פיתוח ואופטימיזציה של מודל אורגנואיד הנגזר מחולה קרצינומה הפטוצלולרית אנושית לזיהוי מטרות פוטנציאליות וגילוי תרופות

Summary

אנו מספקים סקירה מקיפה וחידוד של פרוטוקולים קיימים ליצירת אורגנואידים של קרצינומה הפטוצלולרית (HCC), המקיפים את כל שלבי גידול האורגנואידים. מערכת זו משמשת מודל רב ערך לזיהוי מטרות טיפוליות פוטנציאליות ולהערכת יעילות התרופה המועמדת לתרופה.

Abstract

קרצינומה הפטוצלולרית (HCC) היא גידול נפוץ וקטלני ביותר ברחבי העולם וגילויו המאוחר והיעדר חומרים טיפוליים ספציפיים יעילים מחייבים מחקר נוסף על הפתוגנזה והטיפול בו. אורגנואידים, מודל חדשני הדומה מאוד לרקמת גידול מקומית וניתן לתרבית במבחנה, זכה להתעניינות רבה בשנים האחרונות, עם דיווחים רבים על פיתוח מודלים אורגנואידים לסרטן הכבד. במחקר זה, ביצענו אופטימיזציה מוצלחת של ההליך וביססנו פרוטוקול תרבית המאפשר היווצרות אורגנואידים HCC גדולים יותר עם תנאי מעבר ותרבית יציבים. תיארנו באופן מקיף כל שלב בהליך, המכסה את כל התהליך של דיסוציאציה של רקמות HCC, ציפוי אורגנואידים, תרבית, מעבר, שימור בהקפאה והחייאה, וסיפקנו אמצעי זהירות מפורטים במאמר זה. אורגנואידים אלה מפגינים דמיון גנטי לרקמות HCC המקוריות וניתן להשתמש בהם ליישומים מגוונים, כולל זיהוי מטרות טיפוליות פוטנציאליות לגידולים ופיתוח תרופות לאחר מכן.

Introduction

קרצינומה הפטוצלולרית (HCC), גידול נפוץ ומגוון^{1, זכה} לתשומת לב רבה בקהילה הרפואית. נוכחותה של פלסטיות שושלת והטרוגניות משמעותית ב-HCC מצביעה על כך שתאי גידול שמקורם בחולים שונים ואף בנגעים מובחנים בתוך אותו מטופל עשויים להפגין תכונות מולקולריות ופנוטיפיות שונות, ובכך להציב מכשולים עצומים בקידום גישות טיפוליות חדשניות 2,3,4,5 . כתוצאה מכך, יש צורך הכרחי בהבנה משופרת של התכונות והמנגנונים הביולוגיים של עמידות לתרופות ב- HCC כדי ליידע את הניסוח של אסטרטגיות טיפול יעילות יותר.

בעשורים האחרונים, חוקרים הקדישו את מאמציהם לפיתוח מודלים חוץ גופיים לצורך חקר HCC ^3,4. למרות התקדמות מסוימת, המגבלות נמשכות. מודלים אלה מקיפים מגוון טכניקות, כגון ניצול קווי תאים, תאים ראשוניים וקסנוגרפטים שמקורם במטופל (PDX). קווי תאים משמשים כמודלים במבחנה לתרבית ארוכת טווח של תאי גידול המתקבלים מחולי HCC, ומציעים את היתרונות של נוחות והרחבה קלה. מודלים של תאים ראשוניים כוללים בידוד ישיר ותרבית של תאי גידול ראשוניים מרקמות הגידול של המטופל, ובכך מספקים ייצוג של מאפיינים ביולוגיים הדומים מאוד לאלה של החולים עצמם. מודלים של PDX כוללים השתלה של רקמות גידול של חולים בעכברים, במטרה לדמות בצורה נאמנה יותר את צמיחת הגידול ואת תגובתו. מודלים אלה סייעו במחקר HCC, אך יש להם מגבלות מסוימות, כולל ההטרוגניות של קווי תאים וחוסר היכולת לשכפל באופן מלא בתנאי vivo. יתר על כן, גידול מבחנה ממושך עלול לגרום להידרדרות המאפיינים והתפקודים המקוריים של התאים, מה שמציב אתגרים בייצוג מדויק של התכונות הביולוגיות של HCC. בנוסף, השימוש בדגמי PDX גוזל זמן ויקר³.

