汎がんバイオマーカーとしての TMEM200A のマルチオミクス解析

要約

ここでは、複数のバイオインフォマティクスツールを組み合わせて、がんにおける TMEM200A の生物学的機能を研究するプロトコルを紹介します。さらに、バイオインフォマティクスの予測を実験的に検証します。

要約

膜貫通型タンパク質 TMEM200Aは、ヒトのがんや免疫浸潤に関与することが知られています。ここでは、一般的ながんにおける TMEM200A の機能をマルチオミクス解析により評価し、胃細胞の in vitro 細胞培養を用いて検証しました。いくつかのヒトがんにおける TMEM200A の発現は、UCSC XenaデータベースのRNA-seqデータを用いて評価された。バイオインフォマティクス解析により、診断および予後バイオマーカーとしての TMEM200A の潜在的な役割が明らかになりました。

正常な胃細胞株および癌細胞株の培養物を増殖させ、 TMEM200A ノックダウンした。 TMEM200A の発現レベルは、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応およびウェスタンブロッティングを用いて測定した。次に、 in vitro 機能喪失試験を使用して、胃がん(GC)細胞の悪性挙動および腫瘍形成における TMEM200A の役割を決定しました。ウェスタンブロットを使用して、GCの上皮間葉転換(EMT)およびPI3K/AKTシグナル伝達経路に対するノックダウンの影響を評価しました。バイオインフォマティクス解析により 、TMEM200A はGCで高レベルで発現していることが示されました。

GC細胞の増殖は TMEM200A ノックダウンによって阻害され、ビメンチン、N-カドヘリン、およびSnaiタンパク質も減少し、AKTリン酸化が阻害されました。PI3K/AKTシグナル伝達経路は、 GC発生のTMEM200Aを介した制御にも関与しているようである。ここで提示された結果は 、TMEM200A がEMTに影響を与えることによって腫瘍微小環境を調節していることを示唆しています。 TMEM200A は、PI3K/AKTシグナル伝達を介してEMTにも影響を与え、腫瘍微小環境に影響を与える可能性があります。したがって、汎がん、特にGCでは、 TMEM200A 潜在的なバイオマーカーおよびがん遺伝子である可能性があります。

概要

がんは、世界的に高い罹患率と^{死亡率により、}世界的に人々の健康を危険にさらす永続的な公衆衛生問題として浮上しており1、社会に大きな経済的および医学的負担をもたらしています²。近年、がんマーカー^の発見3により、がん治療は大きく進歩し、研究者はがんを治療するための新しい診断法や新薬を開発しています。しかし、がん患者の中には、薬剤耐性、薬剤の副作用、化学物質過敏症などの要因により、依然として予後不良な患者も^{います4。}したがって、早期がんのスクリーニングと治療のための新しいバイオマーカーを特定することが急務となっています⁵。

膜タンパク質は、細胞や細胞小器官膜に結合して統合できるタンパク質です⁶。これらは、膜への結合の強さとその位置に応じて、脂質アンカータンパク質、内在性タンパク質、および末梢膜タンパク質の3つのカテゴリに分類できます^7,8。膜貫通型(TMEM)タンパク質は、少なくとも1つの膜貫通セグメント9からなる内在性膜タンパク質であり、このセグメント

プロトコル

1. Cancer Genome Atlas(TCGA)データベース

注: Cancer Genome Atlas(TCGA) データベースには、さまざまな腫瘍組織における遺伝子の配列決定データが含まれています¹⁴。100万分の1(TPM)フォーマット TMEM200A 転写産物の研究のためのTCGAのRNA-seqデータを UCSC Xena のWebサイト¹⁵ (https://xenabrowser. net/datapages/)から抽出し、サンプル間の発現を比較するためにlog2を変換しました。

1. UCSC Xena の Web サイト インターフェイスに移動します。
2. [ Xenaの起動 ]タブをクリックします。
3. 画面上部の [DATA SETS ] タブをクリックします。
4. このページの 129 のコホートと 1,571 のデータセットから、 GDC TCGA 急性骨髄性白血病 (LAML)、GDC TCGA 副腎皮質がん (ACC)、GDC TCGA 胆管がん....

