Análisis multiómico de TMEM200A como biomarcador pancancerígeno

Resumen

En este trabajo se presenta un protocolo en el que se combinan múltiples herramientas bioinformáticas para estudiar las funciones biológicas de TMEM200A en cáncer. Además, también validamos experimentalmente las predicciones bioinformáticas.

Resumen

Se sabe que la proteína transmembrana, TMEM200A, está asociada con cánceres humanos e infiltración inmunitaria. Aquí, evaluamos la función de TMEM200A en cánceres comunes mediante análisis multiómico y utilizamos cultivos celulares in vitro de células gástricas para verificar los resultados. La expresión de TMEM200A en varios tipos de cáncer humano se evaluó utilizando los datos de RNA-seq de la base de datos Xena de la UCSC. El análisis bioinformático reveló un papel potencial de TMEM200A como biomarcador diagnóstico y pronóstico.

Se cultivaron cultivos de líneas celulares gástricas y cancerosas normales y se eliminó TMEM200A se eliminó. Los niveles de expresión de TMEM200A se midieron mediante el uso de la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real y Western blot. A continuación, se utilizaron estudios de pérdida de función in vitro para determinar las funciones de TMEM200A en el comportamiento maligno y la formación tumoral de las células de cáncer gástrico (GC). Se utilizaron Western blots para evaluar el efecto del knockdown en la transición epitelio-mesenquimal (EMT) y la vía de señalización PI3K/AKT en GC. El análisis bioinformático mostró que TMEM200A se expresaba en niveles altos en GC.

La proliferación de las células GC fue inhibida por TMEM200A knockdown, que también disminuyó la vimentina, la N-cadherina y las proteínas Snai, e inhibió la fosforilación de AKT. La vía de señalización PI3K/AKT también parece estar implicada en la regulación mediada por TMEM200A del desarrollo de GC. Los resultados aquí presentados sugieren que TMEM200A regula el microambiente tumoral afectando a la EMT. TMEM200A también puede afectar a la EMT a través de la señalización PI3K/AKT, influyendo así en el microambiente tumoral. Por lo tanto, en los pancánceres, especialmente en los GC, TMEM200A puede ser un biomarcador y un oncogén potenciales.

Introducción

El cáncer se ha convertido en un problema persistente de salud pública que pone en peligro la salud humana en todo el mundo¹debido a sus altas tasas de morbilidad y mortalidad en todo el mundo, lo que supone una pesada carga financiera y médica para la sociedad². En los últimos años se han logrado avances significativos en la terapia del cáncer gracias al descubrimiento de marcadores de cáncer³, y los investigadores han desarrollado nuevos métodos de diagnóstico y nuevos fármacos para tratar el cáncer. Sin embargo, algunos pacientes con cáncer todavía tienen un pronóstico precario debido a factore....

Protocolo

1. La base de datos del Atlas del Genoma del Cáncer (TCGA)

NOTA: La base de datos del Atlas del Genoma del Cáncer (TCGA) contiene los datos de secuenciación de genes en diferentes tejidos tumorales¹⁴. Los datos de RNA-seq en TCGA para el estudio de los formatos de transcripciones de TMEM200A por parte por millón (TPM) se extrajeron del sitio web de UCSC Xena ¹⁵ (https://xenabrowser. net/datapages/) y se transformaron log2 para comparar las expresiones entre muestras.

