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要約

ここでは、複数のバイオインフォマティクスツールを組み合わせて、がんにおける TMEM200A の生物学的機能を研究するプロトコルを紹介します。さらに、バイオインフォマティクスの予測を実験的に検証します。

要約

膜貫通型タンパク質 TMEM200Aは、ヒトのがんや免疫浸潤に関与することが知られています。ここでは、一般的ながんにおける TMEM200A の機能をマルチオミクス解析により評価し、胃細胞の in vitro 細胞培養を用いて検証しました。いくつかのヒトがんにおける TMEM200A の発現は、UCSC XenaデータベースのRNA-seqデータを用いて評価された。バイオインフォマティクス解析により、診断および予後バイオマーカーとしての TMEM200A の潜在的な役割が明らかになりました。

正常な胃細胞株および癌細胞株の培養物を増殖させ、 TMEM200A ノックダウンした。 TMEM200A の発現レベルは、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応およびウェスタンブロッティングを用いて測定した。次に、 in vitro 機能喪失試験を使用して、胃がん(GC)細胞の悪性挙動および腫瘍形成における TMEM200A の役割を決定しました。ウェスタンブロットを使用して、GCの上皮間葉転換(EMT)およびPI3K/AKTシグナル伝達経路に対するノックダウンの影響を評価しました。バイオインフォマティクス解析により 、TMEM200A はGCで高レベルで発現していることが示されました。

GC細胞の増殖は TMEM200A ノックダウンによって阻害され、ビメンチン、N-カドヘリン、およびSnaiタンパク質も減少し、AKTリン酸化が阻害されました。PI3K/AKTシグナル伝達経路は、 GC発生のTMEM200Aを介した制御にも関与しているようである。ここで提示された結果は 、TMEM200A がEMTに影響を与えることによって腫瘍微小環境を調節していることを示唆しています。 TMEM200A は、PI3K/AKTシグナル伝達を介してEMTにも影響を与え、腫瘍微小環境に影響を与える可能性があります。したがって、汎がん、特にGCでは、 TMEM200A 潜在的なバイオマーカーおよびがん遺伝子である可能性があります。

概要

がんは、世界的に高い罹患率と死亡率により、世界的に人々の健康を危険にさらす永続的な公衆衛生問題として浮上しており1、社会に大きな経済的および医学的負担をもたらしています2。近年、がんマーカーの発見3により、がん治療は大きく進歩し、研究者はがんを治療するための新しい診断法や新薬を開発しています。しかし、がん患者の中には、薬剤耐性、薬剤の副作用、化学物質過敏症などの要因により、依然として予後不良な患者もいます4。したがって、早期がんのスクリーニングと治療のための新しいバイオマーカーを特定することが急務となっています5。

膜タンパク質は、細胞や細胞小器官膜に結合して統合できるタンパク質です6。これらは、膜への結合の強さとその位置に応じて、脂質アンカータンパク質、内在性タンパク質、および末梢膜タンパク質の3つのカテゴリに分類できます7,8。膜貫通型(TMEM)タンパク質は、少なくとも1つの膜貫通セグメント9からなる内在性膜タンパク質であり、このセグメントは生体膜を完全または部分的に通過する。

TMEMファミリーに属するタンパク質の作用機序はよくわかっていないが、これらのタンパク質はいくつかの種類のがんに関与していることが知られている10。いくつかのTMEMタンパク質は、遊走性、増殖性、および侵襲性の表現型と関連しており、それらの発現はしばしば患者の予後と関連しています11。そのため、TMEMファミリーのメンバーが研究対象となっています。TMEMに関する既存の報告を包括的に検討したところ、TMEMは主に細胞間および細胞内のシグナル伝達12、免疫関連疾患、および腫瘍形成10に関連していることが明らかになりました。多くのTMEMは、細胞膜のイオンチャネル、シグナル伝達経路の活性化、細胞走化性、接着、アポトーシス、オートファジーの媒介など、重要な生理学的機能も備えています10。したがって、TMEMタンパク質は腫瘍の検出と治療における重要な予後マーカーである可能性があるという仮説を立てました。

胃 がん(GC)ではTMEM200A発現が有意に上昇します。染色体6q23.1上に8つのエクソンと77.536 kbの全長を有する TMEM200A13の発現が高いことは、GC症例の全生存(OS)の予後不良と関連している。しかし、その発現の変化は、腫瘍学研究でほとんど報告されていません。本稿では、公開されているさまざまなデータセットを用いて、さまざまながん研究における治療標的および腫瘍診断マーカーとしての TMEM200A の有用性を比較・分析する。UCSC XenaおよびTCGAデータベースのRNA-seqデータ、リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)、ウェスタンブロッティングを用いて、汎がん診断および予後バイオマーカーとしての TMEM200A の有効性、およびさまざまなヒトがん種における発現レベルを評価しました。

