Análise Multiômica de TMEM200A como Biomarcador Pan-Câncer

Resumo

Aqui, é apresentado um protocolo no qual múltiplas ferramentas de bioinformática são combinadas para estudar as funções biológicas da TMEM200A no câncer. Além disso, também validamos experimentalmente as previsões de bioinformática.

Resumo

A proteína transmembrana, TMEM200A, é conhecida por estar associada a cânceres humanos e infiltração imunológica. Aqui, avaliamos a função da TMEM200A em cânceres comuns por meio de análise multiômica e usamos culturas de células gástricas in vitro para verificar os resultados. A expressão de TMEM200A em vários tipos de câncer humano foi avaliada usando os dados de RNA-seq do banco de dados UCSC Xena. A análise bioinformática revelou um papel potencial da TMEM200A como biomarcador diagnóstico e prognóstico.

Culturas de linhagens normais de células gástricas e cancerígenas foram cultivadas e TMEM200A foi derrubada. Os níveis de expressão de TMEM200A foram medidos usando reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real e western blotting. Estudos in vitro de perda de função foram então utilizados para determinar o papel da TMEM200A no comportamento maligno e na formação tumoral de células de câncer gástrico (GC). Western blots foram utilizados para avaliar o efeito do knockdown na transição epitélio-mesenquimal (EMT) e na via de sinalização PI3K/AKT no GC. A análise bioinformática mostrou que TMEM200A foi expressa em níveis elevados no GC.

A proliferação de células GC foi inibida por knockdown TMEM200A , que também diminuiu as proteínas vimentina, N-caderina e Snai e inibiu a fosforilação de AKT. A via de sinalização PI3K/AKT também parece estar envolvida na regulação mediada por TMEM200A do desenvolvimento de GC. Os resultados aqui apresentados sugerem que TMEM200A regula o microambiente tumoral afetando a EMT. TMEM200A também podem afetar a EMT através da sinalização PI3K/AKT, influenciando o microambiente tumoral. Portanto, em pan-cânceres, especialmente GC, TMEM200A pode ser um potencial biomarcador e oncogene.

Introdução

O câncer tem emergido como um problema persistente de saúde pública que coloca em risco a saúde humana em todo o mundo¹devido às suas altas taxas de morbidade e mortalidade em todo o mundo, representando um pesado fardo financeiro e médico para a sociedade². Avanços significativos na terapia do câncer foram alcançados nos últimos anos graças à descoberta de marcadores de câncer³, e os pesquisadores desenvolveram novos métodos diagnósticos e novas drogas para tratar o câncer. No entanto, alguns pacientes com câncer ainda apresentam prognóstico ruim devido a fatores como resistência aos medicamentos, efeitos colaterais dos fármacos e sensibilidade química⁴. Portanto, há uma necessidade urgente de identificação de novos biomarcadores para o rastreamento e tratamento de cânceres em estádio inicial⁵.

As proteínas de membrana são proteínas que podem se ligar e se integrar às células e membranas organelas⁶. Estas podem ser agrupadas em três categorias, dependendo da força de ligação à membrana e de sua localização: proteínas ancoradas a lipídios, proteínas íntegras e proteínas de membrana periférica ^7,8. Uma proteína transmembrana (TMEM) é uma proteína de membrana integral que consiste em pelo menos um segmento transmembrana⁹, que passa total ou parcialmente através da membrana biológica.

Embora os mecanismos de ação das proteínas pertencentes à família TMEM não sejam bem compreendidos, sabe-se que essas proteínas estão envolvidas em vários tipos de^câncer10. Várias proteínas TMEM estão associadas a fenótipos migratórios, proliferativos e invasivos, e sua expressão está frequentemente associada ao prognóstico do paciente¹¹. Portanto, os membros da família TMEM tornaram-se alvo de pesquisa. Uma revisão abrangente dos relatos existentes sobre TMEM revelou que eles estão principalmente associados à sinalização inter e intracelular¹², doenças relacionadas à imunidade e tumorigênese¹⁰. Muitos TMEMs também possuem funções fisiológicas importantes, por exemplo, canais iônicos na membrana plasmática, ativação de vias de transdução de sinal, bem como a mediação da quimiotaxia celular, adesão, apoptose e autofagia¹⁰. Portanto, levantamos a hipótese de que as proteínas TMEM podem ser importantes marcadores prognósticos na detecção e tratamento de tumores.

