Entwicklung und Optimierung eines humanen hepatozellulären Karzinom-Patienten-abgeleiteten Organoidmodells zur Identifizierung potenzieller Zielmoleküle und zur Wirkstoffforschung

Zusammenfassung

Wir bieten einen umfassenden Überblick und eine Verfeinerung bestehender Protokolle für die Bildung von Organoiden des hepatozellulären Karzinoms (HCC), die alle Stadien der Organoidkultivierung umfassen. Dieses System dient als wertvolles Modell für die Identifizierung potenzieller therapeutischer Ziele und die Bewertung der Wirksamkeit von Wirkstoffkandidaten.

Zusammenfassung

Das hepatozelluläre Karzinom (HCC) ist ein weltweit weit verbreiteter und tödlicher Tumor, dessen späte Entdeckung und das Fehlen wirksamer spezifischer Therapeutika weitere Forschungen zu seiner Pathogenese und Behandlung erforderlich machen. Organoide, ein neuartiges Modell, das nativem Tumorgewebe sehr ähnlich ist und in vitro kultiviert werden kann, haben in den letzten Jahren großes Interesse geweckt, mit zahlreichen Berichten über die Entwicklung von Organoidmodellen für Leberkrebs. In dieser Studie haben wir das Verfahren erfolgreich optimiert und ein Kulturprotokoll etabliert, das die Bildung von größeren HCC-Organoiden mit stabilen Passage- und Kulturbedingungen ermöglicht. Wir haben jeden Schritt des Verfahrens umfassend skizziert und den gesamten Prozess der HCC-Gewebedissoziation, der Organoidplattierung, der Kultur, der Passage, der Kryokonservierung und der Wiederbelebung abgedeckt und in diesem Artikel detaillierte Vorsichtsmaßnahmen getroffen. Diese Organoide weisen eine genetische Ähnlichkeit mit dem ursprünglichen HCC-Gewebe auf und können für verschiedene Anwendungen verwendet werden, einschließlich der Identifizierung potenzieller therapeutischer Ziele für Tumore und der anschließenden Entwicklung von Medikamenten.

Einleitung

Das hepatozelluläre Karzinom (HCC), ein weit verbreiteter und sehr vielfältiger Tumor¹, hat in der medizinischen Fachwelt große Aufmerksamkeit erregt. Das Vorhandensein von Linienplastizität und erheblicher Heterogenität beim HCC deutet darauf hin, dass Tumorzellen, die von verschiedenen Patienten stammen, und sogar unterschiedliche Läsionen innerhalb desselben Patienten unterschiedliche molekulare und phänotypische Merkmale aufweisen können, was die Weiterentwicklung innovativer therapeutischer Ansätze erheblich behindert 2,3,4,5 . Folglich ist es dringend erforderlich, die biologischen Eigenschaften und Mechanismen der Arzneimittelresistenz bei HCC besser zu verstehen, um wirksamere Behandlungsstrategien zu entwickeln.

In den letzten Jahrzehnten haben sich Forscher der Entwicklung von In-vitro-Modellen zur Untersuchung von HCC ^3,4 gewidmet. Trotz einiger Fortschritte gibt es nach wie vor Einschränkungen. Diese Modelle umfassen eine Reihe von Techniken, wie z. B. die Verwendung von Zelllinien, Primärzellen und patientenabgeleiteten Xenotransplantaten (PDX). Zelllinien dienen als In-vitro-Modelle für die Langzeitkultur von Tumorzellen, die von HCC-Patienten gewonnen werden, und bieten die Vorteile der Bequemlichkeit und der einfachen Expansion. Primärzellmodelle beinhalten die direkte Isolierung und Kultur von Primärtumorzellen aus dem Tumorgewebe von Patienten, wodurch eine Darstellung biologischer Merkmale ermöglicht wird, die denen der Patienten selbst sehr ähnlich sind. PDX-Modelle beinhalten die Transplantation von Tumorgewebe von Patienten in Mäuse mit dem Ziel, das Tumorwachstum und -ansprechen genauer zu simulieren. Diese Modelle waren für die HCC-Forschung von entscheidender Bedeutung, weisen jedoch bestimmte Einschränkungen auf, darunter die Heterogenität der Zelllinien und die Unfähigkeit, In-vivo-Bedingungen vollständig zu replizieren. Darüber hinaus kann eine längere In-vitro-Kultivierung zu einer Verschlechterung der ursprünglichen Eigenschaften und Funktionalitäten der Zellen führen, was eine Herausforderung bei der genauen Darstellung der biologischen Eigenschaften von HCC darstellt. Darüber hinaus ist der Einsatz von PDX-Modellen sowohl zeitaufwändig als auch kostspielig³.

