Análisis multiómico de TMEM200A como biomarcador pancancerígeno

Resumen

En este trabajo se presenta un protocolo en el que se combinan múltiples herramientas bioinformáticas para estudiar las funciones biológicas de TMEM200A en cáncer. Además, también validamos experimentalmente las predicciones bioinformáticas.

Resumen

Se sabe que la proteína transmembrana, TMEM200A, está asociada con cánceres humanos e infiltración inmunitaria. Aquí, evaluamos la función de TMEM200A en cánceres comunes mediante análisis multiómico y utilizamos cultivos celulares in vitro de células gástricas para verificar los resultados. La expresión de TMEM200A en varios tipos de cáncer humano se evaluó utilizando los datos de RNA-seq de la base de datos Xena de la UCSC. El análisis bioinformático reveló un papel potencial de TMEM200A como biomarcador diagnóstico y pronóstico.

Se cultivaron cultivos de líneas celulares gástricas y cancerosas normales y se eliminó TMEM200A se eliminó. Los niveles de expresión de TMEM200A se midieron mediante el uso de la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real y Western blot. A continuación, se utilizaron estudios de pérdida de función in vitro para determinar las funciones de TMEM200A en el comportamiento maligno y la formación tumoral de las células de cáncer gástrico (GC). Se utilizaron Western blots para evaluar el efecto del knockdown en la transición epitelio-mesenquimal (EMT) y la vía de señalización PI3K/AKT en GC. El análisis bioinformático mostró que TMEM200A se expresaba en niveles altos en GC.

La proliferación de las células GC fue inhibida por TMEM200A knockdown, que también disminuyó la vimentina, la N-cadherina y las proteínas Snai, e inhibió la fosforilación de AKT. La vía de señalización PI3K/AKT también parece estar implicada en la regulación mediada por TMEM200A del desarrollo de GC. Los resultados aquí presentados sugieren que TMEM200A regula el microambiente tumoral afectando a la EMT. TMEM200A también puede afectar a la EMT a través de la señalización PI3K/AKT, influyendo así en el microambiente tumoral. Por lo tanto, en los pancánceres, especialmente en los GC, TMEM200A puede ser un biomarcador y un oncogén potenciales.

Introducción

El cáncer se ha convertido en un problema persistente de salud pública que pone en peligro la salud humana en todo el mundo¹debido a sus altas tasas de morbilidad y mortalidad en todo el mundo, lo que supone una pesada carga financiera y médica para la sociedad². En los últimos años se han logrado avances significativos en la terapia del cáncer gracias al descubrimiento de marcadores de cáncer³, y los investigadores han desarrollado nuevos métodos de diagnóstico y nuevos fármacos para tratar el cáncer. Sin embargo, algunos pacientes con cáncer todavía tienen un pronóstico precario debido a factores como la resistencia a los medicamentos, los efectos secundarios de los medicamentos y la sensibilidad química⁴. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de identificar nuevos biomarcadores para el cribado y el tratamiento de los cánceres en estadio temprano⁵.

Las proteínas de membrana son proteínas que pueden unirse e integrarse en las membranas de las células y orgánulos⁶. Estas se pueden agrupar en tres categorías dependiendo de la fuerza de unión a la membrana y su localización: proteínas ancladas a lípidos, proteínas integrales y proteínas periféricas de membrana ^7,8. Una proteína transmembrana (TMEM) es una proteína de membrana integral que consta de al menos un segmento transmembrana⁹, que pasa total o parcialmente a través de la membrana biológica.

Aunque los mecanismos de acción de las proteínas pertenecientes a la familia TMEM no se conocen bien, se sabe que estas proteínas están involucradas en varios tipos de cánceres¹⁰. Varias proteínas TMEM se asocian con fenotipos migratorios, proliferativos e invasivos, y su expresión a menudo se asocia con el pronóstico del paciente¹¹. Por lo tanto, los miembros de la familia TMEM se han convertido en el objetivo de la investigación. Una revisión exhaustiva de los informes existentes sobre TMEM reveló que se asocian principalmente con la señalización inter e intracelular¹², las enfermedades relacionadas con el sistema inmunitario y la tumorigénesis¹⁰. Muchos TMEM también poseen importantes funciones fisiológicas, por ejemplo, los canales iónicos en la membrana plasmática, la activación de las vías de transducción de señales, así como la mediación de la quimiotaxis celular, la adhesión, la apoptosis y la autofagia¹⁰. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que las proteínas TMEM pueden ser marcadores pronósticos importantes en la detección y el tratamiento de tumores.