TMEM200A expressão é significativamente elevada no câncer gástrico (GC). A maior expressão do TMEM200A¹³, que possui oito exons e comprimento total de 77,536 kb no cromossomo 6q23.1, tem sido associada a um mau prognóstico de sobrevida global (SG) em casos de CG. No entanto, as alterações em sua expressão têm sido raramente relatadas em estudos oncológicos. Este artigo compara e analisa a utilidade do TMEM200A como alvo terapêutico e marcador diagnóstico tumoral em vários estudos de câncer usando diferentes conjuntos de dados disponíveis publicamente. Avaliamos a eficácia do TMEM200A como um biomarcador diagnóstico e prognóstico pan-câncer, bem como seus níveis de expressão em vários tipos de câncer humano usando dados de RNA-seq dos bancos de dados UCSC Xena e TCGA, bem como por reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qRT-PCR) e western blotting.

O efeito dos níveis de expressão de TMEM200A sobre as taxas de mutação, processos regulatórios, diagnóstico e prognóstico tumoral, infiltração imune e imunoterapia foi investigado usando uma mistura de ferramentas computacionais e sites de conjunto de dados. Os bancos de dados CBioPortal e Catalog of Somatic Mutations in Cancer Cells (COSMIC) foram usados para examinar mutações em TMEM200A. Os sites Sangerbox e TISIDB foram utilizados para entender como TMEM200A influencia a infiltração imunológica. A ferramenta on-line Tumor Immune Single Cell Center (TISCH) e o banco de dados CancerSEA foram usados para investigar a função do TMEM200A. Finalmente, para avaliar o impacto da TMEM200A sobre o comportamento maligno e a função de desenvolvimento tumoral das células GC, um experimento de perda de função foi conduzido em um ensaio in vitro . Adicionalmente, o western blotting foi realizado para avaliar como TMEM200A knockdown afetou a via de sinalização PI3K/AKT e a transição epitélio-mesenquimal (EMT) no GC.

Protocolo

1. O banco de dados do Atlas do Genoma do Câncer (TCGA)

NOTA: O banco de dados do Atlas do Genoma do Câncer (TCGA) contém os dados de sequenciamento de genes em diferentes tecidos tumorais14. Dados de RNA-seq em TCGA para o estudo de TMEM200A transcritos por parte por milhão (TPM) foram extraídos do site UCSC Xena ¹⁵ (https://xenabrowser. net/datapages/) e transformados log2 para comparação das expressões entre amostras.

1. Acesse a interface do site do UCSC Xena .
2. Clique na guia Iniciar Xena .
3. Clique na guia CONJUNTOS DE DADOS na parte superior da tela.
4. Das 129 coortes e 1.571 conjuntos de dados nesta página, clique na guia para um total de 33 cânceres, como GDC TCGA Acute Myeloid Leukemia (LAML), GDC TCGA Adrenocortical Cancer (ACC), GDC TCGA Bile Duct Cancer (CHOL) e muito mais.
5. No menu RNAseq de expressão gênica , selecione e clique na guia HTSeq - FPKM GDC Hub .
   NOTA: HTSeq - FPKM GDC Hub representa dados que foram corrigidos por consentimento.
6. No menu de download , clique no link correspondente.
   NOTA: Pelo método acima, os dados de RNA-Seq foram baixados para 33 tipos diferentes de câncer.
7. Descompacte o arquivo zip de dados RNA-seq para 33 tipos diferentes de câncer em um único arquivo na pasta desktop do computador.
8. Unifique os arquivos txt descompactados na mesma pasta e coloque os scripts Perl nessa pasta.
9. Abra o software Perl , copie e cole o caminho da pasta no software Perl onde o cursor do mouse está localizado, pressione a tecla Enter , digite o nome do código Perl e o nome do gene (TMEM200A) e, em seguida, pressione a tecla Enter para obter um novo arquivo txt (singleGeneExp.txt).
   NOTA: Este novo arquivo txt (singleGeneExp.txt) contém expressão gênica de TMEM200A em 33 cânceres em pacientes diferentes.
10. Abra o código R (diffR) e copie e cole o caminho onde o arquivo singleGeneExp.txt está localizado na linha onde setwd está localizado no código R.
11. Abra o software R, execute o código R modificado (diffR) e desenhe a imagem através do pacote "ggpubr".

2. O banco de dados TIMER2.0

1. Vá para a interface do site do banco de dados TIMER2.0 (http://timer.cistrome.org) ¹⁶.
2. Clique na guia Exploração do câncer.
3. Digite o ID do gene (TMEM200A) na caixa de pesquisa e clique na guia Enviar para obter as imagens de expressão diferencial de TMEM200A em diferentes tipos de tumores.

