 1: 3 veya 1: 4 oranında geçirin.
5. Organoid kriyoprezervasyon ve resüsitasyon
   1. Organoidlerin dondurularak saklanması
      1. Liyofilizasyon tüpleri hazırlayın, her tüp organoidler içeren 24 oyuklu bir plakanın iki oyuğu ile birleşir.
      2. BME'siz organoidler elde etmek için organoid geçişi için 1.4.2.1 ila 1.4.2.4 arasındaki adımları izleyin ve 24 oyuklu bir plakaya 500 μL / oyuklu organoid liyofilizasyon çözeltisi ekleyerek organoidleri nazikçe yeniden süspanse edin.
         NOT: Organoidlerin büyüme durumuna ve boyutuna bağlı olarak, organoidlerin üçüncü nesle kadar kültürde dondurularak saklanması önerilir.
      3. Süspansiyonu liyofilizasyon tüplerine aktarın ve -80 °C'de gradyan soğutmalı bir kutuya yerleştirin. En az 24 saat boyunca -80 °C'de gradyan soğutmadan sonra, uzun süreli depolama için tüpleri sıvı nitrojene aktarın.
   2. Organoidlerin resüsitasyonu
      1. Liyofilize tüpleri 37 °C'lik bir su banyosunda inkübe edin ve sadece küçük bir buz bloğu kaldığında inkübasyonu durdurun.
      2. Süpernatanı tamamen çıkarmak için 400 × g'da 8 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
      3. Sonraki işlemler için bölüm 1.2 ve 1.3'ü izleyin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Yukarıda belirtilen prosedürün uygulanmasından sonra, HCC organoid sferoidlerinin ortaya çıkışı tipik olarak 3 günlük bir süre içinde gözlemlenebilir (Şekil 1). Şekil 1A,B, kuruluşun ilk gününde yuvarlatılmış kenarlar ve geçirgen sitozol ile karakterize edilen kompakt sferoidleri hemen geliştiren yerleşik HCC organoidini göstermektedir. HCC organoidlerinin büyümesi sırasında, farklı konsantrasyonlarda BME kullanım...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Hasta kaynaklı organoid modellerin dikkate değer bir yararı, doku yapısını ve genomik manzarayı kapsayan tümörlerin biyolojik özelliklerini aslına uygun olarak kopyalama kapasitelerinde yatmaktadır. Bu modeller dikkate değer bir doğruluk düzeyi gösterir ve uzun süreli ekim dönemlerinde bile tümörlerin heterojenliğini ve ilerlemesini etkili bir şekilde yansıtır ^6,8,9. Bu rafine organoid kültür protokolü...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
[Leu15]-gastrin I human	Merck	G9145
1.5 mL Microtubes	Merck	AXYMCT150LC
A8301 (TGFβ inhibitor)	Tocris Bioscience	2939
B27 Supplement (503), minus vitamin A	Thermo Fisher Scientific	12587010
B-27 Supplement (503), serum-free	Thermo Fisher Scientific	17504044
BMP7	Peprotech	120-03P
Cell strainer size 100 μm	Merck	CLS352360
CHIR99021	Merck	SML1046
Collagenase D	Merck	11088858001
Corning Costar Ultra-Low	Merck	CLS3473
Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile	Corning	3473
Costar 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile	Corning	3471
Cultrex Organoid Harvesting Solution	R&D SYSTEMS	3700-100-01	Organoid harvesting solution
Cultrex Reduced Growth Factor BME, Type 2 PathClear (BME)	Merck	3533-005-02
DAPT	Merck	D5942
Dexamethasone	Merck	D4902
DMSO	Merck	C6164
DNaseI	Merck	DN25
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12	Thermo Fisher Scientific	12634028	Advanced DMEM/F-12
Earle’s balanced salt solution (EBSS)	Thermo Fisher Scientific	24010043
Forceps	N/A	N/A
Forskolin	Tocris Bioscience	1099
GlutaMAX supplement	Thermo Fisher Scientific	35050061
HEPES, 1 M	Thermo Fisher Scientific	15630080
Leica DM6 B Fluorescence Motorized Microscope	Leica	N/A
N2 supplement (1003)	Thermo Fisher Scientific	17502048
N-acetylcysteine	Merck	A0737-5MG
Nicotinamide	Merck	N0636
Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	339651
Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	339653
Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122
Recombinant human EGF	Peprotech	AF-100-15
Recombinant human FGF10	Peprotech	100-26
Recombinant human FGF19	Peprotech	100-32
Recombinant human HGF	Peprotech	100-39
Recombinant human Noggin	Peprotech	120-10C
Rho kinase inhibitor Y-27632 dihydrochloride	Merck	Y0503
R-spodin1-conditioned medium	(Broutier et al.)	N/A	Secretion of cell lines
Surgical scissors	N/A	N/A
Surgical specimen of tumor removed from HCC patients	Affiliated Cancer Hospital and Institute of Guangzhou Medical University	N/A
TNFα	Peprotech	315-01A
TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red	Thermo Fisher Scientific	12604013	Trypsin substitute
Wnt-3a-conditioned medium	(Broutier et al.)	N/A	Secretion of cell lines