ディスカッション

TMEM200A 、がん細胞の増殖に不可欠なTMEMファミリーに属しています³⁸。異なる悪性腫瘍における TMEM200A の発現のばらつきはあまり注目されておらず、徹底的な汎がん調査は行われていない。しかし、TMEM膜貫通タンパク質ファミリーは、いくつかのタンパク質との相互作用を通じてがん細胞を悪性に保つのに重要である可能性があることを示す証拠が蓄積され続?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-AKT antibody	Proteintech Group, Inc	60203-2-Ig
Anti-E-cadherin antibody	Proteintech Group, Inc	20874-1-AP
anti-glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) antibody	Proteintech Group, Inc	10494-1-AP
Anti-N-cadherin antibody	Proteintech Group, Inc	22018-1-AP
Anti-P-AKT antibody	Proteintech Group, Inc	66444-1-Ig
Anti-snail antibody	Proteintech Group, Inc	13099-1-AP
Anti-Vimentin antibody	Proteintech Group, Inc	10366-1-AP
AxyPrepMultisourceTotalRNAMini- prep Kit	Suzhou Youyi Landi Biotechnology Co., Ltd	UEL-UE-MN-MS-RNA-50G
BCA Protein Assay Kit	Epizyme Biotech	ZJ101L
CCK-8 reagent	MedChemExpress	HY-K0301-500T
Fetal bovine serum (FBS)	CYAGEN BIOSCIENCES (GUANGZHOU) INC	FBSSR-01021
GAPDH primer	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.		Forward primer (5’-3’): TGACATCAAGAAGGTG GTGAAGCAG; Reverse primer (5’-3’): GTGTCGCTGTTGAAG TCAGAGGAG
HighGene plus Transfection reagent	ABclonal	RM09014P
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse lgG (H+L)	Proteintech Group, Inc	SA00001-1
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit lgG (H+L)	Proteintech Group, Inc	SA00001-2
Human gastric mucosal epithelial GES-1 cells	Guangzhou Cellcook Biotech Co.,Ltd.
Human STAD HGC-27 cells	Procell Life Science&Technology Co.,Ltd
Human STAD SGC-7901 cells	Procell Life Science&Technology Co.,Ltd
MonAmp SYBR Green qPCR Mix (None ROX)	Mona (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd	MQ10101S
MonScript RTIII All-in-One Mix with dsDNase	Mona (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd	MR05101M
Omni-ECL Femto Light Chemiluminescence Kit	Epizyme Biotech	SQ201
PAGE Gel Fast Preparationb Kit	Epizyme Biotech	PG111
Penicillin-streptomycin (Pen-Strep)	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd	P1400-100
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane	Merck KGaA	IPVH00010-1
Protein Free Rapid Blocking Buffer	Epizyme Biotech	PS108P
RIPA lysis solution	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd	R0010
RPMI 1640 complete medium	Thermo Fisher Scientific	C11875500BT
Skimmed milk	Campina: Elk
TBST buffer solution	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd	T1082
The protein loading buffer	Epizyme Biotech	LT101S
TMEM200A knockdown plasmid	MiaoLing Plasmid
TMEM200A primer	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.		Forward primer (5’-3’): AAGGCGGTGTGGTGGTTCG; Reverse primer (5’-3’): GATTTTGGTCTCTTTGTCACGGTT
TMEM200A SiRNA1	MiaoLing Plasmid		Forward primer (5’-3’): ACAACTGATGATAAGACCAG; Reverse primer (5’-3’): TGTTGACTACTATTCTGGTC
TMEM200A SiRNA2	MiaoLing Plasmid		Forward primer (5’-3’): CGTGTGAATGTCAATGACTG; Reverse primer (5’-3’): GCACACTTACAGTTACTGAC
TMEM200A SiRNA3	MiaoLing Plasmid		Forward primer (5’-3’): ACAACCACAACATCTGCCCG; Reverse primer (5’-3’): TGTTGGTGTTGTAGACGGGC
Transmembrane protein 200A Antibody	Proteintech Group, Inc	48081-1
Equipment
CO2 cell culture incubator	Haier Group	PYXE-80IR
Electrophoresis instrument	Bio-RAD
Fluorescence quantitative PCR instrument	Bio-RAD
Gel Imaging System (Tanon 5200)	Tanon Science & Technology Co., Ltd	LAB-0002-0007-SHTN
Multifunctional Enzyme Labeler	Berthold