כדי להתמודד עם מגבלות אלה ולשכפל בצורה מדויקת יותר את התכונות הפיזיולוגיות של HCC, השימוש בטכנולוגיית אורגנואידים הוצג כפלטפורמת מחקר מבטיחה המסוגלת להתעלות על אילוצים קודמים. לאורגנואידים, שהם מודלים תלת-ממדיים של תאים בתרבית חוץ גופית, יש את היכולת לשכפל את המבנה והפונקציונליות של איברים בפועל. עם זאת, בהקשר של HCC, קיימים אתגרים מסוימים בהקמת מודלים אורגנואידים. אתגרים אלה כוללים תיאורים לא מפורטים מספיק של הליכי בניית אורגנואידים של HCC, היעדר פרוטוקולים מקיפים לכל התהליך של בניית אורגנואידים של HCC, והגודל הקטן בדרך כלל של אורגנואידים בתרבית ^6,7,8. לאור הממדים המוגבלים בדרך כלל של אורגנואידים מתורבתים, השתדלנו להתמודד עם אתגרים אלה באמצעות פיתוח פרוטוקול מקיף המקיף את כל מבנה האורגנואידים של HCC⁶. פרוטוקול זה כולל דיסוציאציה של רקמות, ציפוי אורגנואידים, תרבית, מעבר, שימור בהקפאה והחייאה. על ידי אופטימיזציה של הצעדים הפרוצדורליים ושכלול הרכב מדיום התרבות, ביססנו בהצלחה מודלים אורגנואידים של HCC המסוגלים לצמיחה מתמשכת ומעבר ארוך טווח ^6,8. בפרקים הבאים יוצג תיאור מקיף של המורכבויות התפעוליות והגורמים הרלוונטיים המעורבים בבניית אורגנואידים של HCC.

Protocol

רקמות ביופסיה אנושית התקבלו מהמטופל בהתאמה בבית החולים לסרטן המסונף ובמכון של האוניברסיטה הרפואית גואנגז'ו, והתקבלה הסכמה מדעת מהמטופלים. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים על כל החומרים, הריאגנטים והמכשירים המשמשים בפרוטוקול זה.

1. קביעת אורגנואידים HCC שמקורם במטופל מדגימות כירורגיות

הערה: הקמת אורגנואידים HCC מקיפה שלבים שונים, כלומר דיסוציאציה של רקמות, ציפוי אורגנואידים, תרבית, מעבר, שימור בהקפאה והחייאה. תהליך הדיסוציאציה של רקמות דורש משך של שעתיים, בעוד שזריעת אורגנואידים על צלחת אורכת כ-40 דקות. לאחר מכן, הדור הראשוני של אורגנואידים HCC עובר תקופת תרבית של 10-14 ימים באמצעות מדיום בידוד HCC. ברגע שמושגת צפיפות משביעת רצון, מתבצעים מעברי אורגנואידים, הדורשים שעה אחת. תרביות עוקבות של האורגנואידים נשמרות לאחר מכן באמצעות מדיום הרחבת HCC למשך 7-10 ימים, אשר עשויים להשתנות בהתאם לקצב הצמיחה ומצב האורגנואידים.