TMEM200A発現レベルが突然変異率、調節プロセス、腫瘍の診断と予後、免疫浸潤、および免疫療法に及ぼす影響を、計算ツールとデータセットのウェブサイトを組み合わせてさらに調査した。CBioPortalおよびCatalog of Somatic Mutations in Cancer Cells(COSMIC)データベースを使用して、TMEM200Aの変異を調べました。SangerboxとTISIDBのウェブサイトは、TMEM200Aが免疫浸潤にどのように影響するかを理解するために利用されました。Tumor Immune Single Cell Center(TISCH)のオンラインツールとCancerSEAデータベースを使用して、TMEM200Aの機能を調査しました。最後に、GC細胞の悪性挙動および腫瘍発生機能に対するTMEM200Aの影響を評価するために、in vitroアッセイで機能喪失実験を実施しました。さらに、ウェスタンブロッティングを実施して、ノックダウンTMEM200A PI3K/AKTシグナル伝達経路およびGCの上皮間葉転換(EMT)にどのように影響するかを評価しました。

プロトコル

1. Cancer Genome Atlas(TCGA)データベース

注: Cancer Genome Atlas(TCGA) データベースには、さまざまな腫瘍組織における遺伝子の配列決定データが含まれています14。100万分の1(TPM)フォーマット TMEM200A 転写産物の研究のためのTCGAのRNA-seqデータを UCSC Xena のWebサイト15 (https://xenabrowser. net/datapages/)から抽出し、サンプル間の発現を比較するためにlog2を変換しました。

  1. UCSC Xena の Web サイト インターフェイスに移動します。
  2. [ Xenaの起動 ]タブをクリックします。
  3. 画面上部の [DATA SETS ] タブをクリックします。
  4. このページの 129 のコホートと 1,571 のデータセットから、 GDC TCGA 急性骨髄性白血病 (LAML)、GDC TCGA 副腎皮質がん (ACC)、GDC TCGA 胆管がん (CHOL) など、合計 33 のがんのタブをクリックします。
  5. gene expression RNAseq メニューから HTSeq - FPKM GDC Hub タブを選択してクリックします。
    注: HTSeq - FPKM GDC ハブ は、同意によって修正されたデータを表します。
  6. ダウンロードメニューから、対応するリンクをクリックします。
    注:上記の方法により、33種類のがんのRNA-Seqデータがダウンロードされました。
  7. 33種類のがんのRNA-seqデータのzipアーカイブを、コンピューターのデスクトップフォルダーにある1つのファイルに解凍します。
  8. 解凍したtxtファイルを同じフォルダに統合し、Perlスクリプトをこのフォルダに配置します。
  9. Perlソフトウェアを開き、フォルダのパスをコピーして、マウスカーソルが置かれているPerlソフトウェアに貼り付け、Enterキーを押し、Perlコードの名前と遺伝子の名前(TMEM200A)を入力し、Enterキーを押して新しいtxtファイルを取得します(singleGeneExp.txt)。
    注:この新しいtxtファイル(singleGeneExp.txt)には、さまざまな患者の33の癌における TMEM200A の遺伝子発現が含まれています。
  10. R コード (diffR) を開き、 singleGeneExp.txt ファイルが配置されているパスをコピーして、R コードの setwd がある行に貼り付けます。
  11. Rソフトウェアを開き、変更したRコード(diffR)を実行し、「ggpubr」パッケージを使用して画像を描画します。

2. TIMER2.0データベース

  1. TIMER2.0 (http://timer.cistrome.org) database 16 の Web サイト インターフェイスに移動します。
  2. [Cancer Exploration] タブをクリックします。
  3. 検索ボックスに遺伝子ID(TMEM200A)を入力し、[ 送信 ]タブをクリックして、さまざまな種類の腫瘍における TMEM200A の発現差画像を取得します。

3. ヒトプロテインアトラス(HPA)

  1. Human Protein Atlas (HPA) (www.proteinatlas.org) 17ウェブインターフェースに移動します。
  2. 検索ボックスに「ID(TMEM200A)」と入力し、[検索]ボタンをクリックします。TISSUE sub-atlasを選択します。
  3. ページにカーソルを合わせ、下にスクロールして[ Protein Expression Overview ]タブを見つけます。
    注: タンパク質発現の概要 セクションには、人体の45の臓器における TMEM200A のタンパク質発現レベルが表示されます。

