Sviluppo e ottimizzazione di un modello di organoide derivato da pazienti affetti da carcinoma epatocellulare umano per l'identificazione di potenziali bersagli e la scoperta di farmaci

Riepilogo

Forniamo una panoramica completa e un perfezionamento dei protocolli esistenti per la formazione di organoidi del carcinoma epatocellulare (HCC), comprendendo tutte le fasi della coltivazione degli organoidi. Questo sistema funge da modello prezioso per l'identificazione di potenziali bersagli terapeutici e la valutazione dell'efficacia dei farmaci candidati.

Abstract

Il carcinoma epatocellulare (HCC) è un tumore altamente diffuso e letale in tutto il mondo e la sua scoperta tardiva e la mancanza di agenti terapeutici specifici efficaci richiedono ulteriori ricerche sulla sua patogenesi e sul suo trattamento. Gli organoidi, un nuovo modello che assomiglia molto al tessuto tumorale nativo e può essere coltivato in vitro, hanno suscitato un notevole interesse negli ultimi anni, con numerosi rapporti sullo sviluppo di modelli di organoidi per il cancro al fegato. In questo studio, abbiamo ottimizzato con successo la procedura e stabilito un protocollo di coltura che consente la formazione di organoidi HCC di dimensioni maggiori con condizioni stabili di passaggio e coltura. Abbiamo delineato in modo completo ogni fase della procedura, coprendo l'intero processo di dissociazione del tessuto HCC, placcatura di organoidi, coltura, passaging, crioconservazione e rianimazione, e abbiamo fornito precauzioni dettagliate in questo documento. Questi organoidi presentano una somiglianza genetica con i tessuti HCC originali e possono essere utilizzati per diverse applicazioni, tra cui l'identificazione di potenziali bersagli terapeutici per i tumori e il successivo sviluppo di farmaci.

Introduzione

Il carcinoma epatocellulare (HCC), un tumore 1 prevalente e ampiamente^{diversificato, ha} attirato una notevole attenzione all'interno della comunità medica. La presenza di plasticità di lignaggio e di una sostanziale eterogeneità nell'HCC suggerisce che le cellule tumorali originate da vari pazienti e persino lesioni distinte all'interno dello stesso paziente possono manifestare tratti molecolari e fenotipici dissimili, presentando così formidabili ostacoli nell'avanzamento di approcci terapeutici innovativi 2,3,4,5 . Di conseguenza, vi è una necessità imperativa di una migliore comprensione degli attributi biologici e dei meccanismi di resistenza ai farmaci nell'HCC per informare la formulazione di strategie terapeutiche più efficaci.

Negli ultimi decenni, i ricercatori hanno dedicato i loro sforzi allo sviluppo di modelli in vitro allo scopo di studiare l'HCC ^3,4. Nonostante alcuni progressi, le limitazioni persistono. Questi modelli comprendono una serie di tecniche, come l'utilizzo di linee cellulari, cellule primarie e xenotrapianti derivati da pazienti (PDX). Le linee cellulari fungono da modelli in vitro per la coltura a lungo termine di cellule tumorali ottenute da pazienti affetti da HCC, offrendo i vantaggi della praticità e della facilità di espansione. I modelli di cellule primarie prevedono l'isolamento diretto e la coltura di cellule tumorali primarie dai tessuti tumorali dei pazienti, fornendo così una rappresentazione delle caratteristiche biologiche che assomigliano molto a quelle dei pazienti stessi. I modelli PDX prevedono il trapianto di tessuti tumorali del paziente nei topi, con l'obiettivo di simulare più fedelmente la crescita e la risposta del tumore. Questi modelli sono stati fondamentali nella ricerca sull'HCC, ma possiedono alcune limitazioni, tra cui l'eterogeneità delle linee cellulari e l'incapacità di replicarsi completamente in condizioni in vivo. Inoltre, la coltivazione prolungata in vitro può comportare il deterioramento delle caratteristiche e delle funzionalità originali delle cellule, ponendo sfide nella rappresentazione accurata delle proprietà biologiche dell'HCC. Inoltre, l'utilizzo dei modelli PDX è dispendioso in termini di tempo e costoso³.