1. דיסוציאציה של רקמות
   1. הכנת אספקה וחומרים
      1. לאסוף 1-2 ס"מ³ מרקמת HCC מחולים שלא קיבלו טיפול מקומי או סיסטמי קודם לפני הניתוח. לאחר כריתה כירורגית, יש לשמור את הרקמה בטמפרטורה של 4°C בתמיסת שימור רקמות (טבלה 1) עד לעיבוד.
         הערה: דגימות רקמה טריות באיכות גבוהה חיוניות להקמה מוצלחת של אורגנואידים. חשוב לעבד דגימות באופן מיידי, רצוי תוך 1-4 שעות לאחר כריתה כירורגית כדי לשמור על כדאיות הרקמות. בצע את כל ההליכים הבאים בסביבה אספטית באמצעות חומרים סטריליים וריאגנטים.
      2. חממו מראש לוחות תרבית תאי שטח חיבור נמוכים במיוחד (24 בארות) למשך שעה אחת באינקובטור ב -37 מעלות צלזיוס. הפשירו את תמצית קרום המרתף הקפואה (BME) למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C צלזיוס עד ממש לפני השימוש.
         הערה: כדי להבטיח הפשרה מלאה של BME, יש להניח אותו על קרח למשך 3 שעות לפחות. התכה מלאה של BME חיונית לתרבית אורגנואידים מוצלחת בשלבים הבאים.
      3. לפני השימוש, ודא שתמיסת העיכול (טבלה 1) מחוממת לטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
         הערה: הכינו את תמיסת העיכול טרייה בסביבה אספטית והשתמשו בה מיד.
   2. זרימת עיבוד ארגונית
      1. בארון זרימה למינרית, חותכים את רקמת הגידול לחתיכות קטנות (0.5-1 מ"מ³) באמצעות מספריים כירורגיים על צלחת פטרי. העבר את הרקמה החתוכה לצינור חרוטי של 15 מ"ל והוסף 5-10 מ"ל של מדיום בסיסי (טבלה 1).
         הערה: ניתן לאחסן את המדיום הבסיסי (טבלה 1) ב-4°C למשך עד חודש אחד.
      2. השתמשו בפיפט ברוטרופי כדי לשטוף כמה שיותר דם ותנו לו לעמוד 1-2 דקות כדי להסיר חלק מהסופרנטנט, כולל תאי דם וקרישי שומן צפים. חזור על הליך זה פעמיים.
      3. צנטריפוגות את התערובת ב 300 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, ובזהירות להסיר את supernatant. הוסף 5 מ"ל של תמיסת העיכול המחוממת מראש (טבלה 1) לרקמה החתוכה.
      4. סובב את הצינור ב 37 ° C לעיכול.
      5. לאחר 30 דקות של עיכול ראשוני, לחפש אשכולות קטנים של תאים מתחת למיקרוסקופ. בדוק כל 5-10 דקות כדי למנוע עיכול יתר.
         הערה: הזמן הדרוש לעיכול רקמות יהיה תלוי בגודל ובסוג הרקמה. עיכול רקמות לא יעלה על 90 דקות. רקמה מעוכלת יתר תופיע מתחת למיקרוסקופ כיריעה גדולה של תאים בודדים. רמת העיכול המתאימה מסומנת על ידי העובדה כי רוב אלה הם אשכולות תאים ויש להם מראה דמוי ענבים.
      6. עצור את העיכול על-ידי הוספת מדיום בסיסי קר (טבלה 1) וסנן לתוך צינור חדש של 50 מ"ל עם מסנן תאים של 100 מיקרומטר. מוסיפים מדיום בסיסי קר לנפח של 50 מ"ל.
      7. צנטריפוגה את התאים ב 2 × גרם במשך 10 דקות ב 8 ° C. הסר בזהירות את הסופרנאטנט והשהה מחדש את הגלולה על-ידי הוספת 50 מ"ל נוספים של מדיום בסיסי קר (טבלה 1). חזור על שלב זה פעמיים.
         הערה: צנטריפוגה במהירות נמוכה משמשת כדי לאפשר לצברי תאים קטנים להתיישב, בעוד תאי דם ופסולת תאים עדיין מרחפים בסופרנטנט; התהליך חוזר על עצמו מספר פעמים כדי להשיג מסת תאי רקמה טהורה יחסית.
2. ציפוי אורגנואיד
   1. לאחר השטיפה השנייה, מוציאים כמה שיותר מהסופרנאטנט ומשהים מחדש את מספר התאים הרצוי (1,000-5,000 תאים לבאר של צלחת בת 24 בארות) ב-BME המתאים לציפוי.
      הערה: יש לשמור תמיד את ה-BME על 4°C לפני השימוש.
   2. הוסף BME והשהה אשכולות תאים קטנים ב- DMEM/F-12 מתקדם על-ידי הוספת BME ופיפטציה עדינה למעלה ולמטה עד לצברי התאים מושהים לחלוטין. לשלוט על ריכוז BME בין 30% ל 50%.
   3. זרע 50 μL טיפות BME מעורבב עם אשכולות תאים במרכז לוחות תרבית 24 בארות.
      הערה: ככל האפשר, אל תתנו לטיפות להתפשט לדופן הדופן של צלחת הבאר. דופן לוחית הספיחה הנמוכה אינה במצב ספיחה נמוכה, ומגע בין הטיפות לדופן יוביל להידבקות, שאינה תורמת לדגירת ההמשך לאחר מכן.
   4. אפשר ללוחות עם הטיפות הנוספות להתמצק ב-37°C למשך 20 דקות. בסוף הדגירה מוסיפים 500 מיקרוליטר של מדיום שחומם מראש (טבלה 1) לכל באר ודגרים באינקובטור תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
3. תרבית אורגנואידים