4. HumanMethylation450 Illumina Infinium DNAメチル化プラットフォームアレイ

注: HumanMethylation450 Illumina Infinium DNAメチル化プラットフォームアレイ を使用して、メチル化に関するデータを収集しました。 TMEM200A DNAメチル化レベルは、 SMART (http://www.bioinfo-zs.com/smartapp/)データベース18を用いて評価できた。

  1. SMARTにアクセスします webサイトインターフェイス。
  2. 検索ボックスに遺伝子ID(TMEM200A)を入力して、染色体内のTMEM200A分布と、さまざまな種類の悪性腫瘍におけるTMEM200Aのメチル化レベルを取得します。
  3. ページを下にスクロールしてClick to check CpG-aggregated methylation メニューを表示し、[ Plot ]ボタンをクリックします。ページの下部にある [ Download Figure ] ボタンを見つけてクリックします。図をダウンロードしてください。

5. UALCANデータベース

  1. UALCANに移動します webサイトインターフェイス。
    注:さまざまな悪性腫瘍におけるTMEM200Aプロモーターメチル化レベルの箱ひげ図は、UALCANデータベース(http://ualcan.path.uab.edu/analysisprot.html)19を通じて生成されました
  2. ページ上部の TCGA ボタンをクリックします。
  3. 画面の Gene ID 入力ボックスに TMEM200A を入力します。 TCGAデータセット メニューで、下にスクロールして、照会するがんの種類を選択します。
  4. [探索]ボタンをクリックした後、[分析用リンク]メニューのサブグループ分析[メチル化]をクリックして、この腫瘍のメチル化結果を取得します。
    注:この方法により、 UALCAN データベース内の22の腫瘍のメチル化結果が得られました。

6. がん細胞の体細胞変異カタログ(COSMIC)データベース

  1. Catalog of Somatic Mutations in Cancer Cells (COSMIC) の Web サイト インターフェイスに移動します。
    注:ヒトゲノムにおけるコード変異、非コード変異ゲノム再構成、および融合遺伝子に関するデータは、 Catalog of Somatic Mutations in Cancer Cells (COSMIC) database20 (https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic/)から入手でき、これは、種々の癌における種々のTMEM200A 変異の頻度を決定するためにも使用される。
  2. 検索ボックスに遺伝子ID(TMEM200A)を入力し、 SEARCH ボタンをクリックすると新しい画面に移動します。
  3. Genes メニューで、TMEM200Aの遺伝子 ID 名が表示されているリンクを見つけてクリックします。
  4. 新しいページで [ Mutation distribut grouping] (変異分布のグループ化) 列を見つけて、腫瘍の TMEM200A の変異状態を取得します。

7.CBioポータル

  1. CBioPortalのWebサイトインターフェイスに移動します。
    注:がんゲノミクスデータは、cBioPortal(www.cioportal.org)データベースを使用して検索、ダウンロード、分析、および視覚化できます。体細胞変異、DNAコピー数変化(CNA)、mRNAおよびマイクロRNA(miRNA)発現、DNAメチル化、タンパク質量、リン酸化タンパク質量は、cBioPortal21によって統合されるゲノムデータタイプのほんの一部です。cBioPortalでは、幅広い研究を行うことができます。しかし、主な重点は、突然変異とその可視化に関連するさまざまな分析にあります。
  2. Select Studies for Visualization & Analysis セクションの PanCancer Studies サブセクションから Pan-cancer analysis of whole genomes データセットを選択します。次に、[Query By Gene] ボタンをクリックします。
  3. Enter Genesのクエリボックスに標的遺伝子ID(TMEM200A)を入力します。[Submit Query] ボタンをクリックします。
  4. ページ上部の [ がんの種類 の詳細] ボタンをクリックして、さまざまな種類のがんの TMEM200A の変異を取得します。

8. Sangerbox 3.0 ツール

  1. Sangerbox 3.0 ツール インターフェイスに移動します。
    注:すべての癌における 免疫 浸潤細胞、免疫抑制剤、免疫賦活因子、およびMHC分子(主要な組織適合遺伝子複合体)とのTMEM200A発現の相関関係は、Sangerbox 3.0ツール22 (http://vip.sangerbox.com/)の汎癌免疫浸潤データを使用してCIBERSORT免疫浸潤によって分析されました。
  2. ページ左側のツールバーから、Pan-Cancer AnalysisメニューからImmunocellular Analysis (CIBERSORT)タブを選択してクリックします。
  3. Enter Genesのクエリボックスに標的遺伝子ID(TMEM200A)を入力します。「送信」ボタンをクリックします。