Um diese Einschränkungen zu überwinden und die physiologischen Eigenschaften des HCC genauer zu replizieren, wurde der Einsatz der Organoid-Technologie als vielversprechende Forschungsplattform eingeführt, die in der Lage ist, frühere Einschränkungen zu überwinden. Organoide, bei denen es sich um dreidimensionale Zellmodelle handelt, die in vitro gezüchtet werden, haben die Fähigkeit, die Struktur und Funktionalität tatsächlicher Organe nachzubilden. Im Zusammenhang mit HCC gibt es jedoch gewisse Herausforderungen bei der Etablierung von Organoidmodellen. Zu diesen Herausforderungen gehören unzureichende detaillierte Beschreibungen von HCC-Organoid-Konstruktionsverfahren, das Fehlen umfassender Protokolle für den gesamten Prozess der HCC-Organoid-Konstruktion und die typischerweise geringe Größe kultivierter Organoide ^6,7,8. Angesichts der typischerweise begrenzten Abmessungen von kultivierten Organoiden haben wir uns bemüht, diese Herausforderungen durch die Entwicklung eines umfassenden Protokolls anzugehen, das die gesamte HCC-Organoid-Konstruktion umfasst⁶. Dieses Protokoll umfasst Gewebedissoziation, Organoidplattierung, Kultur, Passage, Kryokonservierung und Wiederbelebung. Durch die Optimierung der Verfahrensschritte und die Verfeinerung der Zusammensetzung des Nährmediums ist es uns gelungen, HCC-Organoidmodelle zu etablieren, die in der Lage sind, nachhaltig zu wachsen und langfristig zu vergehen ^6,8. In den folgenden Abschnitten wird eine umfassende Darstellung der betrieblichen Feinheiten und relevanten Faktoren vorgestellt, die bei der Konstruktion von HCC-Organoiden eine Rolle spielen.

Protokoll

Menschliches biopsiertes Gewebe wurde von dem jeweiligen Patienten im angeschlossenen Krebskrankenhaus und Institut der Medizinischen Universität Guangzhou entnommen, und die Patienten erhielten eine informierte Einwilligung. In der Materialtabelle finden Sie Details zu allen Materialien, Reagenzien und Instrumenten, die in diesem Protokoll verwendet werden.

1. Etablierung von patienteneigenen HCC-Organoiden aus chirurgischen Proben

HINWEIS: Die Etablierung von HCC-Organoiden umfasst verschiedene Phasen, nämlich Gewebedissoziation, Organoidplattierung, Kultur, Passage, Kryokonservierung und Wiederbelebung. Der Prozess der Gewebedissoziation dauert 2 Stunden, während die Aussaat von Organoiden auf eine Platte etwa 40 Minuten dauert. Anschließend durchläuft die erste Generation von HCC-Organoiden eine Kulturphase von 10-14 Tagen mit HCC-Isolationsmedium. Sobald eine zufriedenstellende Dichte erreicht ist, werden Organoid-Passagen durchgeführt, was 1 h dauert. Nachfolgende Kulturen der Organoide werden dann mit HCC-Expansionsmedium für 7-10 Tage aufbewahrt, was je nach Wachstumsrate und Zustand der Organoide variieren kann.