   1. רעננו את מדיום התרבות (טבלה 1) אחת ליומיים-שלושה. בתחילת התרבית, תרבית את אורגנואידי HCC בתווך בידוד HCC (טבלה 1) במשך שבועיים.
   2. לאחר שבועיים של דגירה עם מדיום בידוד HCC, החלף את המדיום בתווך הרחבת אורגנואיד HCC (טבלה 1) (מאוחסן ב -4 ° C למשך עד שבועיים).
   3. רעננו את מדיום התרבות אחת ל-3 ימים.
   4. לאחר 7-10 ימים של תרבית עם מדיום התפשטות HCC כאשר האורגנואיד הגיע לצפיפות או לגודל המתאימים, התחל התערבויות ניסיוניות או מעבר או ליופיליזציה של האורגנואידים לפי הצורך.
4. מעבר אורגנואיד
   1. הכנת אספקה וחומרים
      1. חממו מראש לוחות תרבית תאי שטח חיבור נמוכים במיוחד (24 בארות) למשך שעה אחת באינקובטור ב -37 מעלות צלזיוס. הפשירו BME קפוא למשך הלילה ב-4°C צלזיוס עד ממש לפני השימוש.
      2. יש לחמם מראש את תמיסת קציר האורגנואידים ולהחליף טריפסין בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות.
   2. תהליך מעבר
      1. לאחר הסרת מדיום התרבית מצלחת הבאר, מעבירים את מתלה האורגנואיד לצינור 15 מ"ל.
      2. הוסף תמיסת קציר אורגנואידים בהתאם לכמות BME (500 μL של תמיסת קציר אורגנואידים לכל 50 μL של BME) על ידי גירוד ו pipeting למעלה ולמטה באמצעות אקדח פיפטה 1,000 μL.
         הערה: הימנע מבועות אוויר לאורך כל התהליך כדי למנוע אובדן אורגנואידים מכיוון שנוכחות של בועות אוויר מצביעה על לחץ פיפטינג גבוה יותר.
      3. יש לדגור במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
      4. שאפו בעדינות את ה-BME עם פיפטה של 1,000 μL ושימו לב שה-BME מומס לחלוטין. התבוננו כל 10 דקות עד שנצפה צביר תאי אורגנואיד ברור, ואז צנטריפוגה ב 400 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר והוציאו כמה שיותר מהסופרנאטנט.
         הערה: בשלב זה ניתן להקפיא ולשמר את האורגנואיד.
      5. לעיכול אנזימטי של אורגנואידים, יש להוסיף 1-5 מ"ל של תחליף טריפסין (בהתאם למספר האורגנואידים) ולדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 2 דקות. התבונן תחת המיקרוסקופ את מידת העיכול האנזימטי כדי לקבוע אם האורגנואידים מתפרקים לאשכולות קטנים של 2-10 תאים; אם לא, להמשיך את העיכול האנזימטי.
         הערה: עיכול יתר יגרום לליזה של צבירי תאים אורגנואידים לתאים בודדים, מה שיפחית את יכולת הקיום שלהם ויאריך את זמן התרבית שלאחר מכן.
      6. הוסף את הנפח המתאים של מדיום בסיסי קר (טבלה 1) כדי לעצור את העיכול.
      7. צנטריפוגה אורגנואידים ב 400 × גרם במשך 5 דקות ב 8 °C (8 °F); הסר את הסופרנאטנט ככל האפשר.
      8. השהה מחדש את מספר האורגנואידים הרצוי (1,000-5,000 אורגנואידים לבאר של צלחת בת 24 בארות) במטריצה המתאימה לציפוי. בצע את אותם השלבים כמו בסעיף 1.2.
         הערה: צפיפות הציפוי צריכה להיות אופטימלית בהתאם לקצב הגידול והגודל של האורגנואידים.
      9. עברו את האורגנואידים כל 10 ימים ביחס של 1:3 או 1:4 בהתאם לצפיפות גדילת האורגנואידים.
5. שימור והחייאה בהקפאה אורגנואידית
   1. שימור בהקפאה של אורגנואידים
      1. הכינו צינורות ליופיליזציה, כל צינור נפגש עם שתי בארות של צלחת 24 בארות המכילה אורגנואידים.
      2. בצע את השלבים 1.4.2.1 עד 1.4.2.4 עבור מעבר אורגנואידים לקבלת אורגנואידים ללא BME, והשהה מחדש בעדינות את האורגנואידים על ידי הוספת 500 μL / well של תמיסת ליופיליזציה אורגנואידית לצלחת של 24 בארות.
         הערה: בהתאם למצב הגידול והגודל של האורגנואידים, מומלץ לשמר בהקפאה את האורגנואידים בתרבית עד הדור השלישי.
      3. מעבירים את המתלה לצינורות ליופיליזציה ומניחים אותו בקופסה מקוררת הדרגתית בטמפרטורה של -80°C. לאחר קירור הדרגתי בטמפרטורה של -80°C למשך 24 שעות לפחות, העבירו את הצינורות לחנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך.
   2. החייאה של אורגנואידים
      1. יש לדגור על צינורות ליופיליים באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס ולהפסיק את הדגירה כאשר נותר רק גוש קרח קטן.
      2. צנטריפוגה ב 400 × גרם במשך 5 דקות ב 8 ° C כדי להסיר את supernatant לחלוטין.
      3. בצע את סעיפים 1.2 ו- 1.3 עבור הפעולות הבאות.