TMEM200A expresión está significativamente elevada en el cáncer gástrico (CG). Una mayor expresión de TMEM200A¹³, que tiene ocho exones y una longitud total de 77,536 kb en el cromosoma 6q23.1, se ha relacionado con un mal pronóstico de supervivencia global (SG) en los casos de GC. Sin embargo, los cambios en su expresión rara vez se han reportado en estudios oncológicos. En este artículo se compara y analiza la utilidad de la TMEM200A como diana terapéutica y marcador diagnóstico tumoral en diversos estudios oncológicos utilizando diferentes conjuntos de datos disponibles públicamente. Evaluamos la efectividad de TMEM200A como biomarcador diagnóstico y pronóstico pancancerígeno, así como sus niveles de expresión en varios tipos de cáncer humano utilizando datos de RNA-seq de las bases de datos Xena y TCGA de la UCSC, así como mediante reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) y Western blot.

El efecto de los niveles de expresión de TMEM200A en las tasas de mutación, los procesos reguladores, el diagnóstico y pronóstico tumoral, la infiltración inmunitaria y la inmunoterapia se investigó más a fondo utilizando una combinación de herramientas computacionales y sitios web de conjuntos de datos. Se utilizaron las bases de datos CBioPortal y el Catálogo de Mutaciones Somáticas en Células Cancerosas (COSMIC) para examinar las mutaciones en TMEM200A. Se utilizaron los sitios web Sangerbox y TISIDB para comprender cómo influye la TMEM200A en la infiltración inmunitaria. Se utilizó la herramienta en línea Tumor Immune Single Cell Center (TISCH) y la base de datos CancerSEA para investigar la función de TMEM200A. Finalmente, para evaluar el impacto de la TMEM200A en el comportamiento maligno y la función de desarrollo tumoral de las células GC, se realizó un experimento de pérdida de función en un ensayo in vitro . Además, se realizó Western blot para evaluar cómo TMEM200A knockdown afectaba a la vía de señalización PI3K/AKT y a la transición epitelio-mesenquimal (EMT) en GC.

Protocolo

1. La base de datos del Atlas del Genoma del Cáncer (TCGA)

NOTA: La base de datos del Atlas del Genoma del Cáncer (TCGA) contiene los datos de secuenciación de genes en diferentes tejidos tumorales¹⁴. Los datos de RNA-seq en TCGA para el estudio de los formatos de transcripciones de TMEM200A por parte por millón (TPM) se extrajeron del sitio web de UCSC Xena ¹⁵ (https://xenabrowser. net/datapages/) y se transformaron log2 para comparar las expresiones entre muestras.

1. Vaya a la interfaz del sitio web de UCSC Xena .
2. Haga clic en la pestaña Iniciar Xena .
3. Haga clic en la pestaña CONJUNTOS DE DATOS en la parte superior de la pantalla.
4. De las 129 cohortes y 1.571 conjuntos de datos de esta página, haga clic en la pestaña para ver un total de 33 tipos de cáncer, como la leucemia mieloide aguda (LAML) GDC TCGA, el cáncer de corteza suprarrenal (ACC) y el cáncer de vías biliares (CHOL) y más.
5. En el menú RNAseq de expresión génica , seleccione y haga clic en la pestaña HTSeq - FPKM GDC Hub .
   NOTA: HTSeq - FPKM GDC Hub representa los datos que se han corregido mediante consentimiento.
6. Desde el menú de descargas , haga clic en su enlace correspondiente.
   NOTA: Con el método anterior, se descargaron datos de RNA-Seq para 33 tipos diferentes de cáncer.
7. Descomprima el archivo zip de datos de RNA-seq para 33 tipos diferentes de cáncer en un solo archivo en la carpeta del escritorio de la computadora.
8. Unifique los archivos txt descomprimidos en la misma carpeta y coloque los scripts de Perl en esta carpeta.
9. Abra el software Perl , copie y pegue la ruta de la carpeta en el software Perl donde se encuentra el cursor del mouse, presione la tecla Enter , ingrese el nombre del código Perl y el nombre del gen (TMEM200A), y luego presione la tecla Enter para obtener un nuevo archivo txt (singleGeneExp.txt).
   NOTA: Este nuevo archivo txt (singleGeneExp.txt) contiene la expresión génica de TMEM200A en 33 cánceres en diferentes pacientes.
10. Abra el código de R (diffR) y copie y pegue la ruta de acceso donde se encuentra el archivo singleGeneExp.txt en la línea donde se encuentra setwd en el código de R.
11. Abra el software R, ejecute el código R modificado (diffR) y dibuje la imagen a través del paquete "ggpubr".

2. La base de datos TIMER2.0

1. Vaya a la interfaz del sitio web de la base de datos TIMER2.0 (http://timer.cistrome.org) ¹⁶.
2. Haga clic en la pestaña Exploración del cáncer.
3. Introduzca el ID del gen (TMEM200A) en el cuadro de búsqueda y haga clic en la pestaña Enviar para obtener las imágenes de expresión diferencial de TMEM200A en diferentes tipos de tumores.