1. Vaya a la interfaz del sitio web de UCSC Xena

Discusión

TMEM200A pertenece a una familia de TMEMs que es esencial para que las células cancerosas proliferen³⁸. La expresión variable de TMEM200A en diferentes neoplasias malignas ha recibido menos atención y falta una investigación exhaustiva del pancáncer. Sin embargo, la evidencia continúa acumulándose, mostrando que la familia de proteínas transmembrana TMEM puede ser importante para mantener las células cancerosas malignas a través de interacciones con varias proteínas, p.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-AKT antibody	Proteintech Group, Inc	60203-2-Ig
Anti-E-cadherin antibody	Proteintech Group, Inc	20874-1-AP
anti-glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) antibody	Proteintech Group, Inc	10494-1-AP
Anti-N-cadherin antibody	Proteintech Group, Inc	22018-1-AP
Anti-P-AKT antibody	Proteintech Group, Inc	66444-1-Ig
Anti-snail antibody	Proteintech Group, Inc	13099-1-AP
Anti-Vimentin antibody	Proteintech Group, Inc	10366-1-AP
AxyPrepMultisourceTotalRNAMini- prep Kit	Suzhou Youyi Landi Biotechnology Co., Ltd	UEL-UE-MN-MS-RNA-50G
BCA Protein Assay Kit	Epizyme Biotech	ZJ101L
CCK-8 reagent	MedChemExpress	HY-K0301-500T
Fetal bovine serum (FBS)	CYAGEN BIOSCIENCES (GUANGZHOU) INC	FBSSR-01021
GAPDH primer	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.		Forward primer (5’-3’): TGACATCAAGAAGGTG GTGAAGCAG; Reverse primer (5’-3’): GTGTCGCTGTTGAAG TCAGAGGAG
HighGene plus Transfection reagent	ABclonal	RM09014P
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse lgG (H+L)	Proteintech Group, Inc	SA00001-1
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit lgG (H+L)	Proteintech Group, Inc	SA00001-2
Human gastric mucosal epithelial GES-1 cells	Guangzhou Cellcook Biotech Co.,Ltd.
Human STAD HGC-27 cells	Procell Life Science&Technology Co.,Ltd
Human STAD SGC-7901 cells	Procell Life Science&Technology Co.,Ltd
MonAmp SYBR Green qPCR Mix (None ROX)	Mona (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd	MQ10101S
MonScript RTIII All-in-One Mix with dsDNase	Mona (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd	MR05101M
Omni-ECL Femto Light Chemiluminescence Kit	Epizyme Biotech	SQ201
PAGE Gel Fast Preparationb Kit	Epizyme Biotech	PG111
Penicillin-streptomycin (Pen-Strep)	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd	P1400-100
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane	Merck KGaA	IPVH00010-1
Protein Free Rapid Blocking Buffer	Epizyme Biotech	PS108P
RIPA lysis solution	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd	R0010
RPMI 1640 complete medium	Thermo Fisher Scientific	C11875500BT
Skimmed milk	Campina: Elk
TBST buffer solution	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd	T1082
The protein loading buffer	Epizyme Biotech	LT101S
TMEM200A knockdown plasmid	MiaoLing Plasmid
TMEM200A primer	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.		Forward primer (5’-3’): AAGGCGGTGTGGTGGTTCG; Reverse primer (5’-3’): GATTTTGGTCTCTTTGTCACGGTT
TMEM200A SiRNA1	MiaoLing Plasmid		Forward primer (5’-3’): ACAACTGATGATAAGACCAG; Reverse primer (5’-3’): TGTTGACTACTATTCTGGTC
TMEM200A SiRNA2	MiaoLing Plasmid		Forward primer (5’-3’): CGTGTGAATGTCAATGACTG; Reverse primer (5’-3’): GCACACTTACAGTTACTGAC
TMEM200A SiRNA3	MiaoLing Plasmid		Forward primer (5’-3’): ACAACCACAACATCTGCCCG; Reverse primer (5’-3’): TGTTGGTGTTGTAGACGGGC
Transmembrane protein 200A Antibody	Proteintech Group, Inc	48081-1
Equipment
CO2 cell culture incubator	Haier Group	PYXE-80IR
Electrophoresis instrument	Bio-RAD
Fluorescence quantitative PCR instrument	Bio-RAD
Gel Imaging System (Tanon 5200)	Tanon Science & Technology Co., Ltd	LAB-0002-0007-SHTN
Multifunctional Enzyme Labeler	Berthold