9. TISIDBデータベース

  1. TISIDB の Web サイト インターフェイスに移動します。
    注: TISIDBデータベース23 (http://cis.hku.hk/TISIDB/)は、さまざまな癌における免疫浸潤細胞、免疫抑制剤、免疫賦活因子、およびMHC分子とのTMEM200A 発現との相関を調べるために採用されました。
  2. Enter GenesのクエリボックスにターゲットのGene Symbol(TMEM200A)を入力します。「送信」ボタンをクリックします。
  3. ページ上部のリン パ球、免疫調節剤、ケモカイン、および サブタイプの セクションをクリックします。ページ下部の関連画像をダウンロードします。

10. TIDEデータベース

  1. TIDEにアクセスします webサイトインターフェース。
    注:TIDEデータベース(http://tide.dfci.harvard.edu/)は、腫瘍免疫チェックポイント遮断療法に対する反応を予測するためのバイオマーカーとしてのTMEM200A の可能性を評価するために使用されました。
  2. 初期画面でメールアドレスを入力してアカウントを登録し、ログインします。
  3. ページ上部の 「Biomarker Evaluation 」サブセクションを見つけてクリックします。
  4. ページ下部のEnter Genesのクエリボックスにターゲット遺伝子ID(TMEM200A)を入力します。次に、「送信」ボタンをクリックします。
  5. ページ内でマウスをドラッグしてページを下にスライドし、分析の結果を確認します。

11. CancerSEAデータベース

  1. CancerSEAのWebサイトのインターフェイスにアクセスします。
    注:シングルセルシーケンシングデータを用いて、 TMEM200A 発現と異なる腫瘍細胞の機能状態との関係を調べました。これは、 CancerSEAデータベース24 (http://biocc.hrbmu.edu.cn/CancerSEA/)を用いて行った。
  2. ページの上部にある [ 検索 ] タブを見つけてクリックします。
  3. Enter Genesのクエリボックスに標的遺伝子ID(TMEM200A)を入力します。「送信」ボタンをクリックします。

12.腫瘍免疫シングルセルセンター(TISCH)ネットワークツール

  1. 腫瘍免疫単一細胞センター(TISCH)ネットワークツールのWebサイトインターフェイスに移動します。
    注: TMEM200A 細胞と癌細胞の発現レベルとの相関は、腫瘍免疫単一細胞センター(TISCH)ネットワークツール25を用いても示された。
  2. Enter Genesのクエリボックスに標的遺伝子ID(TMEM200A)を入力します。[探索] ボタンをクリックします。
  3. このページの [がんの種類 ] メニューで、[ All Cancers ] データセットを選択してクリックします。次に、ページを下にスクロールして、[ 検索 ]ボタンをクリックします。

13.ジェネマニア

  1. GeneMANIAのWebサイトインターフェイスに移動します。
    注:TMEM200Aとその機能的に関連する遺伝子との相関は、遺伝子間相互作用(GGI)ネットワークを構築するための遺伝子多会合ネットワークWebsite GeneMANIA (www.genemania.org)26の統合戦略を用いて予測された。
  2. ページの左上にある 検索 ボックスに、遺伝子ID(TMEM200A)を入力し、 検索ツールをクリックします。
    注: GeneMANIA ウェブツールを使用して、 TMEM200Aに関連する20個の遺伝子を見つけました。

14. 機能エンリッチメント分析

  1. 濃縮のために解析する遺伝子のシンボルIDをtxtファイル形式で保存します。
  2. R コード (symbolidR) を開き、上記の txt ファイルが配置されているパスをコピーして、R コードの setwd が配置されている行に貼り付けます。
  3. R ソフトウェアを開き、変更した R コード (symbolidR) を実行します。これらの遺伝子のシンボルIDを「org.Hs.eg.db」パッケージ。 id.txt ファイルを取得します。
  4. R コード (GOR と KEGGR) を開き、 id.txt ファイルが配置されているパスをコピーして、R コードの setwd が配置されている行に貼り付けます。
  5. R ソフトウェアを開き、変更した R コード (GOR と KEGGR) を実行します。このプロトコルに従うには、パッケージ「clusterProfiler」、「org.Hs.eg.db」、および "enrichplot" を実行し、パッケージ "gglot2" を使用してエンリッチメント結果をプロットします。

15. 遺伝子活性の違いの解析

注:各がんサンプルのTMEM200Aスコアリングは、ssGSEA(単一サンプル遺伝子セット濃縮分析)27を使用して計算され、さまざまながんについて、がん組織と健康な組織におけるTMEM200A遺伝子活性の差動分析が行われました。