3. Atlas de proteínas humanas (HPA)

1. Vaya a la interfaz web del Atlas de Proteínas Humanas (HPA) (www.proteinatlas.org) ¹⁷.
2. Escriba ID (TMEM200A) en el cuadro de búsqueda y haga clic en el botón Buscar . Seleccione el subatlas TISSUE.
3. Coloque el cursor sobre la página y desplácese hacia abajo para encontrar la pestaña Descripción general de la expresión de proteínas .
   NOTA: La sección Descripción general de la expresión de proteínas muestra los niveles de expresión de proteínas de TMEM200A en 45 órganos del cuerpo humano.

4. La matriz de plataforma de metilación de ADN HumanMethylation450 Illumina Infinium

NOTA: Se utilizó la matriz de plataforma de metilación del ADN HumanMethylation450 Illumina Infinium para recopilar datos sobre la metilación. Pudimos evaluar los niveles TMEM200A de metilación del ADN utilizando la base de datos SMART (http://www.bioinfo-zs.com/smartapp/)¹⁸.

1. Vaya a la interfaz del sitio web de SMART .
2. Introduzca el ID del gen (TMEM200A) en el cuadro de búsqueda para obtener la distribución de TMEM200A en los cromosomas y el nivel de metilación de TMEM200A en diferentes tipos de neoplasias malignas.
3. Desplácese hacia abajo en la página hasta el menú Haga clic para comprobar la metilación agregada de CpG y haga clic en el botón Trazar . En la parte inferior de la página, busque y haga clic en el botón Descargar figura . Descargue la figura.

5. La base de datos de la UALCAN

1. Vaya a la interfaz del sitio web de UALCAN .
   NOTA: A través de la base de datos UALCAN (http://ualcan.path.uab.edu/analysisprot.html)¹⁹ se generaron diagramas de caja de los niveles de metilación del promotor TMEM200A en diversas neoplasias malignas
2. En la parte superior de la página, haga clic en el botón TCGA .
3. Ingrese TMEM200A en el cuadro de entrada Gene ID en la pantalla. En el menú del conjunto de datos TCGA , desplácese hacia abajo y seleccione el tipo de cáncer que desea consultar.
4. Después de hacer clic en el botón Explorar , haga clic en su análisis de subgrupos Metilación en el menú Enlaces para análisis para obtener los resultados de metilación de este tumor.
   NOTA: Con este método, obtuvimos resultados de metilación para 22 tumores en la base de datos UALCAN .

6. Base de datos del Catálogo de Mutaciones Somáticas en Células Cancerosas (COSMIC)

1. Vaya a la interfaz del sitio web del Catálogo de Mutaciones Somáticas en Células Cancerosas (COSMIC).
   NOTA: Los datos sobre mutaciones codificantes, reordenamientos genómicos mutantes no codificantes y genes de fusión en el genoma humano están disponibles en la base de datos ²⁰ (https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic/ del Catálogo de Mutaciones Somáticas en Células Cancerosas (COSMIC), que también se utiliza para determinar la frecuencia de varias mutaciones TMEM200A en varios tipos de cáncer.
2. Ingrese la identificación del gen (TMEM200A) en el cuadro de búsqueda y haga clic en el botón BUSCAR para ir a una nueva pantalla.
3. En el menú Genes , localice y haga clic en el enlace donde aparece el nombre de identificación del gen del TMEM200A .
4. Busque la columna Agrupación de distribut de mutación en la nueva página para obtener el estado de mutación de TMEM200A en el tumor.

7. CBioPortal

1. Vaya a la interfaz del sitio web de CBioPortal .
   NOTA: Los datos genómicos del cáncer se pueden encontrar, descargar, analizar y visualizar utilizando la base de datos cBioPortal (www.cioportal.org). Las mutaciones somáticas, los cambios en el número de copias del ADN (CNA), la expresión de ARNm y microARN (miARN), la metilación del ADN, la abundancia de proteínas y la abundancia de fosfoproteínas son solo algunos de los tipos de datos genómicos que se integran en cBioPortal²¹. Con cBioPortal, se puede llevar a cabo una amplia gama de estudios; Sin embargo, el mayor énfasis está en los diferentes análisis relacionados con las mutaciones y su visualización.
2. Seleccione el conjunto de datos Análisis pancanceroso de genomas completos en la subsección Estudios pancancerígenos de la sección Seleccionar estudios para visualización y análisis . A continuación, haga clic en el botón Consultar por gen .
3. Introduzca el ID del gen objetivo (TMEM200A) en el cuadro de consulta de Introducir genes. Haga clic en el botón Enviar consulta .
4. Haga clic en el botón Tipo de cáncer detallado en la parte superior de la página para obtener las mutaciones de TMEM200A en varios tipos de cáncer.

