범암 바이오마커로서의 TMEM200A 의 멀티오믹스 분석

요약

여기에서는 암에서 TMEM200A 의 생물학적 기능을 연구하기 위해 여러 생물 정보학 도구를 결합한 프로토콜을 제시합니다. 또한 생물정보학 예측을 실험적으로 검증합니다.

초록

막관통 단백질인 TMEM200A는 인간의 암 및 면역 침윤과 관련이 있는 것으로 알려져 있습니다. 여기서는 멀티오믹스 분석을 통해 일반 암에서 TMEM200A 의 기능을 평가하고, 그 결과를 확인하기 위해 위세포의 시험관 내 세포 배양을 이용하였다. 여러 인간 암 유형에서 TMEM200A 의 발현은 UCSC Xena 데이터베이스의 RNA-seq 데이터를 사용하여 평가되었습니다. 생물정보학 분석은 진단 및 예후 바이오마커로서 TMEM200A 의 잠재적인 역할을 밝혀냈습니다.

정상 위 및 암 세포주의 배양액을 배양하고 TMEM200A 녹다운했습니다. TMEM200A 의 발현 수준은 정량적 실시간 중합효소 연쇄 반응 및 웨스턴 블로팅을 사용하여 측정되었습니다. 그런 다음 체외 기능 상실 연구를 사용하여 위암(GC) 세포의 악성 행동 및 종양 형성에서 TMEM200A 의 역할을 결정했습니다. 웨스턴 블롯은 GC의 상피-중간엽 전이(EMT) 및 PI3K/AKT 신호 전달 경로에 대한 녹다운의 효과를 평가하는 데 사용되었습니다. 생물정보학 분석은 TMEM200A 가 GC에서 높은 수준으로 발현되었음을 보여주었습니다.

GC 세포의 증식은 TMEM200A 녹다운(knockdown)에 의해 억제되었으며, 이는 또한 비멘틴, N-cadherin 및 Snai 단백질을 감소시키고 AKT 인산화를 억제했습니다. PI3K/AKT 신호전달 경로는 GC 발달의 TMEM200A 매개 조절에도 관여하는 것으로 나타났다. 여기에 제시된 결과는 TMEM200A 가 EMT에 영향을 미쳐 종양 미세환경을 조절한다는 것을 시사합니다. TMEM200A 는 또한 PI3K/AKT 신호전달을 통해 EMT에 영향을 미쳐 종양 미세환경에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 범암, 특히 GC에서 TMEM200A 는 잠재적인 바이오마커 및 종양유전자가 될 수 있습니다.

서문

암은 전 세계적으로 높은 이환율과 사망률^{로 인해 전}세계적으로 인간의 건강을 위협하는 지속적인 공중 보건 문제로 부상하고 있으며1 사회에 막대한 재정적, 의료적 부담을 주고 있다². 암 표지자(cancer marker)³의 발견 덕분에 최근 몇 년 동안 암 치료의 상당한 발전이 이루어졌으며, 연구자들은 암 치료를 위한 새로운 진단 방법과 신약을 개발했습니다. 그러나 일부 암 환자는 약물 내성, 약물 부작용, 화학적 민감성 등의 요인으로 인해 예후가 좋지 않다⁴. 따라서 초기 암의 스크리닝과 치료를 위한 새로운 바이오마커 식별이 시급하다⁵.

막 단백질은 세포와 세포소기관막에 결합하고 통합할 수 있는 단백질이다⁶. 이들은 막에 대한 결합 강도와 그 위치에 따라 지질 고정 단백질, 통합 단백질 및 말초 막 단백질의 세 가지 범주로 그룹화 할 수 있습니다 ^7,8. 막관통(TMEM) 단백질은 적어도 하나의 막관통 세그먼트(⁹)로 구성되는 일체형 막 단백질로서, 생체막을 완전히 또는 부분적으로 통과한다.

TMEM 계열에 속하는 단백질의 작용 기전은 잘 알려져 있지 않지만, 이러한 단백질은 여러 유형의 암에 관여하는 것으로 알려져 있다¹⁰. 몇몇 TMEM 단백질은 이동성, 증식성 및 침습성 표현형과 연관되어 있으며, 이들의 발현은 종종 환자의 예후와 관련이 있다¹¹. 따라서 TMEM 가족 구성원이 연구 대상이 되었습니다. TMEM에 대한 기존 보고를 종합적으로 검토한 결과, TMEM은 대부분 세포간 및 세포내 신호전달¹², 면역 관련 질환 및 종양형성¹⁰과 관련이 있는 것으로 나타났다. 많은 TMEM은 또한 중요한 생리학적 기능, 예를 들어 원형질막의 이온 채널, 신호 전달 경로의 활성화, 세포 화학주성의 중재, 접착, 세포자멸사 및 자가포식¹⁰을 가지고 있습니다. 따라서 TMEM 단백질이 종양의 발견 및 치료에 중요한 예후 표지자가 될 수 있다는 가설을 세웠습니다.