Per affrontare queste limitazioni e replicare in modo più accurato gli attributi fisiologici dell'HCC, l'utilizzo della tecnologia degli organoidi è stata introdotta come una promettente piattaforma di ricerca in grado di superare i vincoli precedenti. Gli organoidi, che sono modelli cellulari tridimensionali coltivati in vitro, hanno la capacità di replicare la struttura e la funzionalità degli organi reali. Tuttavia, nel contesto dell'HCC, esistono alcune sfide nella creazione di modelli di organoidi. Queste sfide includono descrizioni non sufficientemente dettagliate delle procedure di costruzione degli organoidi HCC, la mancanza di protocolli completi per l'intero processo di costruzione degli organoidi HCC e le dimensioni tipicamente ridotte degli organoidi coltivati ^6,7,8. Alla luce delle dimensioni tipicamente limitate degli organoidi coltivati, abbiamo cercato di affrontare queste sfide attraverso lo sviluppo di un protocollo completo che comprenda l'intera costruzione degli organoidi HCC⁶. Questo protocollo comprende la dissociazione tissutale, la placcatura di organoidi, la coltura, il passaging, la crioconservazione e la rianimazione. Ottimizzando le fasi procedurali e perfezionando la composizione del terreno di coltura, abbiamo stabilito con successo modelli di organoidi HCC in grado di crescere e passare a lungo termine ^6,8. Nelle sezioni successive, verrà presentato un resoconto completo delle complessità operative e dei fattori pertinenti coinvolti nella costruzione di organoidi HCC.

Protocollo

I tessuti sottoposti a biopsia umana sono stati ottenuti dal rispettivo paziente presso l'Ospedale Oncologico Affiliato e l'Istituto dell'Università di Medicina di Guangzhou ed è stato ottenuto il consenso informato dei pazienti. Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli su tutti i materiali, i reagenti e gli strumenti utilizzati in questo protocollo.

1. Stabilire organoidi HCC derivati da pazienti da campioni chirurgici

NOTA: L'istituzione degli organoidi HCC comprende varie fasi, vale a dire la dissociazione dei tessuti, la placcatura degli organoidi, la coltura, il passaggio, la crioconservazione e la rianimazione. Il processo di dissociazione tissutale richiede una durata di 2 ore, mentre la semina degli organoidi su una piastra richiede circa 40 minuti. Successivamente, la generazione iniziale di organoidi HCC subisce un periodo di coltura di 10-14 giorni utilizzando terreno di isolamento HCC. Una volta raggiunta una densità soddisfacente, vengono condotti passaggi di organoidi, che richiedono 1 ora. Le colture successive degli organoidi vengono quindi mantenute utilizzando il terreno di espansione HCC per 7-10 giorni, che possono variare a seconda del tasso di crescita e delle condizioni degli organoidi.