3. Atlas de Proteínas Humanas (HPA)

1. Vá para a interface web do Atlas de Proteína Humana (HPA) (www.proteinatlas.org) ¹⁷.
2. Digite ID (TMEM200A) na caixa de pesquisa e clique no botão Pesquisar . Selecione o subatlas TISSUE.
3. Passe o mouse sobre a página e role para baixo até encontrar a guia Visão geral da expressão de proteínas .
   NOTA: A seção Visão geral da expressão de proteínas mostra os níveis de expressão proteica de TMEM200A em 45 órgãos do corpo humano.

4. A matriz da plataforma de metilação de DNA HumanMethylation450 Illumina Infinium

NOTA: O arranjo da plataforma de metilação de DNA HumanMethylation450 Illumina Infinium foi usado para coletar dados sobre metilação. Foi possível avaliar os níveis TMEM200A de metilação do DNA utilizando o banco de dados SMART (http://www.bioinfo-zs.com/smartapp/)¹⁸.

1. Acesse a interface do site SMART .
2. Digite o ID do gene (TMEM200A) na caixa de pesquisa para obter a distribuição de TMEM200A nos cromossomos e o nível de metilação de TMEM200A em diferentes tipos de malignidades.
3. Role a página para baixo até o clique para verificar o menu de metilação agregada CpG e clique no botão Plotar . Na parte inferior da página, localize e clique no botão Download Figur . Faça o download da figura.

5. A base de dados UALCAN

1. Vá para a interface do site do UALCAN .
   NOTA: Box plots dos níveis de metilação do promotor TMEM200A em várias neoplasias malignas foram gerados através do banco de dados UALCAN (http://ualcan.path.uab.edu/analysisprot.html)¹⁹
2. Na parte superior da página, clique no botão TCGA .
3. Digite TMEM200A na caixa de entrada Gene ID na tela. No menu do conjunto de dados TCGA , role para baixo e selecione o tipo de câncer a ser consultado.
4. Depois de clicar no botão Explorar , clique em sua análise de subgrupo Metilação no menu Links para análise para obter os resultados de metilação deste tumor.
   NOTA: Por este método, obtivemos resultados de metilação para 22 tumores no banco de dados UALCAN .

6. Base de dados do Catálogo de Mutações Somáticas em Células Cancerosas (COSMIC)

1. Acesse a interface do site do Catálogo de Mutações Somáticas em Células Cancerosas (COSMIC).
   NOTA: Dados sobre mutações codificantes, rearranjos genômicos mutantes não codificantes e genes de fusão no genoma humano estão disponíveis no banco de dados do Catálogo de Mutações Somáticas em Células Cancerosas (COSMIC)²⁰ (https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic/), que também é usado para determinar a frequência de várias mutações TMEM200A em vários tipos de câncer.
2. Digite o ID do gene (TMEM200A) na caixa de pesquisa e clique no botão PESQUISAR para ir para uma nova tela.
3. No menu Genes , localize e clique no link onde aparece o nome do ID do gene do TMEM200A .
4. Encontre a coluna Agrupamento de distribuição de mutação na nova página para obter o status de mutação de TMEM200A no tumor.

7. CBioPortal

1. Acesse a interface do site do CBioPortal .
   NOTA: Os dados genômicos do câncer podem ser encontrados, baixados, analisados e visualizados usando o banco de dados cBioPortal (www.cioportal.org). Mutações somáticas, alterações no número de cópias do DNA (CNAs), expressão de mRNA e microRNA (miRNA), metilação do DNA, abundância de proteínas e abundância de fosfoproteínas são apenas alguns dos tipos de dados genômicos integrados pelo cBioPortal²¹. Com o cBioPortal, uma ampla gama de estudos pode ser realizada; no entanto, a maior ênfase está em diferentes análises relacionadas às mutações e sua visualização.
2. Selecione a análise Pan-câncer do conjunto de dados de genomas inteiros na subseção PanCancer Studies da seção Select Studies for Visualization & Analysis . Em seguida, clique no botão Consultar por gene .
3. Digite o ID do gene de destino (TMEM200A) na caixa de consulta de Enter Genes. Clique no botão Enviar consulta .
4. Clique no botão Tipo de Câncer Detalhado na parte superior da página para obter as mutações de TMEM200A em vários tipos de cânceres.

8. Ferramenta Sangerbox 3.0

1. Vá para a interface da ferramenta Sangerbox 3.0 .
   NOTA: A correlação da expressão de TMEM200A com células imunes infiltrantes, agentes imunossupressores, fatores imunoestimulatórios e moléculas de MHC (complexo principal de histocompatibilidade) em todos os cânceres foi analisada por infiltração imune CIBERSORT usando os dados de infiltração imune pan-câncer na ferramenta Sangerbox 3.0²² (http://vip.sangerbox.com/).
2. Na barra de ferramentas no lado esquerdo da página, selecione e clique na guia Análise Imunocelular (CIBERSORT) no menu Análise Pan-Câncer .
3. Insira o ID do gene de destino (TMEM200A) na caixa de consulta de Enter Genes. Clique no botão Enviar .