TMEM200A 발현은 위암(GC)에서 현저히 증가합니다. 6q23.1 염색체에 8개의 엑손이 있고 전체 길이가 77.536kb인 TMEM200A¹³의 더 높은 발현은 GC의 경우 전체 생존(OS)에 대한 나쁜 예후와 관련이 있습니다. 그러나 종양학 연구에서 발현의 변화는 거의 보고되지 않았습니다. 이 기사에서는 공개적으로 사용 가능한 다양한 데이터 세트를 사용하여 다양한 암 연구에서 치료 표적 및 종양 진단 마커로서의 TMEM200A 의 유용성을 비교하고 분석합니다. 우리는 UCSC Xena 및 TCGA 데이터베이스의 RNA-seq 데이터와 실시간 정량적 중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR) 및 웨스턴 블로팅을 사용하여 다양한 인간 암 유형에서 발현 수준뿐만 아니라 범암 진단 및 예후 바이오마커로서의 TMEM200A 의 효과를 평가했습니다.

TMEM200A 발현 수준이 돌연변이 비율, 조절 과정, 종양 진단 및 예후, 면역 침윤 및 면역 요법에 미치는 영향은 계산 도구와 데이터 세트 웹 사이트를 혼합하여 추가로 조사되었습니다. CBioPortal 및 COSMIC(Catalog of Somatic Mutations in Cancer Cells) 데이터베이스를 사용하여 TMEM200A의 돌연변이를 조사했습니다. Sangerbox와 TISIDB 웹사이트는 TMEM200A 면역 침윤에 어떤 영향을 미치는지 이해하기 위해 활용되었습니다. 종양 면역 단일 세포 센터(TISCH) 온라인 도구와 CancerSEA 데이터베이스를 사용하여 TMEM200A의 기능을 조사했습니다. 마지막으로, GC 세포의 악성 거동 및 종양 발달 기능에 대한 TMEM200A의 영향을 평가하기 위해 in vitro assay에서 기능 상실 실험을 수행했습니다. 또한 녹다운이 GC의 PI3K/AKT 신호 경로와 상피-중간엽 전이(EMT)에 어떤 영향을 미치는지 평가하기 위해 웨스턴 블로팅TMEM200A 수행했습니다.

프로토콜

1. 암 게놈 아틀라스(TCGA) 데이터베이스

참고: TCGA(Cancer Genome Atlas) 데이터베이스에는 서로 다른 종양 조직에 있는 유전자의 염기서열 분석 데이터가 포함되어^{있다 14}. TPM(part per million) 형식당 TMEM200A 전사체 연구를 위한 TCGA의 RNA-seq 데이터는 UCSC Xena 웹사이트¹⁵ (https://xenabrowser. net/datapages/)에서 추출하고 샘플 간의 발현을 비교하기 위해 변환된 log2를 추출했습니다.

1. UCSC Xena 웹 사이트 인터페이스로 이동합니다.
2. Launch Xena 탭을 클릭합니다.
3. 화면 상단의 DATA SETS 탭을 클릭합니다.
4. 이 페이지의 129개 코호트와 1,571개의 데이터 세트에서 탭을 클릭하면 GDC TCGA 급성 골수성 백혈병(LAML), GDC TCGA 부신피질암(ACC), GDC TCGA 담관암(CHOL) 등과 같은 총 33개의 암을 볼 수 있습니다.
5. 유전자 발현 RNAseq 메뉴에서 HTSeq - FPKM GDC Hub 탭을 선택하고 클릭합니다.
   참고: HTSeq - FPKM GDC Hub 는 동의에 의해 수정된 데이터를 나타냅니다.
6. 다운로드 메뉴에서 해당 링크를 클릭하십시오.
   참고: 위의 방법으로 33개의 서로 다른 암 유형에 대한 RNA-Seq 데이터를 다운로드했습니다.
7. 33가지 암 유형에 대한 RNA-seq 데이터의 zip 아카이브를 컴퓨터의 바탕 화면 폴더에 있는 단일 파일로 압축을 풉니다.
8. 압축을 푼 txt 파일을 동일한 폴더에 통합하고 Perl 스크립트를 이 폴더에 배치합니다.
9. Perl 소프트웨어를 열고 폴더 경로를 복사하여 마우스 커서가 있는 Perl 소프트웨어에 붙여넣고 Enter 키를 누르고 Perl 코드 이름과 유전자 이름(TMEM200A)을 입력한 다음 Enter 키를 눌러 새 txt 파일(singleGeneExp.txt)을 가져옵니다.
   참고: 이 새로운 txt 파일(singleGeneExp.txt)에는 다른 환자의 33개 암에서 TMEM200A 의 유전자 발현이 포함되어 있습니다.
10. R 코드(diffR)를 열고 singleGeneExp.txt 파일이 있는 경로를 복사하여 R 코드에서 setwd 가 있는 줄에 붙여넣습니다.
11. R 소프트웨어를 열고 수정된 R 코드(diffR)를 실행하고 "ggpubr" 패키지를 통해 그림을 그립니다.