1. Dissociazione tissutale
   1. Preparazione di forniture e materiali
      1. Prelevare 1-2 cm³ di tessuto HCC da pazienti che non hanno ricevuto alcun precedente trattamento locale o sistemico prima dell'operazione. Dopo la resezione chirurgica, mantenere il tessuto a 4 °C in soluzione di conservazione tissutale (Tabella 1) fino al trattamento.
         NOTA: Campioni di tessuto fresco di alta qualità sono essenziali per il successo dell'insediamento degli organoidi. È importante processare i campioni tempestivamente, idealmente entro 1-4 ore dalla resezione chirurgica per mantenere la vitalità dei tessuti. Eseguire tutte le procedure successive in ambiente asettico utilizzando materiali e reagenti sterili.
      2. Preriscaldare le piastre di coltura cellulare a bassissima superficie di attacco (24 pozzetti) per 1 ora in un incubatore a 37 °C. Scongelare l'estratto di membrana basale congelato (BME) per una notte a 4 °C fino a poco prima dell'uso.
         NOTA: Per garantire lo scongelamento completo del BME, è necessario metterlo sul ghiaccio per almeno 3 ore. La fusione completa del BME è essenziale per il successo della coltura di organoidi nelle fasi successive.
      3. Prima dell'uso, assicurarsi che la soluzione di digestione (Tabella 1) sia riscaldata a una temperatura di 37 °C.
         NOTA: Preparare la soluzione di digestione fresca in un ambiente asettico e utilizzarla prontamente.
   2. Flusso di elaborazione organizzativa
      1. In una cabina a flusso laminare, tagliare il tessuto tumorale in piccoli pezzi (0,5-1 mm³) utilizzando forbici chirurgiche su una piastra di Petri. Trasferire il tessuto tagliato in una provetta conica da 15 mL e aggiungere 5-10 mL di terreno basale (Tabella 1).
         NOTA: Il terreno basale (Tabella 1) può essere conservato a 4 °C per un massimo di 1 mese.
      2. Utilizzare una pipetta barotropica per lavare via quanto più sangue possibile e lasciarla riposare per 1-2 minuti per rimuovere parte del surnatante, comprese eventuali cellule del sangue e coaguli di grasso galleggianti. Ripetere questa procedura due volte.
      3. Centrifugare la miscela a 300 × g per 5 minuti a temperatura ambiente e rimuovere con cura il surnatante. Aggiungere 5 mL della soluzione di digestione preriscaldata (Tabella 1) al tessuto tagliato.
      4. Ruotare la provetta a 37 °C per la digestione.
      5. Dopo 30 minuti di digestione iniziale, cerca piccoli gruppi di cellule al microscopio. Controllare ogni 5-10 minuti per evitare una digestione eccessiva.
         NOTA: Il tempo necessario per la digestione dei tessuti dipenderà dalle dimensioni e dal tipo di tessuto. La digestione dei tessuti non deve superare i 90 min. Il tessuto iperdigerito apparirà al microscopio come un grande foglio di singole cellule. Il livello appropriato di digestione è indicato dal fatto che la maggior parte di questi sono gruppi di cellule e hanno un aspetto simile all'uva.
      6. Interrompere la digestione aggiungendo terreno basale freddo (Tabella 1) e filtrare in una nuova provetta da 50 mL con un filtro cellulare da 100 μm. Aggiungere terreno basale freddo a un volume di 50 ml.
      7. Centrifugare le cellule a 2 × g per 10 minuti a 8 °C. Rimuovere con cautela il surnatante e risospendere il pellet aggiungendo altri 50 mL di terreno basale freddo (Tabella 1). Ripeti questo passaggio due volte.
         NOTA: La centrifugazione a bassa velocità viene utilizzata per consentire ai piccoli gruppi di cellule di stabilizzarsi, mentre le cellule del sangue e i detriti cellulari sono ancora sospesi nel surnatante; Il processo viene ripetuto più volte per ottenere una massa cellulare tissutale relativamente pura.
2. Placcatura di organoidi
   1. Dopo il secondo lavaggio, rimuovere la maggior parte possibile del surnatante e risospendere il numero desiderato di cellule (1.000-5.000 cellule per pozzetto di una piastra a 24 pozzetti) nel BME appropriato per la placcatura.
      NOTA: Tenere sempre il BME a 4 °C prima dell'uso.
   2. Aggiungere BME e sospendere i cluster di piccole cellule in Advanced DMEM/F-12 aggiungendo BME e pipettando delicatamente su e giù fino a quando gli aggregati cellulari non sono completamente sospesi. Controllare la concentrazione del BME tra il 30% e il 50%.
   3. Seminare goccioline di 50 μL di BME mescolate con cluster di cellule al centro di piastre di coltura a 24 pozzetti.
      NOTA: Per quanto possibile, non lasciare che le goccioline si diffondano sulla parete laterale della piastra del pozzetto. La parete laterale della piastra a basso adsorbimento non è in uno stato a basso adsorbimento e il contatto tra le goccioline e la parete laterale porterà all'adesione, che non favorisce la successiva incubazione.