9. Base de dados TISIDB

1. Vá para a interface do site do TISIDB .
   NOTA: O banco de dados TISIDB²³ (http://cis.hku.hk/TISIDB/) foi empregado para examinar a correlação da expressão de TMEM200A com células imunes infiltrantes, agentes imunossupressores, fatores imunoestimulatórios e moléculas de MHC em vários tipos de câncer.
2. Digite o Símbolo de Gene (TMEM200A) de destino na caixa de consulta de Inserir Genes. Clique no botão Enviar .
3. Clique nas seções Linfócitos, Imunomoduladores, Quimiocinas e Subtipos na parte superior da página. Faça o download das imagens relevantes na parte inferior da página.

10. A base de dados TIDE

1. Acesse a interface do site da TIDE .
   NOTA: O banco de dados TIDE (http://tide.dfci.harvard.edu/) foi usado para avaliar o potencial do TMEM200A como um biomarcador para prever a resposta à terapia de bloqueio de checkpoint imune tumoral.
2. Digite o endereço de e-mail na tela inicial para registrar a conta e fazer login.
3. Encontre a subseção Avaliação de Biomarcadores na parte superior da página e clique nela.
4. Insira o ID do gene de destino (TMEM200A) na caixa de consulta para Enter Genes na parte inferior da página. Em seguida, clique no botão Enviar .
5. Na página, arraste o mouse para deslizar a página para baixo e encontrar os resultados da análise.

11. A base de dados CancerSEA

1. Acesse a interface do site do CancerSea .
   NOTA: Usando dados de sequenciamento de célula única, as relações entre a expressão de TMEM200A e o estado funcional de diferentes células tumorais foram investigadas. Isso foi feito usando o banco de dados CancerSEA²⁴ (http://biocc.hrbmu.edu.cn/CancerSEA/).
2. Na parte superior da página, localize e clique na guia Pesquisar .
3. Insira o ID do gene de destino (TMEM200A) na caixa de consulta de Enter Genes. Clique no botão Enviar .

12. A ferramenta de rede do centro imune unicelular do tumor (TISCH)

1. Acesse a interface do site da ferramenta de rede TISCH .
   NOTA: A correlação entre os níveis de expressão de TMEM200A e células cancerosas também foi demonstrada usando a ferramenta de rede de centro imune único de célula tumoral (TISCH)²⁵.
2. Insira o ID do gene de destino (TMEM200A) na caixa de consulta de Enter Genes. Clique no botão Explorar .
3. No menu Tipo de câncer nesta página, selecione e clique no conjunto de dados Todos os cânceres . Em seguida, role a página para baixo e clique no botão Pesquisar .

13. GeneMANIA

1. Acesse a interface do site do GeneMANIA .
   NOTA: A correlação entre TMEM200A e seus genes funcionalmente relevantes foi prevista usando a estratégia de integração para a rede de multi-associação gênica Website GeneMANIA (www.genemania.org)²⁶ para a construção de redes de interação gene-gene (GGI).
2. Na caixa de pesquisa no canto superior esquerdo da página, digite o ID do gene (TMEM200A) e clique em Ferramentas de Pesquisa.
   NOTA: A ferramenta web GeneMANIA foi usada para encontrar 20 genes associados a TMEM200A.

14. Análise do enriquecimento funcional

1. Salve os IDs de símbolos dos genes a serem analisados para enriquecimento no formato de arquivo txt.
2. Abra o código R (symbolidR) e copie e cole o caminho onde o arquivo txt acima está localizado na linha onde setwd está localizado no código R.
3. Abra o software R e execute o código R modificado (symbolidR). Converta os ids de símbolos desses genes em entrezIDs através da "org. Hs.eg.db" pacote. Obtenha o arquivo id.txt .
4. Abra o código R (GOR e KEGGR) e copie e cole o caminho onde o arquivo id.txt está localizado na linha onde setwd está localizado no código R.
5. Abra o software R e execute o código R modificado (GOR e KEGGR). Para seguir este protocolo, analise esses genes para enriquecimento GO e KEGG pelos pacotes "clusterProfiler", "org. Hs.eg.db," e "enrichplot" e plotar os resultados de enriquecimento usando o pacote "gglot2".