1. Dissoziation des Gewebes
   1. Vorbereitung von Vorräten und Materialien
      1. Entnehmen Sie 1-2^cm3 HCC-Gewebe von Patienten, die vor der Operation keine lokale oder systemische Behandlung erhalten haben. Nach der chirurgischen Resektion wird das Gewebe bis zur Verarbeitung bei 4 °C in Gewebekonservierungslösung (Tabelle 1) aufbewahrt.
         HINWEIS: Qualitativ hochwertige frische Gewebeproben sind für die erfolgreiche Etablierung von Organoiden unerlässlich. Es ist wichtig, die Proben zeitnah, idealerweise innerhalb von 1-4 Stunden nach der chirurgischen Resektion, zu verarbeiten, um die Lebensfähigkeit des Gewebes zu erhalten. Führen Sie alle nachfolgenden Verfahren in einer aseptischen Umgebung mit sterilen Materialien und Reagenzien durch.
      2. Zellkulturplatten mit extrem niedriger Anhaftungsfläche (24 Wells) werden in einem Inkubator bei 37 °C 1 h vorgewärmt. Den gefrorenen Basalmembranextrakt (BME) über Nacht bei 4 °C bis kurz vor Gebrauch auftauen.
         HINWEIS: Um ein vollständiges Auftauen des BME zu gewährleisten, muss er mindestens 3 h lang auf Eis gelegt werden. Ein vollständiges Aufschmelzen des BME ist für eine erfolgreiche Organoidkultur in den folgenden Schritten unerlässlich.
      3. Vor Gebrauch ist darauf zu achten, dass die Aufschlusslösung (Tabelle 1) auf eine Temperatur von 37 °C erwärmt ist.
         HINWEIS: Bereiten Sie die Aufschlusslösung frisch in einer aseptischen Umgebung zu und verwenden Sie sie sofort.
   2. Organisatorischer Ablauf
      1. In einem Laminar-Flow-Schrank wird das Tumorgewebe mit einer chirurgischen Schere auf einer Petrischale in kleine Stücke (0,5-1^mm3) geschnitten. Übertragen Sie das abgeschnittene Gewebe in ein konisches 15-ml-Röhrchen und fügen Sie 5-10 ml Basalmedium hinzu (Tabelle 1).
         HINWEIS: Das Basalmedium (Tabelle 1) kann bei 4 °C bis zu 1 Monat gelagert werden.
      2. Verwenden Sie eine barotrope Pipette, um so viel Blut wie möglich wegzuspülen, und lassen Sie sie 1-2 Minuten stehen, um einen Teil des Überstandes zu entfernen, einschließlich aller Blutzellen und schwimmenden Fettgerinnsel. Wiederholen Sie diesen Vorgang zweimal.
      3. Die Mischung wird bei 300 × g 5 min bei Raumtemperatur zentrifugiert und der Überstand vorsichtig entfernt. 5 ml der vorgewärmten Aufschlusslösung (Tabelle 1) in das abgeschnittene Gewebe geben.
      4. Für den Aufschluss wird das Röhrchen auf 37 °C gedreht.
      5. Nach 30 Minuten der ersten Verdauung suchen Sie unter dem Mikroskop nach kleinen Zellansammlungen. Alle 5-10 Minuten kontrollieren, um eine Überverdauung zu vermeiden.
         HINWEIS: Die Zeit, die für die Gewebeverdauung benötigt wird, hängt von der Größe und Art des Gewebes ab. Die Gewebeverdauung sollte 90 Minuten nicht überschreiten. Überverdautes Gewebe erscheint unter dem Mikroskop als eine große Schicht einzelner Zellen. Auf den entsprechenden Grad der Verdauung deutet die Tatsache hin, dass es sich bei den meisten von ihnen um Zellverbände handelt, die ein traubenähnliches Aussehen haben.
      6. Stoppen Sie den Aufschluss durch Zugabe von kaltem Basalmedium (Tabelle 1) und filtrieren Sie es in ein neues 50-ml-Röhrchen mit einem 100-μm-Zellfilter. Kaltes Basalmedium zu einem Volumen von 50 ml hinzufügen.