   4. Lasciare solidificare le piastre con le goccioline aggiunte a 37 °C per 20 min. Al termine dell'incubazione, aggiungere 500 μL di terreno preriscaldato (Tabella 1) a ciascun pozzetto e incubare in un incubatore cellulare a 37 °C.
3. Coltura di organoidi
   1. Rinfrescare il terreno di coltura (Tabella 1) una volta ogni 2-3 giorni. All'inizio della coltura, coltivare gli organoidi di HCC in terreno di isolamento HCC (Tabella 1) per 2 settimane.
   2. Dopo 2 settimane di incubazione con terreno di isolamento HCC, sostituire il terreno con terreno di espansione organoide HCC (Tabella 1) (conservato a 4 °C per un massimo di 2 settimane).
   3. Rinfrescare il terreno di coltura una volta ogni 3 giorni.
   4. Dopo 7-10 giorni di coltura con terreno di espansione HCC, quando l'organoide ha raggiunto la densità o le dimensioni appropriate, iniziare interventi sperimentali o passaggio o liofilizzazione degli organoidi secondo necessità.
4. Passaggio di organoidi
   1. Preparazione di forniture e materiali
      1. Preriscaldare le piastre di coltura cellulare a bassissima superficie di attacco (24 pozzetti) per 1 ora in un incubatore a 37 °C. Scongelare il BME congelato per una notte a 4 °C fino a poco prima dell'uso.
      2. Preriscaldare la soluzione di raccolta degli organoidi e il sostituto della tripsina a 37 °C per 30 min.
   2. Processo di passaggio
      1. Dopo aver rimosso il terreno di coltura dalla piastra del pozzetto, trasferire la sospensione dell'organoide in una provetta da 15 ml.
      2. Aggiungere la soluzione di raccolta degli organoidi in base alla quantità di BME (500 μL di soluzione per il prelievo di organoidi per 50 μL di BME) raschiando e pipettando su e giù utilizzando una pistola per pipette da 1.000 μL.
         NOTA: Evitare la formazione di bolle d'aria durante tutto il processo per evitare la perdita di organoidi, poiché la presenza di bolle d'aria indica una maggiore pressione di pipettaggio.
      3. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.
      4. Aspirare delicatamente il BME con una pipetta da 1.000 μL e osservare che il BME sia completamente disciolto. Osservare ogni 10 minuti fino a quando non si osserva un gruppo di cellule organoidi chiare, quindi centrifugare a 400 × g per 5 minuti a temperatura ambiente e rimuovere quanto più surnatante possibile.
         NOTA: In questa fase, l'organoide può essere congelato e conservato.
      5. Per la digestione enzimatica degli organoidi, aggiungere 1-5 mL del sostituto della tripsina (in base al numero di organoidi) e incubare a 37 °C per 2 min. Osservare al microscopio il grado di digestione enzimatica per determinare se gli organoidi si dissociano in piccoli gruppi di 2-10 cellule; In caso contrario, continuare la digestione enzimatica.
         NOTA: L'eccessiva digestione comporterà la lisi di gruppi di cellule organoidi in singole cellule, diminuendone la vitalità e prolungando il successivo tempo di coltura.
      6. Aggiungere il volume appropriato di terreno basale freddo (Tabella 1) per arrestare la digestione.
      7. Centrifugare gli organoidi a 400 × g per 5 minuti a 8 °C; Rimuovere il surnatante il più possibile.
      8. Risospendere il numero desiderato di organoidi (1.000-5.000 organoidi per pozzetto di una piastra a 24 pozzetti) nella matrice appropriata per la placcatura. Seguire gli stessi passaggi della sezione 1.2.
         NOTA: La densità di placcatura deve essere ottimizzata in base al tasso di crescita e alle dimensioni degli organoidi.
      9. Far passare gli organoidi ogni 10 giorni in un rapporto di 1:3 o 1:4 a seconda della densità di crescita degli organoidi.
5. Crioconservazione e rianimazione di organoidi
   1. Crioconservazione di organoidi
      1. Preparare le provette di liofilizzazione, ciascuna delle quali confluisce con due pozzetti di una piastra a 24 pozzetti contenente organoidi.
      2. Seguire i passaggi da 1.4.2.1 a 1.4.2.4 per il passaggio degli organoidi per ottenere organoidi senza BME e risospendere delicatamente gli organoidi aggiungendo 500 μL/pozzetto di soluzione di liofilizzazione degli organoidi a una piastra a 24 pozzetti.
         NOTA: A seconda dello stato di crescita e delle dimensioni degli organoidi, si consiglia di crioconservare gli organoidi in coltura fino alla terza generazione.
      3. Trasferire la sospensione in tubi di liofilizzazione e posizionarla in una scatola raffreddata a gradiente a -80 °C. Dopo il raffreddamento a gradiente a -80 °C per almeno 24 ore, trasferire le provette in azoto liquido per la conservazione a lungo termine.
   2. Rianimazione di organoidi
      1. Incubare le provette liofilizzate a bagnomaria a 37 °C e interrompere l'incubazione quando rimane solo un piccolo blocco di ghiaccio.
      2. Centrifugare a 400 × g per 5 minuti a 8 °C per rimuovere completamente il surnatante.
      3. Seguire le sezioni 1.2 e 1.3 per le operazioni successive.