8. Herramienta Sangerbox 3.0

1. Vaya a la interfaz de la herramienta Sangerbox 3.0 .
   NOTA: La correlación de la expresión de TMEM200A con células inmunitarias, agentes inmunosupresores, factores inmunoestimulantes y moléculas MHC (complejo mayor de histocompatibilidad) en todos los cánceres se analizó mediante infiltración inmune CIBERSORT utilizando los datos de infiltración inmune pancancerígena en la herramienta Sangerbox 3.0²² (http://vip.sangerbox.com/).
2. En la barra de herramientas de la parte izquierda de la página, seleccione y haga clic en la pestaña Análisis Inmunocelular (CIBERSORT) del menú Análisis Pan-Cáncer .
3. Introduzca el ID del gen objetivo (TMEM200A) en el cuadro de consulta de Introducir genes. Haga clic en el botón Enviar .

9. Base de datos TISIDB

1. Vaya a la interfaz del sitio web de TISIDB .
   NOTA: Se empleó la base de datos TISIDB²³ (http://cis.hku.hk/TISIDB/) para examinar la correlación de la expresión de TMEM200A con células inmunitarias, agentes inmunosupresores, factores inmunoestimulantes y moléculas MHC en varios tipos de cáncer.
2. Introduzca el símbolo genético de destino (TMEM200A) en el cuadro de consulta de Introducir genes. Haga clic en el botón Enviar .
3. Haga clic en las secciones Linfocitos, Inmunomoduladores, Quimiocinas y Subtipo en la parte superior de la página. Descargue las imágenes relevantes en la parte inferior de la página.

10. La base de datos TIDE

1. Vaya a la interfaz del sitio web de TIDE .
   NOTA: La base de datos TIDE (http://tide.dfci.harvard.edu/) se utilizó para evaluar el potencial de TMEM200A como biomarcador para predecir la respuesta a la terapia de bloqueo de puntos de control inmunitario tumoral.
2. Ingrese la dirección de correo electrónico en la pantalla inicial para registrar la cuenta e iniciar sesión.
3. Busque la subsección Evaluación de biomarcadores en la parte superior de la página y haga clic en ella.
4. Introduzca el ID del gen objetivo (TMEM200A) en el cuadro de consulta de Introducir genes en la parte inferior de la página. A continuación, haga clic en el botón Enviar .
5. En la página, arrastre el ratón para deslizar la página hacia abajo y encontrar los resultados del análisis.

11. La base de datos CancerSEA

1. Vaya a la interfaz del sitio web de CancerSEA .
   NOTA: Utilizando datos de secuenciación de una sola célula, se investigaron las relaciones entre la expresión de TMEM200A y el estado funcional de diferentes células tumorales. Esto se hizo utilizando la base de datos CancerSEA²⁴ (http://biocc.hrbmu.edu.cn/CancerSEA/).
2. En la parte superior de la página, busque y haga clic en la pestaña Buscar .
3. Introduzca el ID del gen objetivo (TMEM200A) en el cuadro de consulta de Introducir genes. Haga clic en el botón Enviar .

12. La herramienta de red de centros unicelulares inmunes al tumor (TISCH)

1. Vaya a la interfaz del sitio web de la herramienta de red del centro de células individuales inmunitarias al tumor (TISCH).
   NOTA: La correlación entre los niveles de expresión de TMEM200A y las células cancerosas también se demostró mediante el uso de la herramienta de red de centros unicelulares inmunes al tumor (TISCH)²⁵.
2. Introduzca el ID del gen objetivo (TMEM200A) en el cuadro de consulta de Introducir genes. Haga clic en el botón Explorar .
3. En el menú Tipo de cáncer de esta página, seleccione y haga clic en el conjunto de datos Todos los cánceres . Luego, desplácese hacia abajo en la página y haga clic en el botón Buscar .

13. GeneMANIA

1. Vaya a la interfaz del sitio web de GeneMANIA .
   NOTA: La correlación entre TMEM200A y sus genes funcionalmente relevantes se predijo utilizando la estrategia de integración de la red de asociación múltiple de genes Website GeneMANIA (www.genemania.org)²⁶ para la construcción de redes de interacción gen-gen (GGI).
2. En el cuadro de búsqueda en la parte superior izquierda de la página, ingrese el ID del gen (TMEM200A) y haga clic en Herramientas de búsqueda.
   NOTA: Se utilizó la herramienta web GeneMANIA para encontrar 20 genes asociados con TMEM200A.

14. Análisis de enriquecimiento funcional

1. Guarde los identificadores de símbolos de los genes que se van a analizar para su enriquecimiento en formato de archivo txt.
2. Abra el código R (symbolidR) y copie y pegue la ruta donde se encuentra el archivo txt anterior en la línea donde se encuentra setwd en el código R.
3. Abra el software R y ejecute el código R modificado (symbolidR). Convierta los identificadores de símbolos de estos genes en entrezID a través de la "org. Hs.eg.db". Obtener el archivo id.txt .
4. Abra el código R (GOR y KEGGR) y copie y pegue la ruta donde se encuentra el archivo id.txt a la línea donde se encuentra setwd en el código R.
5. Abra el software R y ejecute el código R modificado (GOR y KEGGR). Para seguir este protocolo, analice estos genes para el enriquecimiento de GO y KEGG mediante los paquetes "clusterProfiler", "org. Hs.eg.db" y "enrichplot" y graficar los resultados del enriquecimiento utilizando el paquete "gglot2".