2. TIMER2.0 데이터베이스

1. TIMER2.0 (http://timer.cistrome.org) 데이터베이스 ¹⁶ 웹 사이트 인터페이스로 이동합니다.
2. Cancer Exploration(암 탐사) 탭을 클릭합니다.
3. 검색 상자에 유전자 ID(TMEM200A)를 입력하고 제출 탭을 클릭하여 다양한 유형의 종양에서 TMEM200A 의 차등 발현 이미지를 가져옵니다.

3. 인간 단백질 아틀라스(HPA)

1. Human Protein Atlas (HPA) (www.proteinatlas.org) ¹⁷웹 인터페이스로 이동합니다.
2. 검색 상자에 ID(TMEM200A)를 입력하고 검색 버튼을 클릭합니다. TISSUE 하위 아틀라스를 선택합니다.
3. 페이지 위로 마우스를 가져가 아래로 스크롤하여 Protein Expression Overview(단백질 발현 개요 ) 탭을 찾습니다.
   참고: 단백질 발현 개요 섹션은 인체의 45개 기관에서 TMEM200A 의 단백질 발현 수준을 보여줍니다.

4. HumanMethylation450 Illumina 인피늄 DNA 메틸화 플랫폼 배열

참고: HumanMethylation450 Illumina Infinium DNA 메틸화 플랫폼 어레이를 사용하여 메틸화에 대한 데이터를 수집했습니다. SMART (http://www.bioinfo-zs.com/smartapp/) 데이터베이스¹⁸을 사용하여 TMEM200A DNA 메틸화 수준을 평가할 수 있다.

1. SMART로 이동 web사이트 인터페이스.
2. 검색 상자에 유전자 ID(TMEM200A)를 입력하여 염색체의 TMEM200A 분포와 다양한 유형의 악성 종양에서 TMEM200A의 메틸화 수준을 얻습니다.
3. 페이지를 아래로 스크롤하여 Click to check CpG-aggregated methylation 메뉴로 이동하고 Plot 버튼을 클릭합니다. 페이지 하단에서 Figure 다운로드 버튼을 찾아 클릭합니다. 그림을 다운로드합니다.

5. UALCAN 데이터베이스

1. UALCAN 웹 사이트 인터페이스로 이동합니다.
   참고: 다양한 악성 종양에서 TMEM200A 프로모터 메틸화 수준의 상자 플롯은 UALCAN 데이터베이스(http://ualcan.path.uab.edu/analysisprot.html)¹⁹를 통해 생성되었습니다
2. 페이지 상단에서 TCGA 버튼을 클릭합니다.
3. 화면의 Gene ID 입력 상자에 TMEM200A 입력합니다. TCGA 데이터셋 메뉴에서 아래로 스크롤하여 쿼리할 암 유형을 선택합니다.
4. 탐색(Explore) 버튼을 클릭한 후 분석을 위한 링크(Links for analysis) 메뉴에서 하위 그룹 분석 메틸화(Methylation)를 클릭하면 이 종양의 메틸화 결과를 얻을 수 있습니다.
   참고: 이 방법을 통해 UALCAN 데이터베이스에서 22개의 종양에 대한 메틸화 결과를 얻었습니다.

6. 암세포의 체세포 돌연변이 카탈로그(COSMIC) 데이터베이스

1. Catalog of Somatic Mutations in Cancer Cells (COSMIC) 웹사이트 인터페이스로 이동합니다.
   참고: 인간 게놈의 코딩 돌연변이, 비코딩 돌연변이 게놈 재배열 및 융합 유전자에 대한 데이터는 다양한 암에서 다양한 TMEM200A 돌연변이의 빈도를 결정하는 데에도 사용되는 COSMIC(Catalog of Somatic Mutations in Cancer Cells) 데이터베이스²⁰(https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic/)에서 사용할 수 있습니다.
2. 검색창에 유전자 ID(TMEM200A)를 입력하고 SEARCH 버튼을 클릭하면 새 화면으로 이동합니다.
3. 유전자 메뉴에서 TMEM200A의 유전자 ID 이름이 나타나는 링크를 찾아 클릭합니다.
4. 새 페이지에서 돌연변이 분포 그룹화 열을 찾아 종양 TMEM200A 의 돌연변이 상태를 가져옵니다.