      7. Die Zellen werden bei 2 × g für 10 min bei 8 °C zentrifugiert. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet durch Zugabe von weiteren 50 ml kaltem Basalmedium (Tabelle 1). Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal.
         HINWEIS: Die Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit wird verwendet, damit sich kleine Zellcluster absetzen können, während Blutzellen und Zelltrümmer noch im Überstand schweben. Der Vorgang wird mehrmals wiederholt, um eine relativ reine Gewebezellmasse zu erhalten.
2. Organoid-Beschichtung
   1. Entfernen Sie nach dem zweiten Waschen so viel Überstand wie möglich und resuspendieren Sie die gewünschte Anzahl von Zellen (1.000-5.000 Zellen pro Well einer 24-Well-Platte) in der entsprechenden BME für die Beschichtung.
      HINWEIS: Halten Sie den BME vor Gebrauch immer bei 4 °C.
   2. Fügen Sie BME hinzu und suspendieren Sie kleine Zellcluster in Advanced DMEM/F-12, indem Sie BME hinzufügen und vorsichtig auf und ab pipettieren, bis die Zellaggregate vollständig suspendiert sind. Kontrollieren Sie die Konzentration des BME zwischen 30 % und 50 %.
   3. Säen Sie 50 μl BME-Tröpfchen gemischt mit Zellclustern in der Mitte von 24-Well-Kulturplatten.
      HINWEIS: Lassen Sie die Tröpfchen so weit wie möglich nicht auf die Seitenwand der Well-Platte ausbreiten. Die Seitenwand der Platte mit geringer Adsorption befindet sich nicht in einem Zustand mit geringer Adsorption, und der Kontakt zwischen den Tröpfchen und der Seitenwand führt zu einer Adhäsion, die der anschließenden Inkubation nicht förderlich ist.
   4. Die Platten mit den zugesetzten Tröpfchen bei 37 °C 20 min erstarren lassen. Am Ende der Inkubation werden 500 μl vorgewärmtes Medium (Tabelle 1) in jede Vertiefung gegeben und in einem Zellinkubator bei 37 °C inkubiert.
3. Organoid-Kultur
   1. Aktualisieren Sie das Nährmedium (Tabelle 1) alle 2-3 Tage. Zu Beginn der Kultur werden die HCC-Organoide 2 Wochen lang in HCC-Isolationsmedium (Tabelle 1) kultiviert.
   2. Nach 2-wöchiger Inkubation mit HCC-Isolationsmedium wird das Medium durch HCC-Organoid-Expansionsmedium (Tabelle 1) ersetzt (bis zu 2 Wochen bei 4 °C gelagert).
   3. Aktualisieren Sie das Nährmedium alle 3 Tage.
   4. Nach 7-10 Tagen der Kultivierung mit HCC-Expansionsmedium, wenn das Organoid die entsprechende Dichte oder Größe erreicht hat, beginnen Sie mit experimentellen Eingriffen oder der Passage oder gefrierisieren Sie die Organoide nach Bedarf.
4. Organoid-Passage
   1. Vorbereitung von Vorräten und Materialien
      1. Zellkulturplatten mit extrem niedriger Anhaftungsfläche (24 Wells) werden in einem Inkubator bei 37 °C 1 h vorgewärmt. Gefrorenen BME über Nacht bei 4 °C bis kurz vor Gebrauch auftauen.
      2. Organoid-Erntelösung und Trypsinersatz bei 37 °C für 30 min vorwärmen.
   2. Ablauf der Passage
      1. Nachdem Sie das Nährmedium von der Well-Platte entfernt haben, überführen Sie die Organoidsuspension in ein 15-ml-Röhrchen.
      2. Fügen Sie die Organoid-Erntelösung entsprechend der BME-Menge (500 μl Organoid-Erntelösung pro 50 μl BME) hinzu, indem Sie sie mit einer 1.000-μl-Pipettenpistole abschaben und nach oben und unten pipettieren.
