ヒト肝細胞癌患者由来オルガノイドモデルの開発と最適化による標的同定と創薬

要約

肝細胞がん(HCC)オルガノイド形成に関する既存のプロトコルを包括的に概観し、改良し、オルガノイド培養のすべての段階を網羅しています。このシステムは、潜在的な治療標的の特定と医薬品候補の有効性の評価のための貴重なモデルとして機能します。

要約

肝細胞がん(HCC)は、世界中で非常に有病率が高く致死的な腫瘍であり、その発見が遅く、有効な特異的治療薬が不足しているため、その病因と治療に関するさらなる研究が必要です。オルガノイドは、天然の腫瘍組織によく似ており、 in vitroで培養できる新しいモデルであり、肝臓がんのオルガノイドモデルの開発に関する多くの報告があり、近年大きな関心を集めています。本研究では、手順の最適化に成功し、より大型のHCCオルガノイドを安定な継代・培養条件で形成できる培養プロトコルを確立しました。本稿では、HCC組織の解離、オルガノイドのプレーティング、培養、継代、凍結保存、蘇生の全プロセスをカバーする手順の各ステップを包括的に概説し、詳細な予防策を示しました。これらのオルガノイドは、元のHCC組織と遺伝的類似性を示し、腫瘍の潜在的な治療標的の同定やその後の創薬など、さまざまな用途に利用できます。

概要

肝細胞がん(HCC)は、蔓延し、広範囲に多様な腫瘍^であり1、医学界で大きな注目を集めています。HCCにおける系統の可塑性と実質的な不均一性の存在は、さまざまな患者に由来する腫瘍細胞、さらには同じ患者内の異なる病変でさえ、異なる分子および表現型形質を示す可能性があることを示唆しており、それによって革新的な治療アプローチの進歩に手ごわい障害を提示します2,3,4,5 .したがって、より効果的な治療戦略の策定に情報を提供するために、HCCの薬剤耐性の生物学的特性とメカニズムの理解を深めることが不可欠です。

ここ数十年、研究者はHCC ^3,4を研究する目的でin vitroモデルの開発に力を注いできました。いくつかの進歩にもかかわらず、限界は残っています。これらのモデルには、細胞株、初代細胞、患者由来異種移植片(PDX)の利用など、さまざまな技術が含まれています。細胞株は、肝細胞がん患者から得られた腫瘍細胞の長期培養のためのin vitroモデルとして機能し、利便性と容易な増殖の利点を提供します。初代細胞モデルでは、患者の腫瘍組織から原発腫瘍細胞を直接単離して培養することで、患者自身の生物学的特徴によく似た生物学的特徴を表現します。PDXモデルは、腫瘍の成長と反応をより忠実にシミュレートすることを目的として、患者の腫瘍組織をマウスに移植することを伴います。これらのモデルはHCC研究に役立っていますが、細胞株の不均一性やin vivo条件を完全に再現できないなど、一定の制限があります。また、in vitroでの培養が長引くと、細胞本来の特性や機能が劣化する可能性があり、肝細胞がんの生物学的性質を正確に表現することが困難となります。さらに、PDXモデルの利用には時間とコスト^{がかかります3}。

これらの限界に対処し、HCCの生理学的特性をより正確に再現するために、オルガノイド技術の利用は、以前の制約を超えることができる有望な研究プラットフォームとして導入されています。オルガノイドは、試験管内で培養された3次元の細胞モデルであり、実際の臓器の構造と機能を再現する能力を持っています。しかし、肝細胞がんの文脈では、オルガノイドモデルの確立にはいくつかの課題があります。これらの課題には、HCCオルガノイド構築手順の詳細な説明が不十分であること、HCCオルガノイド構築プロセス全体に対する包括的なプロトコルの欠如、培養オルガノイドのサイズが一般的に小さいことなどが含まれます^6,7,8。培養オルガノイドの寸法が一般的に限られていることを考慮し、HCCオルガノイ^{ド構築全体を}網羅する包括的なプロトコルの開発を通じて、これらの課題に取り組むよう努めました6。このプロトコルはティッシュの解離、オルガノイドのめっき、文化、継代、cryopreservationおよび蘇生を取囲む。手順の最適化と培地の組成の精緻化により、持続的な増殖と長期継代が可能なHCCオルガノイドモデルの確立に成功しました^6,8。以降のセクションでは、HCCオルガノイドの構築に関与する操作上の複雑さと関連因子の包括的な説明が提示されます。