15. Análise das diferenças na atividade gênica

NOTA: TMEM200A pontuação em cada amostra de câncer foi calculada usando ssGSEA (análise de enriquecimento de conjunto gênico de amostra única)²⁷, e a análise diferencial da atividade gênica de TMEM200A em tecidos cancerosos e saudáveis foi realizada para vários tipos de câncer.

1. Com base nos dados de RNA-seq de 33 tipos de tumor baixados na etapa 1.7, descompacte todos os arquivos baixados e coloque-os em uma pasta unificada.
2. Coloque o arquivo merge.txt na pasta acima.
   NOTA: Os dados em merge.txt arquivo de BioWolf (www.biowolf.cn) contém expressão gênica para todos os pacientes em todos os tumores no banco de dados do Atlas do Genoma do Câncer (TCGA).
3. Abra o código R (ssGSEAR) e copie e cole o caminho onde a pasta acima está localizada na linha onde setwd está localizado no código R.
4. Pegue a linha onde geneName está no código R (ssGSEAR) e digite o ID do gene (TMEM200A).
5. Abra o software R e execute o código R modificado (ssGSEAR). Obtenha o arquivo de pontuação para a atividade do gene: scores.txt.
   NOTA: Com o algoritmo ssGSEA, primeiro construímos um arquivo de conjunto de genes com base nos coeficientes de correlação entre genes de acordo com os dados fornecidos no arquivo merge.txt e identificamos os genes com maior correlação com o gene alvo (TMEM200A) do arquivo. Em seguida, os genes com maior correlação são unificados como os genes ativos de TMEM200A e, finalmente, obtém-se a pontuação dos genes ativos em cada amostra.
6. Abra o código R (scoreDiffR) e copie e cole o caminho onde o arquivo scores.txt está localizado na linha onde setwd está localizado no código R.
7. Abra o software R, execute o código R modificado (scoreDiffR) e desenhe a imagem através dos pacotes "plyr", "reshape2" e "ggpubr".

16. Correlação clínico-patológica e análise do prognóstico de sobrevida

1. Acesse a interface do site do UCSC Xena .
2. Clique na guia Iniciar Xena .
3. Clique na guia CONJUNTOS DE DADOS na parte superior da tela.
4. Passe o mouse sobre a página e role para baixo para encontrar a guia TCGA Pan-Cancer (PANCAN).
5. Das 129 coortes e 1.571 conjuntos de dados nesta página, clique na guia TCGA Pan-Cancer (PANCAN).
6. No menu do fenótipo , selecione e clique na guia Dados clínicos curados.
7. No menu de download , clique no link correspondente.
   NOTA: Faça o download dos dados clínicos de 33 cânceres do banco de dados TCGA no link acima.
8. Descompacte o arquivo de dados clínicos baixado e abra o arquivo descompactado no formato de arquivo xls.
9. Organize e retenha os dados clínicos necessários (estágio, idade, estágio patológico e status do paciente) no arquivo, exclua os dados clínicos desnecessários restantes e salve o arquivo inteiro como um arquivo de formato txt depois de renomeá-lo como clínico.
10. Com base na singleGeneExp.txt obtida na etapa 1.9, coloque esse arquivo na mesma pasta que o arquivo clinical.txt organizado.
11. Descompacte os dados clínicos baixados e coloque os arquivos singleGeneExp.txt e clinical.txt na mesma pasta que os arquivos clínicos descompactados.
12. Abra o código R (clinicalDiffR) e copie e cole o caminho onde a pasta acima está localizada na linha onde setwd está localizado no código R.
13. Abra o software R, execute o código R modificado (clinicalDiffR) e desenhe a imagem usando o pacote "ggpubr".
14. Acesse a interface do site do UCSC Xena .
15. Clique na guia Iniciar Xena .
16. Clique na guia CONJUNTOS DE DADOS na parte superior da tela.
17. Das 129 coortes e 1.571 conjuntos de dados nesta página, clique na guia para um total de 33 cânceres, como GDC TCGA Acute Myeloid Leukemia (LAML), GDC TCGA Adrenocortical Cancer (ACC), GDC TCGA Bile Duct Cancer (CHOL) e muito mais.
18. No menu do fenótipo , selecione e clique na guia Dados de sobrevivência.
19. No menu de download , clique no link correspondente.
20. Descompacte o arquivo zip de dados de sobrevivência para 33 tipos diferentes de câncer em um único arquivo na pasta da área de trabalho do computador.
21. Coloque os dados de sobrevivência descompactados na mesma pasta que o arquivo singleGeneExp.txt obtido na etapa 1.9.
22. Abra o código R (preOSR) e copie e cole o caminho onde a pasta acima está localizada na linha onde setwd está localizado no código R.
23. Abra o software R e execute o código R modificado (preOSR). Calcule através do pacote "limma" para obter um arquivo de dados sobre a sobrevivência do TMEM200A em pan-câncer: expTime.txt.
24. Abra o código R (OSR) e copie e cole o caminho onde o arquivo expTime.txt está localizado na linha onde setwd está localizado no código R.
25. Abra o software R e execute o código R modificado (OSR). Realize uma análise de GC usando os pacotes "survival" e "survminer" com base nos dados no arquivo expTime.txt e plote as curvas de sobrevivência para TMEM200A em pan-câncer.