  1. ステップ1.7でダウンロードした33種類の腫瘍のRNA-seqデータに基づいて、ダウンロードしたすべてのファイルを解凍し、統一されたフォルダに配置します。
  2. 上記のフォルダに merge.txt ファイルを配置します。
    注:BioWolf(www.biowolf.cn)のmerge.txtファイルのデータには、がんゲノムアトラス(TCGA)データベース内のすべての腫瘍のすべての患者の遺伝子発現が含まれています。
  3. R コード (ssGSEAR) を開き、上記のフォルダーが配置されているパスをコピーして、R コードの setwd が配置されている行に貼り付けます。
  4. R コード (ssGSEAR) の geneName がある行を取り、遺伝子 ID (TMEM200A) を入力します。
  5. Rソフトウェアを開き、変更したRコード(ssGSEAR)を実行します。遺伝子活性のスコアリングファイルを取得します: scores.txt。
    注:ssGSEAアルゴリズムでは、 まず、merge.txt ファイルで提供されたデータに従って、遺伝子間の相関係数に基づいて遺伝子セットファイルを構築し、そのファイルから標的遺伝子(TMEM200A)との相関が高い遺伝子を同定します。そして、相関性の高い遺伝子を TMEM200Aの活性遺伝子として統一し、最後に各サンプルの活性遺伝子のスコアリングを求めます。
  6. R コード (scoreDiffR) を開き、scores.txt ファイルが配置されているパスをコピーして、R コード内の setwd がある行に貼り付けます。
  7. R ソフトウェアを開き、変更した R コード (scoreDiffR) を実行し、"plyr"、"reshape2"、および "ggpubr" パッケージを使用して画像を描画します。

16. 臨床病理学的相関と生存予後解析

  1. UCSC Xena の Web サイト インターフェイスに移動します。
  2. [ Launch Xena ]タブをクリックします。
  3. 画面上部の [DATA SETS ] タブをクリックします。
  4. ページにカーソルを合わせ、下にスクロールして TCGA Pan-Cancer (PANCAN) タブを見つけます。
  5. このページの 129 のコホートと 1,571 のデータセットから、[ TCGA Pan-Cancer (PANCAN)] タブをクリックします。
  6. 表現型メニューから、[キュレーションされた臨床データ]タブを選択してクリックします。
  7. ダウンロードメニューから、対応するリンクをクリックします。
    注:上記のリンクからTCGAデータベースから33のがんの臨床データをダウンロードしてください。
  8. ダウンロードした臨床データファイルを解凍し、解凍したファイルをxlsファイル形式で開きます。
  9. 必要な臨床データ(病期、年齢、病態、病状)をファイルに整理して保持し、残りの不要な臨床データを削除し、ファイル名を「clinical」に変更してファイル全体をtxt形式のファイルとして保存します。
  10. 手順1.9で取得した singleGeneExp.txt に基づいて、このファイルを整理 されたclinical.txt ファイルと同じフォルダーに配置します。
  11. ダウンロードした臨床データを解凍し、解凍した臨床ファイルと同じフォルダに singleGeneExp.txt ファイルと clinical.txt ファイルを配置します。
  12. R コード (clinicalDiffR) を開き、上記のフォルダーが配置されているパスをコピーして、R コードの setwd が配置されている行に貼り付けます。
  13. Rソフトウェアを開き、変更したRコード(clinicalDiffR)を実行し、「ggpubr」パッケージを使用して画像を描画します。
  14. UCSC Xena の Web サイト インターフェイスに移動します。
  15. [ Launch Xena ]タブをクリックします。
  16. 画面上部の [DATA SETS ] タブをクリックします。
  17. このページの 129 のコホートと 1,571 のデータセットから、 GDC TCGA 急性骨髄性白血病 (LAML)、GDC TCGA 副腎皮質がん (ACC)、GDC TCGA 胆管がん (CHOL) など、合計 33 のがんのタブをクリックします。
  18. 表現型メニューから、生存データタブを選択してクリックします。
  19. ダウンロードメニューから、対応するリンクをクリックします。
  20. 33種類のがんの生存データのzipアーカイブを、コンピューターのデスクトップフォルダーにある1つのファイルに解凍します。
  21. 解凍したサバイバルデータは、手順1.9で取得した singleGeneExp.txt ファイルと同じフォルダに入れます。
  22. R コード (preOSR) を開き、上記のフォルダーが配置されているパスをコピーして、R コードの setwd が配置されている行に貼り付けます。
  23. R ソフトウェアを開き、変更した R コード (preOSR) を実行します。「limma」パッケージを使用して計算し、汎がんにおける TMEM200A の生存に関するデータファイルを取得します: expTime.txt。
  24. R コード (OSR) を開き、 expTime.txt ファイルが配置されているパスをコピーして、R コード内の setwd が配置されている行に貼り付けます。
  25. R ソフトウェアを開き、変更した R コード (OSR) を実行します。expTime.txtファイルのデータに基づいて「survival」および「survminer」パッケージを使用してKM分析を実行し、汎がんのTMEM200Aの生存曲線をプロットします。