תוצאות

עם יישום ההליך הנ"ל, ניתן בדרך כלל להבחין בהופעתם של ספרואידים אורגנואידים HCC בטווח של 3 ימים (איור 1). איור 1A,B מראה את אורגנואיד HCC מבוסס, אשר מפתח מיד ספרואידים קומפקטיים המאופיינים בקצוות מעוגלים וציטוזול חדיר ביום הראשון להקמתו. במהלך הצמיחה של או...

Discussion

אחד היתרונות הבולטים של מודלים אורגנואידים שמקורם במטופל טמון ביכולתם לשכפל נאמנה את המאפיינים הביולוגיים של גידולים, המקיפים את מבנה הרקמה ואת הנוף הגנומי. מודלים אלה מפגינים רמת דיוק יוצאת דופן ומשקפים ביעילות את ההטרוגניות וההתקדמות של גידולים, אפילו לאורך תקופות ממושכות של גידול

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
[Leu15]-gastrin I human	Merck	G9145
1.5 mL Microtubes	Merck	AXYMCT150LC
A8301 (TGFβ inhibitor)	Tocris Bioscience	2939
B27 Supplement (503), minus vitamin A	Thermo Fisher Scientific	12587010
B-27 Supplement (503), serum-free	Thermo Fisher Scientific	17504044
BMP7	Peprotech	120-03P
Cell strainer size 100 μm	Merck	CLS352360
CHIR99021	Merck	SML1046
Collagenase D	Merck	11088858001
Corning Costar Ultra-Low	Merck	CLS3473
Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile	Corning	3473
Costar 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile	Corning	3471
Cultrex Organoid Harvesting Solution	R&D SYSTEMS	3700-100-01	Organoid harvesting solution
Cultrex Reduced Growth Factor BME, Type 2 PathClear (BME)	Merck	3533-005-02
DAPT	Merck	D5942
Dexamethasone	Merck	D4902
DMSO	Merck	C6164
DNaseI	Merck	DN25
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12	Thermo Fisher Scientific	12634028	Advanced DMEM/F-12
Earle’s balanced salt solution (EBSS)	Thermo Fisher Scientific	24010043
Forceps	N/A	N/A
Forskolin	Tocris Bioscience	1099
GlutaMAX supplement	Thermo Fisher Scientific	35050061
HEPES, 1 M	Thermo Fisher Scientific	15630080
Leica DM6 B Fluorescence Motorized Microscope	Leica	N/A
N2 supplement (1003)	Thermo Fisher Scientific	17502048
N-acetylcysteine	Merck	A0737-5MG
Nicotinamide	Merck	N0636
Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	339651
Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	339653
Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122
Recombinant human EGF	Peprotech	AF-100-15
Recombinant human FGF10	Peprotech	100-26
Recombinant human FGF19	Peprotech	100-32
Recombinant human HGF	Peprotech	100-39
Recombinant human Noggin	Peprotech	120-10C
Rho kinase inhibitor Y-27632 dihydrochloride	Merck	Y0503
R-spodin1-conditioned medium	(Broutier et al.)	N/A	Secretion of cell lines
Surgical scissors	N/A	N/A
Surgical specimen of tumor removed from HCC patients	Affiliated Cancer Hospital and Institute of Guangzhou Medical University	N/A
TNFα	Peprotech	315-01A
TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red	Thermo Fisher Scientific	12604013	Trypsin substitute
Wnt-3a-conditioned medium	(Broutier et al.)	N/A	Secretion of cell lines