17. Análise univariada e multivariada de regressão de Cox com construção de forest plot

1. Abra o código R (COXR) e copie e cole o caminho onde obtivemos o arquivo expTime.txt de 16.23 está localizado na linha onde setwd está localizado no código R.
2. Abra o software R e execute o código R modificado (COXR). Com base nos dados do arquivo expTime.txt , execute análises de regressão COX univariada usando os pacotes "survival", "survminer" e "forestplot" para plotar um gráfico univariado de floresta de TMEM200A em diferentes cânceres.
3. Coloque o arquivo expTime.txt da etapa 16.23 e clinical.txt da etapa 16.10 na mesma pasta.
4. Abra o código R (multicoxR) e copie e cole o caminho onde a pasta que contém o arquivo expTime.txt da etapa 16.23 e clinical.txt arquivo da etapa 16.10 está localizada na linha onde setwd está localizado no código R.
5. Abra o software R e execute o código R modificado (multicoxR). Execute uma análise de regressão COX multivariada usando os pacotes "survival" e "survminer" para plotar um gráfico multivariado de floresta de TMEM200A em diferentes cânceres com base nos dados nos arquivos expTime.txt e clinical.txt .

18. Modelo prognóstico do câncer gástrico baseado na expressão TMEM200A e características clínicas

1. Coloque o arquivo clinical.txt da etapa 16.10 e o arquivo expTime.txt da etapa 16.23 na mesma pasta.
2. Abra o código R (NomoR) e copie e cole o caminho onde o arquivo txt acima está localizado na linha onde setwd está localizado no código R.
3. Abra o software R e execute o código R modificado (NomoR). Use os pacotes de software "survival", "regplot" e "rms" para dados de expressão TMEM200A em GC e dados clínicos para construir um modelo prognóstico para predizer a sobrevida do paciente.

19. Cultura celular e transfecção de siRNA de TMEM200A

NOTA: Células humanas STAD HGC-27, células SGC-7901 e células GES-1 epiteliais da mucosa gástrica humana foram obtidas comercialmente (ver Tabela de Materiais), revividas, inoculadas em meio completo Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 (contendo 10% de soro fetal fetal bovino e 1% de mistura de penicilina) e cultivadas a 37 °C em um CO₂ a 5% incubadora de cultura celular. O meio de cultura foi trocado a cada 2-3 dias. As células em boas condições de crescimento foram inoculadas em placas de seis poços de acordo com (2-3) ×^{10 5} células por poço.

1. Primeiro, pegue três tubos de microcentrífuga e adicione 8 μL de reagente de transfecção (verT capaz de Materiais) e 200 μL de meio basal a cada tubo. Em seguida, adicione 4 μg de SiRNA1, SiRNA2 e SiRNA3 a cada tubo, respectivamente.
   NOTA: Para TMEM200A knockdown, o siRNA foi projetado e comprado (consulte a Tabela de Materiais).
2. Misture bem a mistura nos três tubos de microcentrífuga e adicione a cada um dos três poços da placa de 6 poços. Agite suavemente a placa de 6 poços para distribuir a mistura uniformemente. Rotular os três poços onde a mistura foi adicionada como SiRNA-1, SiRNA-2 e SiRNA-3.
3. Quando as células tiverem sido incubadas por 4-6 h, substitua metade do meio nos três sub-poços na placa de 6 poços.
   OBS: Ao substituir metade do meio completo, aspirar metade do meio completo original e reabastecer com metade do meio completo fresco.
4. Vinte e quatro a 48 h depois, utilizar TMEM200A células transfectadas com siRNA como grupo experimental e células não transfectadas como grupo controle negativo. Realizar uma reação quantitativa em cadeia da polimerase em tempo real (qRT-PCR, ver secção 20) para avaliar o efeito da transfecção nas células.

20. Reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real

1. Descarte o meio de cultura celular em cada subgrupo e lave suavemente as células duas vezes com 1 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS).
2. Isolar o RNA total usando um kit de isolamento de RNA (consulte a Tabela de Materiais).
3. Estimar a concentração de RNA e sintetizar cDNA com 1 μg de RNA usando um kit de síntese de cDNA, seguindo as instruções do fabricante.
4. Realizar PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR) em diluições de 10 vezes de cDNA em 10 μL de mistura de reação, incluindo primers forward e reverse específicos para humanos para GAPDH (para padronização), TMEM200A (consulte a Tabela de Materiais) e qPCR Master Mix, usando o Real-Time PCR Assay System.
   NOTA: Realizar cada experimento em triplicata.
5. Use as seguintes condições de reação qPCR: inicialização, 95 °C por 3 min; desnaturação, 95 °C por 10 s; recozimento, 60 °C por 30 s; e extensão, 80 °C por 10 s; Repita a desnaturação, recozimento e extensão 40x. Determinar a expressão relativa de cada gene utilizando a técnica ^{2-ΔΔCt 28}.
6. Repetir os experimentos pelo menos três vezes para obter triplicatas biológicas.

21. Detecção de Western blot da expressão proteica relevante

1. Descarte o meio de cultura celular em cada subgrupo e lave suavemente as células com 2 x 1 mL de PBS.
2. Resfriar as placas de 6 poços contendo as células no gelo e adicionar 150 μL de tampão de lise pré-resfriado do ensaio de precipitação por rádio imune (RIPA) (150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100, 0,5% desoxicolato de sódio, 0,1% SDS, 50 mM Tris-HCl pH 8,0 e coquetel inibidor de protease recém-adicionado). Deixe a lise prosseguir no gelo por 10 min.
3. Utilizando um raspador de células de plástico, remova as células aderentes do prato e transfira delicadamente a solução celular para um tubo de microcentrífuga que foi pré-resfriado.
4. Centrifugar o lisado celular durante 10 min a 1,5 × 10⁴ g a 4 °C. Transfira o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
5. Utilize um kit de ensaio de proteína BCA para determinar o teor de proteína de acordo com as instruções do fabricante.
6. Carregar 30 g de proteína de cada amostra em um gel de eletroforese em gel de poliacrilamida de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio a 10% (SDS-PAGE) e executar a 80 V por 0,5 h seguido de 1,5 h a 120 V.
7. Transferir as proteínas do gel para uma membrana de difluoreto de polivinilideno (PVDF) de 45 μm a uma tensão de 300 mA por 1-1,5 h.
8. Depois de colocar a membrana de PVDF em um agitador e agitá-la por 3 x 5 min, adicione solução salina tamponada com Tris com Tween 20 (TBST, Tris-HCl 20 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM e Tween 20 0,1%) ao recipiente apropriado com o lado da proteína (lado do gel) voltado para cima.
9. Coloque a membrana no tampão de bloqueio (ver Tabela de Materiais) e incube-a durante 0,5 h à temperatura ambiente.
10. Lave a membrana com TBST por 3 x 10 min.
11. Incubar a membrana com anticorpos primários contra fosfo-AKT (p-AKT; 1:1.000), AKT total 1:1.000, E-caderina (E-ca; 1:1.000), N-caderina (N-ca; 1:1.000), Vimentina 1:1.000, caracol 1:1.000, TMEM200A 1:1.000, gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH; 1:1.000), durante a noite a 4 °C.
12. Lave a membrana por 3 x 10 min e incube a membrana com um anticorpo secundário de coelho ou camundongo (1:5.000) por 1 h à temperatura ambiente.
13. Incubar a membrana de PVDF com substrato ECL por 30 s e detectar o sinal usando um sistema de imagem.

22. Ensaio CCK-8

1. Sementes humanas STAD HGC-27 em boas condições de crescimento em placas de 96 poços.
2. Quando a densidade celular atingir 60-70%, transfectar as células com TMEM200A siRNA (como no passo 19.3).
3. Semeando as células transfectadas em placas de 96 poços a uma densidade celular de 5 × 10 ³/poço (contar células viáveis usando um contador de células), divididas em grupos NC e TMEM200A siRNA (com três poços replicados em cada grupo) e incubadas a 37 °C.
4. Adicionar o reagente CCK-8 após 0, 24, 48, 72 e 96 h e incubar a 37 °C por 2 h. Medir a absorbância (450 nm) usando um rotulador enzimático multifuncional.

Resultados

Expressão de TMEM200A em vários tipos de câncer
Como ilustrado na Figura 1, primeiramente analisamos os níveis de expressão diferencial de TMEM200A em vários cânceres através de diferentes bancos de dados. TMEM200A expressão foi elevada no colangiocarcinoma (CHOL), carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço (HNSC), carcinoma de células claras renal (KIRC), carcinoma de células papilíferos renais (KIRP), carcinoma ...