15. Análisis de las diferencias en la actividad génica

NOTA: TMEM200A puntuación en cada muestra de cáncer se calculó utilizando ssGSEA (análisis de enriquecimiento del conjunto de genes de una sola muestra)²⁷, y se realizó el análisis diferencial de la actividad de TMEM200A genes en tejidos cancerosos y sanos para varios cánceres.

1. Con base en los datos de secuenciación de ARN de 33 tipos de tumores descargados en el paso 1.7, descomprima todos los archivos descargados y colóquelos en una carpeta unificada.
2. Coloque el archivo merge.txt en la carpeta anterior.
   NOTA: Los datos en merge.txt archivo de BioWolf (www.biowolf.cn) contienen la expresión génica de todos los pacientes en todos los tumores en la base de datos del Atlas del Genoma del Cáncer (TCGA).
3. Abra el código R (ssGSEAR) y copie y pegue la ruta donde se encuentra la carpeta anterior en la línea donde se encuentra setwd en el código R.
4. Tome la línea donde está geneName en el código R (ssGSEAR) e ingrese el ID del gen (TMEM200A).
5. Abra el software R y ejecute el código R modificado (ssGSEAR). Obtenga el archivo de puntuación de la actividad de los genes: scores.txt.
   NOTA: Con el algoritmo ssGSEA, primero construimos un archivo de conjunto de genes basado en los coeficientes de correlación entre genes de acuerdo con los datos proporcionados en el archivo de merge.txt e identificamos los genes con una mayor correlación con el gen objetivo (TMEM200A) del archivo. Luego, los genes con mayor correlación se unifican como los genes activos de TMEM200A, y finalmente, obtenemos la puntuación de los genes activos en cada muestra.
6. Abra el código de R (scoreDiffR) y copie y pegue la ruta de acceso donde se encuentra el archivo scores.txt en la línea donde se encuentra setwd en el código de R.
7. Abra el software R, ejecute el código R modificado (scoreDiffR) y dibuje la imagen a través de los paquetes "plyr", "reshape2" y "ggpubr".

16. Correlación clinicopatológica y análisis pronóstico de supervivencia

1. Vaya a la interfaz del sitio web de UCSC Xena .
2. Haga clic en la pestaña Iniciar Xena .
3. Haga clic en la pestaña CONJUNTOS DE DATOS en la parte superior de la pantalla.
4. Coloque el cursor sobre la página y desplácese hacia abajo para encontrar la pestaña TCGA Pan-Cancer (PANCAN).
5. De las 129 cohortes y 1.571 conjuntos de datos de esta página, haga clic en la pestaña TCGA Pan-Cancer (PANCAN).
6. En el menú de fenotipos , seleccione y haga clic en la pestaña Datos clínicos seleccionados.
7. Desde el menú de descargas , haga clic en su enlace correspondiente.
   NOTA: Descargue los datos clínicos de 33 cánceres de la base de datos TCGA en el enlace anterior.
8. Descomprima el archivo de datos clínicos descargado y abra el archivo descomprimido en formato de archivo xls.
9. Organice y conserve los datos clínicos necesarios (estadio, edad, estadio patológico y estado del paciente) en el archivo, elimine los datos clínicos innecesarios restantes y guarde todo el archivo como un archivo en formato txt después de cambiarle el nombre a clínico.
10. En función de los singleGeneExp.txt obtenidos en el paso 1.9, coloque este archivo en la misma carpeta que el archivo de clinical.txt organizado.
11. Descomprima los datos clínicos descargados y coloque los archivos singleGeneExp.txt y clinical.txt en la misma carpeta que los archivos clínicos descomprimidos.
12. Abra el código de R (clinicalDiffR) y copie y pegue la ruta donde se encuentra la carpeta anterior en la línea donde se encuentra setwd en el código de R.
13. Abra el software R, ejecute el código R modificado (clinicalDiffR) y dibuje la imagen usando el paquete "ggpubr".
14. Vaya a la interfaz del sitio web de UCSC Xena .
15. Haga clic en la pestaña Iniciar Xena .
16. Haga clic en la pestaña CONJUNTOS DE DATOS en la parte superior de la pantalla.
17. De las 129 cohortes y 1.571 conjuntos de datos de esta página, haga clic en la pestaña para ver un total de 33 tipos de cáncer, como la leucemia mieloide aguda (LAML) GDC TCGA, el cáncer de corteza suprarrenal (ACC) y el cáncer de vías biliares (CHOL) y más.
18. En el menú de fenotipo , seleccione y haga clic en la pestaña de datos de supervivencia.
19. Desde el menú de descargas , haga clic en su enlace correspondiente.
20. Descomprima el archivo zip de datos de supervivencia de 33 tipos diferentes de cáncer en un solo archivo en la carpeta del escritorio de la computadora.
21. Coloque los datos de supervivencia descomprimidos en la misma carpeta que el archivo singleGeneExp.txt obtenido en el paso 1.9.
22. Abra el código R (preOSR) y copie y pegue la ruta donde se encuentra la carpeta anterior en la línea donde se encuentra setwd en el código R.
23. Abra el software R y ejecute el código R modificado (preOSR). Calcule a través del paquete "limma" para obtener un archivo de datos sobre la supervivencia del TMEM200A en pancáncer: expTime.txt.
24. Abra el código de R (OSR) y copie y pegue la ruta de acceso donde se encuentra el archivo expTime.txt en la línea donde se encuentra setwd en el código de R.
25. Abra el software R y ejecute el código R modificado (OSR). Realice un análisis de KM utilizando los paquetes "survival" y "survminer" en función de los datos del archivo expTime.txt y trace las curvas de supervivencia para TMEM200A en pancáncer.