         HINWEIS: Vermeiden Sie Luftblasen während des gesamten Prozesses, um den Verlust von Organoiden zu vermeiden, da das Vorhandensein von Luftblasen auf einen höheren Pipettierdruck hinweist.
      3. 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
      4. Saugen Sie den BME vorsichtig mit einer 1.000-μl-Pipette an und stellen Sie fest, dass sich der BME vollständig aufgelöst hat. Alle 10 min beobachten, bis ein klarer organoider Zellhaufen beobachtet wird, dann bei 400 × g für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren und so viel Überstand wie möglich entfernen.
         HINWEIS: In diesem Stadium kann das Organoid eingefroren und konserviert werden.
      5. Für den enzymatischen Verdau von Organoiden 1-5 ml des Trypsinersatzes (je nach Anzahl der Organoide) zugeben und bei 37 °C für 2 min inkubieren. Beobachten Sie unter dem Mikroskop den Grad der enzymatischen Verdauung, um festzustellen, ob die Organoide in kleine Cluster von 2-10 Zellen dissoziieren. Wenn nicht, setzen Sie die enzymatische Verdauung fort.
         HINWEIS: Eine Überverdauung führt zur Lyse von organoiden Zellclustern in einzelne Zellen, wodurch ihre Lebensfähigkeit verringert und die nachfolgende Kulturzeit verlängert wird.
      6. Fügen Sie die entsprechende Menge kaltes Basalmedium hinzu (Tabelle 1), um die Verdauung zu stoppen.
      7. Die Organoide werden bei 400 × g für 5 min bei 8 °C zentrifugiert; Entfernen Sie den Überstand so weit wie möglich.
      8. Resuspendieren Sie die gewünschte Anzahl von Organoiden (1.000-5.000 Organoide pro Well einer 24-Well-Platte) in der entsprechenden Matrix für die Beschichtung. Befolgen Sie die gleichen Schritte wie in Abschnitt 1.2.
         HINWEIS: Die Beschichtungsdichte sollte entsprechend der Wachstumsrate und Größe der Organoide optimiert werden.
      9. Passieren Sie die Organoide alle 10 Tage in einem Verhältnis von 1:3 oder 1:4, je nach Dichte des Organoidwachstums.
5. Kryokonservierung und Wiederbelebung von Organoiden
   1. Kryokonservierung von Organoiden
      1. Bereiten Sie Gefriertrocknungsröhrchen vor, wobei jedes Röhrchen mit zwei Vertiefungen einer 24-Well-Platte konfluiert, die Organoide enthält.
      2. Befolgen Sie die Schritte 1.4.2.1 bis 1.4.2.4 für die Organoid-Passage, um Organoide ohne BME zu erhalten, und resuspendieren Sie die Organoide vorsichtig durch Zugabe von 500 μl/Well Organoid-Gefriertrocknungslösung zu einer 24-Well-Platte.
         HINWEIS: Je nach Wachstumsstatus und Größe der Organoide wird empfohlen, die Organoide bis zur dritten Generation in Kultur zu kryokonservieren.
      3. Die Suspension wird in Gefriertrocknungsröhrchen überführt und bei -80 °C in eine gradientengekühlte Box gegeben. Nach einer Gradientenkühlung bei -80 °C für mindestens 24 h werden die Rohre zur Langzeitlagerung in flüssigen Stickstoff überführt.
   2. Reanimation von Organoiden
      1. Inkubieren Sie lyophilisierte Röhrchen in einem 37 °C warmen Wasserbad und beenden Sie die Inkubation, wenn nur noch ein kleiner Eisblock übrig ist.
      2. Bei 400 × g 5 min bei 8 °C zentrifugieren, um den Überstand vollständig zu entfernen.
      3. Befolgen Sie die Abschnitte 1.2 und 1.3 für nachfolgende Vorgänge.