17. フォレストプロット構築による単変量および多変量Cox回帰分析

  1. R コード (COXR) を開き、16.23 から expTime.txt ファイルを取得したパスをコピーして、R コードの setwd が配置されている行に貼り付けます。
  2. R ソフトウェアを開き、変更した R コード (COXR) を実行します。 expTime.txt ファイルのデータに基づいて、「survival」、「survminer」、および「forestplot」パッケージを使用して単変量COX回帰分析を実行し、さまざまながんの TMEM200A の単変量フォレストプロットをプロットします。
  3. 手順16.23の expTime.txt ファイルと手順16.10の clinical.txt ファイルを同じフォルダに配置します。
  4. R コード (multicoxR) を開き、手順 16.23 の expTime.txt ファイルと手順 16.10 の clinical.txt ファイルを含むフォルダーが配置されているパスをコピーして、R コードで setwd が配置されている行に貼り付けます。
  5. R ソフトウェアを開き、変更した R コード (multicoxR) を実行します。"survival" パッケージと "survminer" パッケージを使用して多変量 COX 回帰分析を実行し、expTime.txt ファイルと clinical.txt ファイルのデータに基づいて、さまざまながんのTMEM200Aの多変量フォレスト プロットをプロットします。

18. TMEM200A 発現と臨床的特徴に基づく胃癌の予後モデル

  1. 手順16.10の clinical.txt ファイルと手順16.23の expTime.txt ファイルを同じフォルダに配置します。
  2. Rコード(NomoR)を開き、上記のtxtファイルが配置されているパスをコピーして、Rコードの setwd が配置されている行に貼り付けます。
  3. Rソフトウェアを開き、変更したRコード(NomoR)を実行します。ソフトウェアパッケージ「survival」、「regplot」、および「rms」を使用して、GCおよび臨床データの 発現データTMEM200A 、患者の生存を予測するための予後モデルを構築します。

19. TMEM200Aの細胞培養とsiRNAトランスフェクション

注:ヒトSTAD HGC-27細胞、SGC-7901細胞、およびヒト胃粘膜上皮 GES-1細胞 を商業的に入手し( 資料表を参照)、蘇生し、ロズウェルパーク記念研究所(RPMI)1640完全培地(10%のウシ新生仔胎児血清および1%ペニシリン混合物を含む)で接種し、5%CO2 中で37°Cで培養した細胞培養インキュベーター。培地は2〜3日ごとに交換した。良好な増殖状態にある細胞を、(2〜3)に従って6ウェルプレートに接種し×105 細胞/ウェルとした。

  1. まず、3本の微量遠心チューブを用意し、各チューブに8 μLのトランスフェクション試薬(材料のTを参照)と200 μLの基礎培地を加えます。次に、SiRNA1、SiRNA2、SiRNA3 をそれぞれ 4 μg ずつ各チューブに添加します。
    注: TMEM200A ノックダウンのために、siRNAを設計し、購入しました( 材料表を参照)。
  2. 3本の微量遠心チューブで混合物を完全に混合し、6ウェルプレートの3つのウェルのそれぞれに加えます。6ウェルプレートを静かに振って、混合物を均等に分散させます。混合物を添加した 3 つのウェルを SiRNA-1、SiRNA-2、および SiRNA-3 とラベル付けします。
  3. 細胞を4〜6時間インキュベートしたら、6ウェルプレートの3つのサブウェルの培地の半分を交換します。
    注意: 完全な培地の半分を交換する場合は、元の完全な培地の半分を吸引し、新しい完全な培地の半分を補充します。
  4. 24〜48時間後、siRNAトランスフェクションした 細胞TMEM200A 実験群として使用し、トランスフェクションしていない細胞をネガティブコントロールグループとして使用します。 定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR、 セクション20を参照)を実施して、細胞に対するトランスフェクションの効果を評価します。