17. Análisis de regresión de Cox univariante y multivariante con construcción de parcelas forestales

1. Abra el código R (COXR) y copie y pegue la ruta donde obtuvimos el archivo expTime.txt de 16.23 se encuentra en la línea donde se encuentra setwd en el código R.
2. Abra el software R y ejecute el código R modificado (COXR). Con base en los datos del archivo expTime.txt , realice análisis de regresión univariante de COX utilizando los paquetes "survival", "survminer" y "forestplot" para trazar una gráfica univariada de bosque de TMEM200A en diferentes tipos de cáncer.
3. Coloque el archivo expTime.txt del paso 16.23 y clinical.txt del paso 16.10 en la misma carpeta.
4. Abra el código R (multicoxR) y copie y pegue la ruta donde se encuentra la carpeta que contiene el archivo expTime.txt del paso 16.23 y clinical.txt archivo del paso 16.10 hasta la línea donde se encuentra setwd en el código R.
5. Abra el software R y ejecute el código R modificado (multicoxR). Realice un análisis de regresión de COX multivariante utilizando los paquetes "survival" y "survminer" para trazar una gráfica de bosque multivariante de TMEM200A en diferentes tipos de cáncer en función de los datos de los archivos de expTime.txt y clinical.txt .

18. Modelo pronóstico del cáncer gástrico basado en la expresión TMEM200A y las características clínicas

1. Coloque el archivo clinical.txt del paso 16.10 y el archivo expTime.txt del paso 16.23 en la misma carpeta.
2. Abra el código R (NomoR) y copie y pegue la ruta donde se encuentra el archivo txt anterior en la línea donde se encuentra setwd en el código R.
3. Abra el software R y ejecute el código R modificado (NomoR). Utilice los paquetes de software "survival", "regplot" y "rms" para los datos de expresión de TMEM200A en GC y datos clínicos para construir un modelo pronóstico que prediga la supervivencia del paciente.

19. Cultivo celular y transfección de siRNA de TMEM200A

NOTA: Las células humanas STAD HGC-27, las células SGC-7901 y las células epiteliales de la mucosa gástrica humana GES-1 se obtuvieron comercialmente (véase la Tabla de Materiales), se revivieron, se inocularon en un medio completo 1640 del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) (que contenía un 10% de suero fetal bovino neonatal y una mezcla de penicilina al 1%) y se cultivaron a 37 °C en un 5% de CO₂ incubadora de cultivos celulares. El medio de cultivo se cambió cada 2-3 días. Las células en buen estado de crecimiento se inocularon en placas de seis pocillos según (2-3) × 10⁵ células por pocillo.

1. En primer lugar, se toman tres tubos de microcentrífuga y se añaden 8 μL de reactivo de transfección (véase laT de materiales) y 200 μL de medio basal a cada tubo. A continuación, añade 4 μg de SiRNA1, SiRNA2 y SiRNA3 a cada tubo respectivamente.
   NOTA: Para TMEM200A derribo, se diseñó y compró siRNA (consulte la Tabla de materiales).
2. Mezcle bien la mezcla en los tres tubos de microcentrífuga y agréguela a cada uno de los tres pocillos de la placa de 6 pocillos. Agite suavemente el plato de 6 pocillos para distribuir la mezcla de manera uniforme. Etiquete los tres pocillos donde se agregó la mezcla como SiRNA-1, SiRNA-2 y SiRNA-3.
3. Cuando las células se hayan incubado durante 4-6 h, reemplace la mitad del medio en los tres subpocillos de la placa de 6 pocillos.
   NOTA: Cuando reemplace la mitad del medio completo, aspire la mitad del medio completo original y vuelva a llenarlo con la mitad del medio completo nuevo.
4. Veinticuatro a 48 h más tarde, utilizar células transfectadas TMEM200A con siRNA como grupo experimental y células no transfectadas como grupo de control negativo. Realizar la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR, ver sección 20) para evaluar el efecto de la transfección en las células.

20. Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real

1. Deseche el medio de cultivo celular en cada subgrupo y lave suavemente las células dos veces con 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
2. Aísle el ARN total utilizando un kit de aislamiento de ARN (consulte la Tabla de materiales).
3. Estimar la concentración de ARN y sintetizar ADNc con 1 μg de ARN utilizando un kit de síntesis de ADNc, siguiendo las instrucciones del fabricante.
4. Realice PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) en diluciones de ADNc de 10 veces en 10 μL de mezcla de reacción, incluidos cebadores directos e inversos específicos para humanos para GAPDH (para estandarización), TMEM200A (consulte la Tabla de materiales) y qPCR Master Mix, utilizando el sistema de ensayo de PCR en tiempo real.
   NOTA: Realice cada experimento por triplicado.
5. Utilice las siguientes condiciones de reacción de qPCR: inicialización, 95 °C durante 3 min; desnaturalización, 95 °C durante 10 s; recocido, 60 °C durante 30 s; y extensión, 80 °C durante 10 s; Repita la desnaturalización, el recocido y la extensión 40x. Determinar la expresión relativa de cada gen mediante la técnica ^{2-ΔΔCt 28}.
6. Repita los experimentos al menos tres veces para obtener triplicados biológicos.

21. Detección de Western blot de la expresión de proteínas relevantes

1. Deseche el medio de cultivo celular en cada subgrupo y lave suavemente las células con 2 x 1 ml de PBS.
2. Enfríe las placas de 6 pocillos que contienen las células en hielo y agregue 150 μL de tampón de lisis de ensayo de precipitación inmune por radio (RIPA) preenfriado (150 mM de NaCl, Triton X-100 al 0,1 %, desoxicolato de sodio al 0,5 %, SDS al 0,1 %, pH 8,0 de Tris-HCl de 50 mM y cóctel de inhibidores de la proteasa recién añadido). Deje que la lisis continúe con hielo durante 10 minutos.
3. Utilizando un raspador de celdas de plástico, retire las celdas adheridas del plato y transfiera delicadamente la solución celular a un tubo de microcentrífuga que se haya enfriado previamente.
4. Centrifugar el lisado celular durante 10 min a 1,5 × 10⁴ g a 4 °C. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
5. Utilice un kit de ensayo de proteínas BCA para determinar el contenido de proteínas de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
6. Cargue 30 g de proteína de cada muestra en un gel de electroforesis en gel de electroforesis en gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sodio al 10% (SDS-PAGE) y deje funcionar a 80 V durante 0,5 h seguido de 1,5 h a 120 V.
7. Transfiera las proteínas del gel a una membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF) de 45 μm a un voltaje de 300 mA durante 1-1,5 h.
8. Después de colocar la membrana de PVDF en un agitador y agitarla durante 3 x 5 minutos, agregue solución salina tamponada con Tris con Tween 20 (TBST, 20 mM de Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM de NaCl y 0,1% de Tween 20) en el recipiente apropiado con el lado de la proteína (lado del gel) hacia arriba.
9. Coloque la membrana en el tampón de bloqueo (consulte la Tabla de materiales) e incube durante 0,5 h a temperatura ambiente.
10. Lave la membrana con TBST durante 3 x 10 min.
11. Incubar la membrana con anticuerpos primarios contra fosfo-AKT (p-AKT; 1:1.000), AKT total 1:1.000, E-cadherina (E-ca; 1:1.000), N-cadherina (N-ca; 1:1.000), Vimentina 1:1.000, caracol 1:1.000, TMEM200A 1:1.000, gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH; 1:1.000), durante la noche a 4 °C.
12. Lavar la membrana durante 3 x 10 min e incubar la membrana con un anticuerpo secundario de conejo o ratón (1:5.000) durante 1 h a temperatura ambiente.
13. Incubar la membrana de PVDF con sustrato ECL durante 30 s y detectar la señal mediante un sistema de imágenes.

22. Ensayo CCK-8

1. Siembra de células humanas STAD HGC-27 en buenas condiciones de crecimiento en placas de 96 pocillos.
2. Cuando la densidad celular alcance el 60-70%, transfecte las células con TMEM200A siRNA (como en el paso 19.3).
3. Siembre las células transfectadas en placas de 96 pocillos a una densidad celular de 5 × 10 ³/pocillo (cuente las células viables utilizando un contador de células), divididas en grupos NC y TMEM200A siRNA (con tres pocillos replicados en cada grupo) e incubadas a 37 °C.
4. Añadir el reactivo CCK-8 después de 0, 24, 48, 72 y 96 h e incubar a 37 °C durante 2 h. Mida la absorbancia (450 nm) utilizando una etiquetadora enzimática multifuncional.