Ergebnisse

Nach der Implementierung des oben genannten Verfahrens ist die Entstehung von HCC-Organoid-Sphäroiden typischerweise innerhalb einer Zeitspanne von 3 Tagen beobachtbar (Abbildung 1). Die Abbildungen 1A,B zeigen das etablierte HCC-Organoid, das am ersten Tag der Etablierung prompt kompakte Sphäroide entwickelt, die sich durch abgerundete Kanten und durchlässiges Zytosol auszeichnen. Während des Wachstums von HCC-Organoiden hatte die Verwendun...

Diskussion

Ein bemerkenswerter Vorteil von patientenabgeleiteten Organoidmodellen liegt in ihrer Fähigkeit, die biologischen Eigenschaften von Tumoren originalgetreu zu replizieren, einschließlich der Gewebestruktur und der genomischen Landschaft. Diese Modelle weisen ein bemerkenswertes Maß an Genauigkeit auf und spiegeln die Heterogenität und Progression von Tumoren wider, selbst über längere Kultivierungszeiträume^{hinweg 6,8,9}. Du...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
[Leu15]-gastrin I human	Merck	G9145
1.5 mL Microtubes	Merck	AXYMCT150LC
A8301 (TGFβ inhibitor)	Tocris Bioscience	2939
B27 Supplement (503), minus vitamin A	Thermo Fisher Scientific	12587010
B-27 Supplement (503), serum-free	Thermo Fisher Scientific	17504044
BMP7	Peprotech	120-03P
Cell strainer size 100 μm	Merck	CLS352360
CHIR99021	Merck	SML1046
Collagenase D	Merck	11088858001
Corning Costar Ultra-Low	Merck	CLS3473
Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile	Corning	3473
Costar 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile	Corning	3471
Cultrex Organoid Harvesting Solution	R&D SYSTEMS	3700-100-01	Organoid harvesting solution
Cultrex Reduced Growth Factor BME, Type 2 PathClear (BME)	Merck	3533-005-02
DAPT	Merck	D5942
Dexamethasone	Merck	D4902
DMSO	Merck	C6164
DNaseI	Merck	DN25
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12	Thermo Fisher Scientific	12634028	Advanced DMEM/F-12
Earle’s balanced salt solution (EBSS)	Thermo Fisher Scientific	24010043
Forceps	N/A	N/A
Forskolin	Tocris Bioscience	1099
GlutaMAX supplement	Thermo Fisher Scientific	35050061
HEPES, 1 M	Thermo Fisher Scientific	15630080
Leica DM6 B Fluorescence Motorized Microscope	Leica	N/A
N2 supplement (1003)	Thermo Fisher Scientific	17502048
N-acetylcysteine	Merck	A0737-5MG
Nicotinamide	Merck	N0636
Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	339651
Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	339653
Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122
Recombinant human EGF	Peprotech	AF-100-15
Recombinant human FGF10	Peprotech	100-26
Recombinant human FGF19	Peprotech	100-32
Recombinant human HGF	Peprotech	100-39
Recombinant human Noggin	Peprotech	120-10C
Rho kinase inhibitor Y-27632 dihydrochloride	Merck	Y0503
R-spodin1-conditioned medium	(Broutier et al.)	N/A	Secretion of cell lines
Surgical scissors	N/A	N/A
Surgical specimen of tumor removed from HCC patients	Affiliated Cancer Hospital and Institute of Guangzhou Medical University	N/A
TNFα	Peprotech	315-01A
TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red	Thermo Fisher Scientific	12604013	Trypsin substitute
Wnt-3a-conditioned medium	(Broutier et al.)	N/A	Secretion of cell lines