Pan-Kanser Biyobelirteci Olarak TMEM200A'in Multiomik Analizi

Özet

Burada, kanserde TMEM200A biyolojik fonksiyonlarını incelemek için çoklu biyoinformatik araçların birleştirildiği bir protokol sunulmaktadır. Ek olarak, biyoinformatik tahminleri deneysel olarak da doğruluyoruz.

Özet

TMEM200A transmembran proteinin insan kanserleri ve immün infiltrasyon ile ilişkili olduğu bilinmektedir. Burada, yaygın kanserlerde TMEM200A fonksiyonunu multiomik analiz ile değerlendirdik ve sonuçları doğrulamak için mide hücrelerinin in vitro hücre kültürlerini kullandık. Çeşitli insan kanser türlerinde TMEM200A ekspresyonu, UCSC Xena veri tabanından alınan RNA-seq verileri kullanılarak değerlendirildi. Biyoinformatik analiz, TMEM200A'in tanısal ve prognostik bir biyobelirteç olarak potansiyel bir rolünü ortaya koymuştur.

Normal mide ve kanser hücre hatlarının kültürleri büyütüldü ve TMEM200A yıkıldı. TMEM200A ekspresyon düzeyleri kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu ve western blotlama kullanılarak ölçüldü. Daha sonra mide kanseri (GC) hücrelerinin malign davranışı ve tümör oluşumunda TMEM200A rollerini belirlemek için in vitro fonksiyon kaybı çalışmaları kullanıldı. Yıkımın GC'de epitelyal-mezenkimal geçiş (EMT) ve PI3K/AKT sinyal yolu üzerindeki etkisini değerlendirmek için Western blotları kullanıldı. Biyoinformatik analiz, TMEM200A GC'de yüksek düzeyde eksprese edildiğini göstermiştir.

GC hücrelerinin proliferasyonu, vimentin, N-kaderin ve Snai proteinlerini de azaltan ve AKT fosforilasyonunu inhibe eden TMEM200A yıkımı ile inhibe edildi. PI3K/AKT sinyal yolunun, GC gelişiminin TMEM200A aracılı düzenlenmesinde de rol oynadığı görülmüştür. Burada sunulan sonuçlar , TMEM200A'in EMT'yi etkileyerek tümör mikroçevresini düzenlediğini göstermektedir. TMEM200A ayrıca PI3K / AKT sinyali yoluyla EMT'yi etkileyebilir, böylece tümör mikroçevresini etkileyebilir. Bu nedenle, pan-kanserlerde, özellikle GC'de, TMEM200A potansiyel bir biyobelirteç ve onkogen olabilir.

Giriş

Kanser, dünya çapında yüksek morbidite ve mortalite oranları nedeniyle^{küresel olarak insan sağlığını tehlikeye atan kalıcı}bir halk sağlığı sorunu olarak ortaya çıkmıştır^{1 ve} topluma ağır bir mali ve tıbbi yük oluşturmaktadır 2. Kanser belirteçlerinin^{keşfi sayesinde} son yıllarda kanser tedavisinde önemli ilerlemeler kaydedilmiştir 3 ve araştırmacılar kanseri tedavi etmek için yeni tanı yöntemleri ve yeni ilaçlar geliştirmiştir. Bununla birlikte, kanserli bazı hastalar, ilaç direnci, ilaçların yan etkileri ve kimyasal duyarlılık gibi faktörler nedeniyle hala kötü prognoza sahiptir^4....

Protokol

1. Kanser Genom Atlası (TCGA) veritabanı

NOT: Kanser Genom Atlası (TCGA) veri tabanı, farklı tümör dokularındaki genlerin dizileme verilerini içerir¹⁴. Milyonda parça başına TMEM200A transkript (TPM) formatlarının incelenmesi için TCGA'daki RNA-seq verileri, UCSC Xena web sitesinden¹⁵ (https://xenabrowser. net/datapages/) çıkarıldı ve log2, örnekler arasındaki ifadeleri karşılaştırmak için dönüştürüldü.