Discussão

TMEM200A pertence a uma família de TMEMs que é essencial para que as células cancerosas proliferem³⁸. A expressão variável de TMEM200A em diferentes neoplasias malignas tem recebido menos atenção, e uma investigação completa do pan-câncer está faltando. No entanto, evidências continuam a se acumular, mostrando que a família de proteínas transmembrana TMEM pode ser importante na manutenção de células cancerosas malignas por meio de interações com várias proteí...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-AKT antibody	Proteintech Group, Inc	60203-2-Ig
Anti-E-cadherin antibody	Proteintech Group, Inc	20874-1-AP
anti-glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) antibody	Proteintech Group, Inc	10494-1-AP
Anti-N-cadherin antibody	Proteintech Group, Inc	22018-1-AP
Anti-P-AKT antibody	Proteintech Group, Inc	66444-1-Ig
Anti-snail antibody	Proteintech Group, Inc	13099-1-AP
Anti-Vimentin antibody	Proteintech Group, Inc	10366-1-AP
AxyPrepMultisourceTotalRNAMini- prep Kit	Suzhou Youyi Landi Biotechnology Co., Ltd	UEL-UE-MN-MS-RNA-50G
BCA Protein Assay Kit	Epizyme Biotech	ZJ101L
CCK-8 reagent	MedChemExpress	HY-K0301-500T
Fetal bovine serum (FBS)	CYAGEN BIOSCIENCES (GUANGZHOU) INC	FBSSR-01021
GAPDH primer	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.		Forward primer (5’-3’): TGACATCAAGAAGGTG GTGAAGCAG; Reverse primer (5’-3’): GTGTCGCTGTTGAAG TCAGAGGAG
HighGene plus Transfection reagent	ABclonal	RM09014P
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse lgG (H+L)	Proteintech Group, Inc	SA00001-1
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit lgG (H+L)	Proteintech Group, Inc	SA00001-2
Human gastric mucosal epithelial GES-1 cells	Guangzhou Cellcook Biotech Co.,Ltd.
Human STAD HGC-27 cells	Procell Life Science&Technology Co.,Ltd
Human STAD SGC-7901 cells	Procell Life Science&Technology Co.,Ltd
MonAmp SYBR Green qPCR Mix (None ROX)	Mona (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd	MQ10101S
MonScript RTIII All-in-One Mix with dsDNase	Mona (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd	MR05101M
Omni-ECL Femto Light Chemiluminescence Kit	Epizyme Biotech	SQ201
PAGE Gel Fast Preparationb Kit	Epizyme Biotech	PG111
Penicillin-streptomycin (Pen-Strep)	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd	P1400-100
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane	Merck KGaA	IPVH00010-1
Protein Free Rapid Blocking Buffer	Epizyme Biotech	PS108P
RIPA lysis solution	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd	R0010
RPMI 1640 complete medium	Thermo Fisher Scientific	C11875500BT
Skimmed milk	Campina: Elk
TBST buffer solution	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd	T1082
The protein loading buffer	Epizyme Biotech	LT101S
TMEM200A knockdown plasmid	MiaoLing Plasmid
TMEM200A primer	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.		Forward primer (5’-3’): AAGGCGGTGTGGTGGTTCG; Reverse primer (5’-3’): GATTTTGGTCTCTTTGTCACGGTT
TMEM200A SiRNA1	MiaoLing Plasmid		Forward primer (5’-3’): ACAACTGATGATAAGACCAG; Reverse primer (5’-3’): TGTTGACTACTATTCTGGTC
TMEM200A SiRNA2	MiaoLing Plasmid		Forward primer (5’-3’): CGTGTGAATGTCAATGACTG; Reverse primer (5’-3’): GCACACTTACAGTTACTGAC
TMEM200A SiRNA3	MiaoLing Plasmid		Forward primer (5’-3’): ACAACCACAACATCTGCCCG; Reverse primer (5’-3’): TGTTGGTGTTGTAGACGGGC
Transmembrane protein 200A Antibody	Proteintech Group, Inc	48081-1
Equipment
CO2 cell culture incubator	Haier Group	PYXE-80IR
Electrophoresis instrument	Bio-RAD
Fluorescence quantitative PCR instrument	Bio-RAD
Gel Imaging System (Tanon 5200)	Tanon Science & Technology Co., Ltd	LAB-0002-0007-SHTN
Multifunctional Enzyme Labeler	Berthold