20. 定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応

  1. 各サブグループの細胞培養培地を廃棄し、1 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を2回穏やかに洗浄します。
  2. RNA単離キットを使用してトータルRNAを単離します( 材料表を参照)。
  3. メーカーの指示に従い、 cDNA Synthesis Kitを使用してRNA濃度を推定し、1 μgのRNAでcDNAを合成します。
  4. リアルタイムPCRアッセイシステムを使用して、GAPDH(標準化用)、TMEM200A(材料表を参照)、qPCRマスターミックス用のヒト特異的フォワードプライマーおよびリバースプライマーを含む、10 μLの反応混合物中のcDNAを10倍希釈して定量的リアルタイムPCR(qRT-PCR)を実施します。
    注:各実験を3回に分けて実行してください。
  5. 以下のqPCR反応条件を使用します:初期化、95°Cで3分間。変性、95°Cで10秒。焼きなまし、60°Cで30秒。伸長、80°Cで10秒。変性、アニーリング、伸長を40回繰り返します。2-ΔΔCt技術を用いて各遺伝子の相対発現を決定する28。
  6. 実験を少なくとも3回繰り返して、生物学的トリプリケートを取得します。

21. 関連するタンパク質発現のウェスタンブロット検出

  1. 各サブグループの細胞培養培地を廃棄し、2 x 1 mLのPBSで細胞を静かに洗浄します。
  2. 細胞を含む6ウェルプレートを氷上で冷却し、150 μLの予冷した無線免疫沈降アッセイ(RIPA)溶解バッファー(150 mM NaCl、0.1% Triton X-100、0.5% デオキシコール酸ナトリウム、0.1% SDS、50 mM Tris-HCl pH 8.0、および新たに添加したプロテアーゼ阻害剤カクテル)を加えます。溶解を氷上で10分間進行させます。
  3. プラスチック製の細胞スクレーパーを使用して、ディッシュから付着した細胞を取り除き、細胞溶液を予冷された微量遠心チューブに繊細に移します。
  4. 細胞溶解物を4°Cで1.5×104gで10分間遠心分離します。 上清を新しい1.5 mL微量遠心チューブに移します。 
  5. BCAタンパク質アッセイキットを利用して、メーカーの指示に従ってタンパク質含有量を測定します。
  6. 各サンプルから30 gのタンパク質を10%ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)ゲルにロードし、80 Vで0.5時間泳動した後、120 Vで1.5時間泳動します。
  7. タンパク質をゲルから45μmのポリフッ化ビニリデン(PVDF)メンブレンに300mAの電圧で1〜1.5時間移します。
  8. PVDFメンブレンをシェーカーに置き、3 x 5分間振とうした後、Tween 20(TBST、20 mM Tris-HCl、pH 7.4、150 mM NaCl、および0.1% Tween 20)を含むTris緩衝生理食塩水を、タンパク質側(ゲル側)を上に向けて適切な容器に加えます。
  9. メンブレンをブロッキングバッファー( 材料表を参照)に入れ、室温で0.5時間インキュベートします。
  10. メンブレンをTBSTで3 x 10分間洗浄します。
  11. リン酸化AKT(p-AKT;1:1,000)、総 AKT 1:1,000、E-カドヘリン(E-ca;1:1,000)、N-カドヘリン(N-ca;1:1,000)、 ビメンチン 1:1,000、 カタツムリ 1:1,000、 TMEM200A 1:1,000、グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH;1:1,000)に対する一次抗体をメンブレンを4°Cで一晩インキュベートします。
  12. メンブレンを3 x 10分間洗浄し、メンブレンをウサギまたはマウスの二次抗体(1:5,000)とともに室温で1時間インキュベートします。
  13. PVDFメンブレンをECL基質と30秒間インキュベートし、イメージングシステムを使用してシグナルを検出します。

22. CCK-8アッセイ

  1. ヒトSTAD HGC-27 細胞を良好な増殖状態で96ウェルプレートに播種します。
  2. 細胞密度が60〜70%に達したら、 細胞にTMEM200A siRNA をトランスフェクションします(ステップ19.3と同様)。
  3. トランスフェクションした細胞を5×10 3/ウェルの細胞密度で96ウェルプレートに播種し(セルカウンターを使用して生細胞をカウント)、 NC および TMEM200A siRNAグループ に分割し(各グループに3つの複製ウェルを使用)、37°Cでインキュベートします。
  4. 0、24、48、72、96時間後にCCK-8試薬を添加し、37°Cで2時間インキュベートします。吸光度(450nm)を多機能酵素ラベラーで測定します。

結果

各種がんにおける TMEM200A 発現
図1に示すように、まず、さまざまなデータベースを使用して、さまざまながんのTMEM200Aの発現レベルの違いを分析しました。TMEM200A発現は、TCGAデータのみに基づく隣接する正常組織と比較して、胆管癌(CHOL)、頭頸部扁平上皮癌(HNSC)、腎明細胞癌(KIRC)、腎乳頭状細胞癌(KIRP)、肝細胞癌(LIHC)、STAD...