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プロトコル

広州医科大学附属がん病院および研究所のそれぞれの患者からヒト生検組織を取得し、患者からインフォームドコンセントを得ました。このプロトコルで使用されるすべての材料、試薬、および機器の詳細については、 材料表 を参照してください。

1. 手術サンプルからの患者由来HCCオルガノイドの樹立

注:HCCオルガノイドの確立には、組織の解離、オルガノイドのプレーティング、培養、継代、凍結保存、蘇生など、さまざまな段階があります。組織解離のプロセスには2時間の持続時間が必要ですが、プレートへのオルガノイドの播種には約40分かかります。これに続いて、HCCオルガノイドの初期生成は、HCC単離培地を使用して10〜14日間の培養期間を経る。満足のいく密度が得られたら、オルガノイド継代が実施されますが、これには1時間かかります。その後、オルガノイドの培養は、HCC増殖培地を使用して7〜10日間維持されますが、これはオルガノイドの増殖速度と状態によって異なります。

1. 組織の解離
   1. 備品・資材の準備
      1. 手術前に以前に局所的または全身的な治療を受けていない患者から1〜^2cm3 のHCC組織を収集します。外科的切除後、処理するまで組織を組織保存液(表1)中で4°Cに保ってください。
         注:オルガノイドの樹立を成功させるには、高品質の新鮮な組織サンプルが不可欠です。組織の生存率を維持するために、サンプルを迅速に、理想的には外科的切除後1〜4時間以内に処理することが重要です。その後のすべての手順は、無菌材料と試薬を使用して無菌環境で実行してください。
      2. 超低接着表面細胞培養プレート(24ウェル)をインキュベーターで37°Cの1時間予熱します。 凍結基底膜抽出物(BME)は、使用直前まで4°Cで一晩解凍します。
         注意: BMEを完全に解凍するには、少なくとも3時間氷上に置く必要があります。BMEの完全融解は、その後のステップでオルガノイド培養を成功させるために不可欠です。
      3. 使用する前に、分解液(表1)が37°Cの温度に加温されていることを確認してください。
         注:消化液は無菌環境で新たに調製し、速やかに使用してください。
   2. 組織処理フロー
      1. 層流キャビネットで、ペトリ皿の上で外科用ハサミを使用して腫瘍組織を小片(0.5〜1 mm³)に切断します。クリップした組織を15mLのコニカルチューブに移し、5〜10mLの基礎培地を加えます(表1)。
         注:基礎培地(表1)は、4°Cで最大1か月間保存できます。
      2. バロトロピックピペットを使用してできるだけ多くの血液を洗い流し、1〜2分間放置して、血球や浮遊脂肪塊などの上清の一部を取り除きます。この手順を 2 回繰り返します。
      3. 混合物を室温で300×gで5分間遠心分離し、上清を慎重に除去します。トリミングした組織に予熱した消化液(表1)5 mLを加えます。
      4. チューブを37°Cで回転させて分解します。
      5. 最初の消化から30分後、顕微鏡で細胞の小さなクラスターを探します。過剰消化を避けるために、5〜10分ごとにチェックしてください。
         注:組織消化に必要な時間は、組織のサイズと種類によって異なります。組織消化は90分を超えてはなりません。過剰に消化された組織は、顕微鏡下で個々の細胞の大きなシートとして現れます。消化の適切なレベルは、これらのほとんどが細胞塊であり、ブドウのような外観をしているという事実によって示されます。
      6. 冷たい基礎培地(表1)を添加して消化を停止し、100 μmのセルフィルターを備えた新しい50 mLチューブにろ過します。冷たい基礎培地を50 mLの容量に加えます。
      7. 細胞を2× g で8°Cで10分間遠心分離します。 上清を慎重に除去し、さらに50 mLの冷たい基礎培地を加えてペレットを再懸濁します(表1)。この手順を 2 回繰り返します。
         注:低速遠心分離は、血球と細胞破片が上清に懸濁したまま、小さな細胞クラスターを沈殿させるために使用されます。このプロセスを数回繰り返して、比較的純粋な組織細胞塊を得る。
2. オルガノイドプレーティング
   1. 2回目の洗浄後、上清をできるだけ多く除去し、所望の細胞数(24ウェルプレートのウェルあたり1,000〜5,000細胞)をプレーティング用の適切なBMEに再懸濁します。
      注意: 使用前にBMEを必ず4°Cに保管してください。
   2. Advanced DMEM/F-12でBMEを添加し、細胞凝集体が完全に懸濁するまで静かにピペッティングして、スモールセルクラスターを懸濁します。BMEの濃度を30%から50%の間で制御します。
   3. 細胞クラスターと混合した50 μLのBME液滴を24ウェル培養プレートの中央に播種します。