Resultados

Expresión de TMEM200A en varios tipos de cáncer
Como se ilustra en la Figura 1, primero analizamos los niveles de expresión diferencial de TMEM200A en varios cánceres a través de diferentes bases de datos. TMEM200A expresión se elevó en el colangiocarcinoma (CHOL), el carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSC), el carcinoma renal de células claras (KIRC), el carcinoma de células papilares renales (KIRP),...

Discusión

TMEM200A pertenece a una familia de TMEMs que es esencial para que las células cancerosas proliferen³⁸. La expresión variable de TMEM200A en diferentes neoplasias malignas ha recibido menos atención y falta una investigación exhaustiva del pancáncer. Sin embargo, la evidencia continúa acumulándose, mostrando que la familia de proteínas transmembrana TMEM puede ser importante para mantener las células cancerosas malignas a través de interacciones con varias proteínas, p...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-AKT antibody	Proteintech Group, Inc	60203-2-Ig
Anti-E-cadherin antibody	Proteintech Group, Inc	20874-1-AP
anti-glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) antibody	Proteintech Group, Inc	10494-1-AP
Anti-N-cadherin antibody	Proteintech Group, Inc	22018-1-AP
Anti-P-AKT antibody	Proteintech Group, Inc	66444-1-Ig
Anti-snail antibody	Proteintech Group, Inc	13099-1-AP
Anti-Vimentin antibody	Proteintech Group, Inc	10366-1-AP
AxyPrepMultisourceTotalRNAMini- prep Kit	Suzhou Youyi Landi Biotechnology Co., Ltd	UEL-UE-MN-MS-RNA-50G
BCA Protein Assay Kit	Epizyme Biotech	ZJ101L
CCK-8 reagent	MedChemExpress	HY-K0301-500T
Fetal bovine serum (FBS)	CYAGEN BIOSCIENCES (GUANGZHOU) INC	FBSSR-01021
GAPDH primer	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.		Forward primer (5’-3’): TGACATCAAGAAGGTG GTGAAGCAG; Reverse primer (5’-3’): GTGTCGCTGTTGAAG TCAGAGGAG
HighGene plus Transfection reagent	ABclonal	RM09014P
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse lgG (H+L)	Proteintech Group, Inc	SA00001-1
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit lgG (H+L)	Proteintech Group, Inc	SA00001-2
Human gastric mucosal epithelial GES-1 cells	Guangzhou Cellcook Biotech Co.,Ltd.
Human STAD HGC-27 cells	Procell Life Science&Technology Co.,Ltd
Human STAD SGC-7901 cells	Procell Life Science&Technology Co.,Ltd
MonAmp SYBR Green qPCR Mix (None ROX)	Mona (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd	MQ10101S
MonScript RTIII All-in-One Mix with dsDNase	Mona (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd	MR05101M
Omni-ECL Femto Light Chemiluminescence Kit	Epizyme Biotech	SQ201
PAGE Gel Fast Preparationb Kit	Epizyme Biotech	PG111
Penicillin-streptomycin (Pen-Strep)	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd	P1400-100
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane	Merck KGaA	IPVH00010-1
Protein Free Rapid Blocking Buffer	Epizyme Biotech	PS108P
RIPA lysis solution	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd	R0010
RPMI 1640 complete medium	Thermo Fisher Scientific	C11875500BT
Skimmed milk	Campina: Elk
TBST buffer solution	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd	T1082
The protein loading buffer	Epizyme Biotech	LT101S
TMEM200A knockdown plasmid	MiaoLing Plasmid
TMEM200A primer	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.		Forward primer (5’-3’): AAGGCGGTGTGGTGGTTCG; Reverse primer (5’-3’): GATTTTGGTCTCTTTGTCACGGTT
TMEM200A SiRNA1	MiaoLing Plasmid		Forward primer (5’-3’): ACAACTGATGATAAGACCAG; Reverse primer (5’-3’): TGTTGACTACTATTCTGGTC
TMEM200A SiRNA2	MiaoLing Plasmid		Forward primer (5’-3’): CGTGTGAATGTCAATGACTG; Reverse primer (5’-3’): GCACACTTACAGTTACTGAC
TMEM200A SiRNA3	MiaoLing Plasmid		Forward primer (5’-3’): ACAACCACAACATCTGCCCG; Reverse primer (5’-3’): TGTTGGTGTTGTAGACGGGC
Transmembrane protein 200A Antibody	Proteintech Group, Inc	48081-1
Equipment
CO2 cell culture incubator	Haier Group	PYXE-80IR
Electrophoresis instrument	Bio-RAD
Fluorescence quantitative PCR instrument	Bio-RAD
Gel Imaging System (Tanon 5200)	Tanon Science & Technology Co., Ltd	LAB-0002-0007-SHTN
Multifunctional Enzyme Labeler	Berthold