ディスカッション

TMEM200A 、がん細胞の増殖に不可欠なTMEMファミリーに属しています38。異なる悪性腫瘍における TMEM200A の発現のばらつきはあまり注目されておらず、徹底的な汎がん調査は行われていない。しかし、TMEM膜貫通タンパク質ファミリーは、いくつかのタンパク質との相互作用を通じてがん細胞を悪性に保つのに重要である可能性があることを示す証拠が蓄積され続?...

開示事項

著者らは、利益相反はないと宣言しています。

謝辞

この研究は、中国国家自然科学基金会(82160550)の支援を受けました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-AKT antibodyProteintech Group, Inc60203-2-Ig
Anti-E-cadherin antibodyProteintech Group, Inc20874-1-AP
anti-glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) antibodyProteintech Group, Inc10494-1-AP
Anti-N-cadherin antibodyProteintech Group, Inc22018-1-AP
Anti-P-AKT antibodyProteintech Group, Inc66444-1-Ig
Anti-snail antibodyProteintech Group, Inc13099-1-AP
Anti-Vimentin antibodyProteintech Group, Inc10366-1-AP
AxyPrepMultisourceTotalRNAMini-
prep Kit		Suzhou Youyi Landi Biotechnology Co., LtdUEL-UE-MN-MS-RNA-50G
BCA Protein Assay KitEpizyme BiotechZJ101L
CCK-8 reagentMedChemExpressHY-K0301-500T
Fetal bovine serum (FBS)CYAGEN BIOSCIENCES (GUANGZHOU) INCFBSSR-01021
GAPDH primerSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.Forward primer (5’-3’): TGACATCAAGAAGGTG
GTGAAGCAG; Reverse primer (5’-3’): GTGTCGCTGTTGAAG
TCAGAGGAG
HighGene plus Transfection reagentABclonalRM09014P
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse lgG (H+L)Proteintech Group, IncSA00001-1
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit lgG (H+L)Proteintech Group, IncSA00001-2
Human gastric mucosal epithelial GES-1 cellsGuangzhou Cellcook Biotech Co.,Ltd.
Human STAD HGC-27 cellsProcell Life Science&Technology Co.,Ltd
Human STAD SGC-7901 cellsProcell Life Science&Technology Co.,Ltd
MonAmp SYBR Green qPCR Mix (None ROX)Mona (Suzhou) Biotechnology Co., LtdMQ10101S
MonScript RTIII All-in-One Mix with dsDNase  Mona (Suzhou) Biotechnology Co., LtdMR05101M
Omni-ECL Femto Light Chemiluminescence KitEpizyme BiotechSQ201
PAGE Gel Fast Preparationb Kit Epizyme BiotechPG111
Penicillin-streptomycin (Pen-Strep)Beijing Solarbio Science & Technology Co.,LtdP1400-100
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membraneMerck KGaAIPVH00010-1
Protein Free Rapid Blocking BufferEpizyme BiotechPS108P
RIPA lysis solutionBeijing Solarbio Science & Technology Co., LtdR0010
RPMI 1640 complete mediumThermo Fisher ScientificC11875500BT
Skimmed milkCampina: Elk
TBST buffer solutionBeijing Solarbio Science & Technology Co., LtdT1082
The protein loading bufferEpizyme BiotechLT101S
TMEM200A knockdown plasmidMiaoLing Plasmid
TMEM200A primerSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.Forward primer (5’-3’): AAGGCGGTGTGGTGGTTCG; Reverse primer (5’-3’): GATTTTGGTCTCTTTGTCACGGTT
TMEM200A SiRNA1MiaoLing PlasmidForward primer (5’-3’): ACAACTGATGATAAGACCAG; Reverse primer (5’-3’): TGTTGACTACTATTCTGGTC
TMEM200A SiRNA2MiaoLing PlasmidForward primer (5’-3’): CGTGTGAATGTCAATGACTG; Reverse primer (5’-3’): GCACACTTACAGTTACTGAC
TMEM200A SiRNA3MiaoLing PlasmidForward primer (5’-3’): ACAACCACAACATCTGCCCG; Reverse primer (5’-3’): TGTTGGTGTTGTAGACGGGC
Transmembrane protein 200A AntibodyProteintech Group, Inc48081-1
Equipment
CO2 cell culture incubatorHaier GroupPYXE-80IR
Electrophoresis instrumentBio-RAD
Fluorescence quantitative PCR instrumentBio-RAD
Multifunctional Enzyme LabelerBerthold

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