      注意: 可能な限り、液滴がウェルプレートの側壁に広がらないようにしてください。低吸着板の側壁は低吸着状態ではなく、液滴と側壁との接触は接着につながり、その後のインキュベーションを助長しません。
   4. 液滴を添加したプレートを37°Cで20分間固化させます。インキュベーションの最後に、予熱した培地(表1)500 μLを各ウェルに加え、37°Cの細胞インキュベーターでインキュベートします。
3. オルガノイド培養
   1. 培地(表1)を2〜3日に1回リフレッシュする。培養開始時に、HCCオルガノイドをHCC単離培地(表1)で2週間培養する。
   2. HCC単離培地と2週間インキュベートした後、培地をHCCオルガノイド増殖培地(表1)と交換します(4°Cで最大2週間保存)。
   3. 培地は3日に1回リフレッシュしてください。
   4. オルガノイドが適切な密度またはサイズに達したら、HCC増殖培地で7〜10日間培養した後、必要に応じてオルガノイドを実験的介入または継代または凍結乾燥を開始します。
4. オルガノイド継代
   1. 備品・資材の準備
      1. 超低接着表面細胞培養プレート(24ウェル)をインキュベーターで37°Cの1時間予熱します。 凍結したBMEは、使用直前まで4°Cで一晩解凍します。
      2. オルガノイド回収溶液とトリプシン代替品を37°Cで30分間予温します。
   2. 継代プロセス
      1. ウェルプレートから培地を取り出した後、オルガノイド懸濁液を15 mLチューブに移します。
      2. 1,000 μLのピペットガンで掻き取り、ピペッティングを行い、BMEの量に応じてオルガノイド回収溶液(BME50 μLあたりオルガノイド回収溶液500 μL)を加えます。
         注:気泡の存在はピペッティング圧が高いことを示しているため、オルガノイドの損失を防ぐために、プロセス全体を通して気泡を避けてください。
      3. 室温で30分間インキュベートします。
      4. 1,000 μLのピペットでBMEを静かに吸引し、BMEが完全に溶解していることを確認します。透明なオルガノイド細胞クラスターが観察されるまで10分ごとに観察し、その後、室温で400 × g で5分間遠心分離し、上清をできるだけ多く除去します。
         注:この段階では、オルガノイドを凍結して保存することができます。
      5. オルガノイドの酵素消化には、1〜5 mLのトリプシン代替品(オルガノイドの数に応じて)を加え、37°Cで2分間インキュベートします。オルガノイドが2〜10個の細胞の小さなクラスターに解離するかどうかを判断するために、酵素消化の程度を顕微鏡で観察します。そうでない場合は、酵素消化を続行します。
         注:過剰消化は、オルガノイド細胞クラスターの単一細胞への溶解をもたらし、それらの生存率を低下させ、その後の培養時間を延長します。
      6. 適量の冷たい基礎培地(表1)を添加して消化を停止します。
      7. オルガノイドを400 × g で8°Cで5分間遠心分離します。上澄み液をできるだけ取り除きます。
      8. 所望の数のオルガノイド(24ウェルプレートのウェルあたり1,000〜5,000個のオルガノイド)を、プレーティング用の適切なマトリックスに再懸濁します。セクション 1.2 と同じ手順に従います。
         注:プレーティング密度は、オルガノイドの成長速度とサイズに応じて最適化する必要があります。
      9. オルガノイドの増殖密度に応じて、10日ごとに1:3または1:4の比率でオルガノイドを継代します。
5. オルガノイド凍結保存と蘇生
   1. オルガノイドの凍結保存
      1. オルガノイドを含む24ウェルプレートの2つのウェルと合流する各チューブを凍結乾燥チューブを調製します。
      2. ステップ 1.4.2.1 から 1.4.2.4 のオルガノイド継代に従って BME を含まないオルガノイドを取得し、500 μL/ウェルのオルガノイド凍結乾燥溶液を 24 ウェルプレートに添加してオルガノイドを静かに再懸濁します。
         注:オルガノイドの増殖状態とサイズに応じて、第3世代までの培養でオルガノイドを凍結保存することをお勧めします。
      3. 懸濁液を凍結乾燥チューブに移し、-80°Cのグラジエント冷却ボックスに入れます。 -80°Cで少なくとも24時間グラジエント冷却した後、チューブを液体窒素に移して長期保存します。
   2. オルガノイドの蘇生
      1. 凍結乾燥したチューブを37°Cのウォーターバスでインキュベートし、氷の塊が少ししか残らなくなったらインキュベーションを停止します。
      2. 400 × g 、8°Cで5分間遠心分離し、上清を完全に除去します。
      3. 以降の操作については、セクション 1.2 および 1.3 に従ってください。