1. UCSC Xena web sitesi arayüzüne gidin.
2. Xena'yı Başlat sekmesine tıklayın.
....

Tartışmalar

TMEM200A , kanser hücrelerinin çoğalması için gerekli olan bir TMEM ailesine aittir³⁸. Farklı malignitelerde TMEM200A'nin değişken ekspresyonu daha az dikkat çekmiştir ve kapsamlı bir pan-kanser araştırması eksiktir. Bununla birlikte, TMEM transmembran protein ailesinin, çeşitli proteinlerle etkileşimler yoluyla kanser hücrelerini kötü huylu tutmada önemli olabileceğini gösteren kanıtlar birikmeye devam ediyor, örneğin, TMEM16A Ca²⁺ ile aktive.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-AKT antibody	Proteintech Group, Inc	60203-2-Ig
Anti-E-cadherin antibody	Proteintech Group, Inc	20874-1-AP
anti-glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) antibody	Proteintech Group, Inc	10494-1-AP
Anti-N-cadherin antibody	Proteintech Group, Inc	22018-1-AP
Anti-P-AKT antibody	Proteintech Group, Inc	66444-1-Ig
Anti-snail antibody	Proteintech Group, Inc	13099-1-AP
Anti-Vimentin antibody	Proteintech Group, Inc	10366-1-AP
AxyPrepMultisourceTotalRNAMini- prep Kit	Suzhou Youyi Landi Biotechnology Co., Ltd	UEL-UE-MN-MS-RNA-50G
BCA Protein Assay Kit	Epizyme Biotech	ZJ101L
CCK-8 reagent	MedChemExpress	HY-K0301-500T
Fetal bovine serum (FBS)	CYAGEN BIOSCIENCES (GUANGZHOU) INC	FBSSR-01021
GAPDH primer	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.		Forward primer (5’-3’): TGACATCAAGAAGGTG GTGAAGCAG; Reverse primer (5’-3’): GTGTCGCTGTTGAAG TCAGAGGAG
HighGene plus Transfection reagent	ABclonal	RM09014P
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse lgG (H+L)	Proteintech Group, Inc	SA00001-1
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit lgG (H+L)	Proteintech Group, Inc	SA00001-2
Human gastric mucosal epithelial GES-1 cells	Guangzhou Cellcook Biotech Co.,Ltd.
Human STAD HGC-27 cells	Procell Life Science&Technology Co.,Ltd
Human STAD SGC-7901 cells	Procell Life Science&Technology Co.,Ltd
MonAmp SYBR Green qPCR Mix (None ROX)	Mona (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd	MQ10101S
MonScript RTIII All-in-One Mix with dsDNase	Mona (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd	MR05101M
Omni-ECL Femto Light Chemiluminescence Kit	Epizyme Biotech	SQ201
PAGE Gel Fast Preparationb Kit	Epizyme Biotech	PG111
Penicillin-streptomycin (Pen-Strep)	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd	P1400-100
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane	Merck KGaA	IPVH00010-1
Protein Free Rapid Blocking Buffer	Epizyme Biotech	PS108P
RIPA lysis solution	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd	R0010
RPMI 1640 complete medium	Thermo Fisher Scientific	C11875500BT
Skimmed milk	Campina: Elk
TBST buffer solution	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd	T1082
The protein loading buffer	Epizyme Biotech	LT101S
TMEM200A knockdown plasmid	MiaoLing Plasmid
TMEM200A primer	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.		Forward primer (5’-3’): AAGGCGGTGTGGTGGTTCG; Reverse primer (5’-3’): GATTTTGGTCTCTTTGTCACGGTT
TMEM200A SiRNA1	MiaoLing Plasmid		Forward primer (5’-3’): ACAACTGATGATAAGACCAG; Reverse primer (5’-3’): TGTTGACTACTATTCTGGTC
TMEM200A SiRNA2	MiaoLing Plasmid		Forward primer (5’-3’): CGTGTGAATGTCAATGACTG; Reverse primer (5’-3’): GCACACTTACAGTTACTGAC
TMEM200A SiRNA3	MiaoLing Plasmid		Forward primer (5’-3’): ACAACCACAACATCTGCCCG; Reverse primer (5’-3’): TGTTGGTGTTGTAGACGGGC
Transmembrane protein 200A Antibody	Proteintech Group, Inc	48081-1
Equipment
CO2 cell culture incubator	Haier Group	PYXE-80IR
Electrophoresis instrument	Bio-RAD
Fluorescence quantitative PCR instrument	Bio-RAD
Gel Imaging System (Tanon 5200)	Tanon Science & Technology Co., Ltd	LAB-0002-0007-SHTN
Multifunctional Enzyme Labeler	Berthold