Risultati

Dopo aver implementato la procedura di cui sopra, l'emergere di sferoidi organoidi HCC è tipicamente osservabile nell'arco di 3 giorni (Figura 1). La Figura 1A,B mostra l'organoide HCC stabilito, che sviluppa prontamente sferoidi compatti caratterizzati da bordi arrotondati e citosol permeabile il primo giorno di stabilimento. Durante la crescita degli organoidi HCC, l'uso di diverse concentrazioni di BME ha avuto effetti diversi sul tasso di c...

Discussione

Un notevole vantaggio dei modelli di organoidi derivati da pazienti risiede nella loro capacità di replicare fedelmente le caratteristiche biologiche dei tumori, comprendendo la struttura dei tessuti e il panorama genomico. Questi modelli dimostrano un notevole livello di accuratezza e rispecchiano efficacemente l'eterogeneità e la progressione dei tumori, anche su lunghi periodi di coltivazione ^6,8,9. Attraverso l'utilizzo di...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
[Leu15]-gastrin I human	Merck	G9145
1.5 mL Microtubes	Merck	AXYMCT150LC
A8301 (TGFβ inhibitor)	Tocris Bioscience	2939
B27 Supplement (503), minus vitamin A	Thermo Fisher Scientific	12587010
B-27 Supplement (503), serum-free	Thermo Fisher Scientific	17504044
BMP7	Peprotech	120-03P
Cell strainer size 100 μm	Merck	CLS352360
CHIR99021	Merck	SML1046
Collagenase D	Merck	11088858001
Corning Costar Ultra-Low	Merck	CLS3473
Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile	Corning	3473
Costar 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile	Corning	3471
Cultrex Organoid Harvesting Solution	R&D SYSTEMS	3700-100-01	Organoid harvesting solution
Cultrex Reduced Growth Factor BME, Type 2 PathClear (BME)	Merck	3533-005-02
DAPT	Merck	D5942
Dexamethasone	Merck	D4902
DMSO	Merck	C6164
DNaseI	Merck	DN25
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12	Thermo Fisher Scientific	12634028	Advanced DMEM/F-12
Earle’s balanced salt solution (EBSS)	Thermo Fisher Scientific	24010043
Forceps	N/A	N/A
Forskolin	Tocris Bioscience	1099
GlutaMAX supplement	Thermo Fisher Scientific	35050061
HEPES, 1 M	Thermo Fisher Scientific	15630080
Leica DM6 B Fluorescence Motorized Microscope	Leica	N/A
N2 supplement (1003)	Thermo Fisher Scientific	17502048
N-acetylcysteine	Merck	A0737-5MG
Nicotinamide	Merck	N0636
Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	339651
Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	339653
Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122
Recombinant human EGF	Peprotech	AF-100-15
Recombinant human FGF10	Peprotech	100-26
Recombinant human FGF19	Peprotech	100-32
Recombinant human HGF	Peprotech	100-39
Recombinant human Noggin	Peprotech	120-10C
Rho kinase inhibitor Y-27632 dihydrochloride	Merck	Y0503
R-spodin1-conditioned medium	(Broutier et al.)	N/A	Secretion of cell lines
Surgical scissors	N/A	N/A
Surgical specimen of tumor removed from HCC patients	Affiliated Cancer Hospital and Institute of Guangzhou Medical University	N/A
TNFα	Peprotech	315-01A
TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red	Thermo Fisher Scientific	12604013	Trypsin substitute
Wnt-3a-conditioned medium	(Broutier et al.)	N/A	Secretion of cell lines