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結果

前述の手順を実施すると、HCCオルガノイドスフェロイドの出現は通常3日以内に観察できます(図1)。 図1A、B は、樹立初日に丸みを帯びた縁と透過性細胞質を特徴とするコンパクトなスフェロイドを速やかに発現するHCCオルガノイドを示しています。HCCオルガノイドの増殖中、異なる濃度のBMEの使用は、オルガノイドの増殖速度に異な?...

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ディスカッション

患者由来のオルガノイドモデルの注目すべき利点の1つは、組織構造とゲノムランドスケープを含む腫瘍の生物学的特性を忠実に再現する能力にあります。これらのモデルは、驚くべきレベルの精度を示し、長期間の培養でも腫瘍の不均一性と進行を効果的に反映しています^6,8,9。この精製されたオルガノイド培養プロトコ...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
[Leu15]-gastrin I human	Merck	G9145
1.5 mL Microtubes	Merck	AXYMCT150LC
A8301 (TGFβ inhibitor)	Tocris Bioscience	2939
B27 Supplement (503), minus vitamin A	Thermo Fisher Scientific	12587010
B-27 Supplement (503), serum-free	Thermo Fisher Scientific	17504044
BMP7	Peprotech	120-03P
Cell strainer size 100 μm	Merck	CLS352360
CHIR99021	Merck	SML1046
Collagenase D	Merck	11088858001
Corning Costar Ultra-Low	Merck	CLS3473
Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile	Corning	3473
Costar 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile	Corning	3471
Cultrex Organoid Harvesting Solution	R&D SYSTEMS	3700-100-01	Organoid harvesting solution
Cultrex Reduced Growth Factor BME, Type 2 PathClear (BME)	Merck	3533-005-02
DAPT	Merck	D5942
Dexamethasone	Merck	D4902
DMSO	Merck	C6164
DNaseI	Merck	DN25
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12	Thermo Fisher Scientific	12634028	Advanced DMEM/F-12
Earle’s balanced salt solution (EBSS)	Thermo Fisher Scientific	24010043
Forceps	N/A	N/A
Forskolin	Tocris Bioscience	1099
GlutaMAX supplement	Thermo Fisher Scientific	35050061
HEPES, 1 M	Thermo Fisher Scientific	15630080
Leica DM6 B Fluorescence Motorized Microscope	Leica	N/A
N2 supplement (1003)	Thermo Fisher Scientific	17502048
N-acetylcysteine	Merck	A0737-5MG
Nicotinamide	Merck	N0636
Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	339651
Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	339653
Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122
Recombinant human EGF	Peprotech	AF-100-15
Recombinant human FGF10	Peprotech	100-26
Recombinant human FGF19	Peprotech	100-32
Recombinant human HGF	Peprotech	100-39
Recombinant human Noggin	Peprotech	120-10C
Rho kinase inhibitor Y-27632 dihydrochloride	Merck	Y0503
R-spodin1-conditioned medium	(Broutier et al.)	N/A	Secretion of cell lines
Surgical scissors	N/A	N/A
Surgical specimen of tumor removed from HCC patients	Affiliated Cancer Hospital and Institute of Guangzhou Medical University	N/A
TNFα	Peprotech	315-01A
TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red	Thermo Fisher Scientific	12604013	Trypsin substitute
Wnt-3a-conditioned medium	(Broutier et al.)	N/A	Secretion of cell lines