Sviluppo e ottimizzazione di un modello di organoide derivato da pazienti affetti da carcinoma epatocellulare umano per l'identificazione di potenziali bersagli e la scoperta di farmaci

Riepilogo

Forniamo una panoramica completa e un perfezionamento dei protocolli esistenti per la formazione di organoidi del carcinoma epatocellulare (HCC), comprendendo tutte le fasi della coltivazione degli organoidi. Questo sistema funge da modello prezioso per l'identificazione di potenziali bersagli terapeutici e la valutazione dell'efficacia dei farmaci candidati.

Abstract

Il carcinoma epatocellulare (HCC) è un tumore altamente diffuso e letale in tutto il mondo e la sua scoperta tardiva e la mancanza di agenti terapeutici specifici efficaci richiedono ulteriori ricerche sulla sua patogenesi e sul suo trattamento. Gli organoidi, un nuovo modello che assomiglia molto al tessuto tumorale nativo e può essere coltivato in vitro, hanno suscitato un notevole interesse negli ultimi anni, con numerosi rapporti sullo sviluppo di modelli di organoidi per il cancro al fegato. In questo studio, abbiamo ottimizzato con successo la procedura e stabilito un protocollo di coltura che consente la formazione di organoidi HCC di dimensioni maggiori con condizioni stabili di passaggio e coltura. Abbiamo delineato in modo completo ogni fase della procedura, coprendo l'intero processo di dissociazione del tessuto HCC, placcatura di organoidi, coltura, passaging, crioconservazione e rianimazione, e abbiamo fornito precauzioni dettagliate in questo documento. Questi organoidi presentano una somiglianza genetica con i tessuti HCC originali e possono essere utilizzati per diverse applicazioni, tra cui l'identificazione di potenziali bersagli terapeutici per i tumori e il successivo sviluppo di farmaci.

Introduzione

Il carcinoma epatocellulare (HCC), un tumore 1 prevalente e ampiamente^{diversificato, ha} attirato una notevole attenzione all'interno della comunità medica. La presenza di plasticità di lignaggio e di una sostanziale eterogeneità nell'HCC suggerisce che le cellule tumorali originate da vari pazienti e persino lesioni distinte all'interno dello stesso paziente possono manifestare tratti molecolari e fenotipici dissimili, presentando così formidabili ostacoli nell'avanzamento di approcci terapeutici innovativi 2,3,4,5 . ....

Protocollo

I tessuti sottoposti a biopsia umana sono stati ottenuti dal rispettivo paziente presso l'Ospedale Oncologico Affiliato e l'Istituto dell'Università di Medicina di Guangzhou ed è stato ottenuto il consenso informato dei pazienti. Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli su tutti i materiali, i reagenti e gli strumenti utilizzati in questo protocollo.

1. Stabilire organoidi HCC derivati da pazienti da campioni chirurgici

NOTA: L'istituzione degli organoidi HCC comprende varie fasi, vale a dire la dissociazione dei tessuti, la placcatura degli organoidi, la coltura, il passaggi....

Discussione

Un notevole vantaggio dei modelli di organoidi derivati da pazienti risiede nella loro capacità di replicare fedelmente le caratteristiche biologiche dei tumori, comprendendo la struttura dei tessuti e il panorama genomico. Questi modelli dimostrano un notevole livello di accuratezza e rispecchiano efficacemente l'eterogeneità e la progressione dei tumori, anche su lunghi periodi di coltivazione ^6,8,9. Attraverso l'utilizzo di.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
[Leu15]-gastrin I human	Merck	G9145
1.5 mL Microtubes	Merck	AXYMCT150LC
A8301 (TGFβ inhibitor)	Tocris Bioscience	2939
B27 Supplement (503), minus vitamin A	Thermo Fisher Scientific	12587010
B-27 Supplement (503), serum-free	Thermo Fisher Scientific	17504044
BMP7	Peprotech	120-03P
Cell strainer size 100 μm	Merck	CLS352360
CHIR99021	Merck	SML1046
Collagenase D	Merck	11088858001
Corning Costar Ultra-Low	Merck	CLS3473
Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile	Corning	3473
Costar 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile	Corning	3471
Cultrex Organoid Harvesting Solution	R&D SYSTEMS	3700-100-01	Organoid harvesting solution
Cultrex Reduced Growth Factor BME, Type 2 PathClear (BME)	Merck	3533-005-02
DAPT	Merck	D5942
Dexamethasone	Merck	D4902
DMSO	Merck	C6164
DNaseI	Merck	DN25
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12	Thermo Fisher Scientific	12634028	Advanced DMEM/F-12
Earle’s balanced salt solution (EBSS)	Thermo Fisher Scientific	24010043
Forceps	N/A	N/A
Forskolin	Tocris Bioscience	1099
GlutaMAX supplement	Thermo Fisher Scientific	35050061
HEPES, 1 M	Thermo Fisher Scientific	15630080
Leica DM6 B Fluorescence Motorized Microscope	Leica	N/A
N2 supplement (1003)	Thermo Fisher Scientific	17502048
N-acetylcysteine	Merck	A0737-5MG
Nicotinamide	Merck	N0636
Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	339651
Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	339653
Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122
Recombinant human EGF	Peprotech	AF-100-15
Recombinant human FGF10	Peprotech	100-26
Recombinant human FGF19	Peprotech	100-32
Recombinant human HGF	Peprotech	100-39
Recombinant human Noggin	Peprotech	120-10C
Rho kinase inhibitor Y-27632 dihydrochloride	Merck	Y0503
R-spodin1-conditioned medium	(Broutier et al.)	N/A	Secretion of cell lines
Surgical scissors	N/A	N/A
Surgical specimen of tumor removed from HCC patients	Affiliated Cancer Hospital and Institute of Guangzhou Medical University	N/A
TNFα	Peprotech	315-01A
TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red	Thermo Fisher Scientific	12604013	Trypsin substitute
Wnt-3a-conditioned medium	(Broutier et al.)	N/A	Secretion of cell lines