7. CBio포털

1. CBioPortal 웹 사이트 인터페이스로 이동합니다.
   참고: 암 유전체학 데이터는 cBioPortal(www.cioportal.org) 데이터베이스를 사용하여 검색, 다운로드, 분석 및 시각화할 수 있습니다. 체세포 돌연변이, DNA 복제 수 변화(CNA), mRNA 및 microRNA(miRNA) 발현, DNA 메틸화, 단백질 풍부도 및 인단백질 풍부도는 cBioPortal²¹에 의해 통합된 게놈 데이터 유형 중 일부에 불과합니다. cBioPortal을 사용하면 광범위한 연구를 수행할 수 있습니다. 그러나 주요 강조점은 돌연변이 및 그 시각화와 관련된 다양한 분석입니다.
2. 시각화 및 분석을 위한 연구 선택 섹션의 PanCancer Studies 하위 섹션에서 전체 게놈의 Pan-cancer 분석 데이터 세트를 선택합니다. 그런 다음 Query By Gene 버튼을 클릭합니다.
3. 유전자 입력(Enter Genes)의 질의란에 타겟 유전자 ID(TMEM200A)를 입력합니다. Submit Query(쿼리 제출) 버튼을 클릭합니다.
4. 페이지 상단의 Cancer Type Detailed 버튼을 클릭하면 다양한 유형의 암에서 TMEM200A 의 돌연변이를 얻을 수 있습니다.

8. Sangerbox 3.0 도구

1. Sangerbox 3.0 도구 인터페이스로 이동합니다.
   참고: 모든 암에서 면역 침윤 세포, 면역억제제, 면역자극 인자 및 MHC 분자(주요 조직적합성 복합체)와 TMEM200A 발현의 상관관계는 Sangerbox 3.0 도구²² (http://vip.sangerbox.com/)의 범암 면역 침윤 데이터를 사용하여 CIBERSORT 면역 침윤으로 분석되었습니다.
2. 페이지 왼쪽의 도구 모음에서 Pan-Cancer Analysis(범암 분석) 메뉴의 Immunocellular Analysis (CIBERSORT)(면역세포 분석(CIBERSORT)) 탭을 선택하고 클릭합니다.
3. 유전자 입력(Enter Genes)의 질의란에 타겟 유전자 ID(TMEM200A)를 입력합니다. 제출 버튼을 클릭합니다.

9. TISIDB 데이터베이스

1. TISIDB 웹 사이트 인터페이스로 이동합니다.
   참고: TISIDB 데이터베이스²³ (http://cis.hku.hk/TISIDB/)은 다양한 암에서 면역 침윤 세포, 면역억제제, 면역 자극 인자 및 MHC 분자와 TMEM200A 발현의 상관관계를 조사하기 위해 사용되었습니다.
2. Enter Genes의 질의란에 Target Gene Symbol(TMEM200A)을 입력합니다. 제출 버튼을 클릭합니다.
3. 페이지 상단의 Lymphocytes, Immunomodulators, Chemokines 및 Subtype 섹션을 클릭합니다. 페이지 하단에서 관련 이미지를 다운로드하십시오.

10. TIDE 데이터베이스

1. TIDE 웹사이트 인터페이스로 이동합니다.
   참고: TIDE 데이터베이스(http://tide.dfci.harvard.edu/)는 종양 면역 관문 차단 요법에 대한 반응을 예측하기 위한 바이오마커로서 TMEM200A 의 잠재력을 평가하는 데 사용되었습니다.
2. 초기 화면에서 이메일 주소를 입력하여 계정을 등록하고 로그인합니다.
3. 페이지 상단에서 Biomarker Evaluation 하위 섹션을 찾아 클릭합니다.
4. 페이지 하단의 Enter Genes(유전자 입력)에 대한 쿼리 상자에 대상 유전자 ID(TMEM200A)를 입력합니다. 그런 다음 제출 버튼을 클릭합니다.
5. 페이지에서 마우스를 끌어 페이지를 아래로 밀어 분석 결과를 찾습니다.

11. CancerSEA 데이터베이스

1. CancerSEA 웹 사이트 인터페이스로 이동합니다.
   참고: 단일 세포 염기서열 분석 데이터를 사용하여 TMEM200A 발현과 다른 종양 세포의 기능적 상태 간의 관계를 조사했습니다. 이것은 CancerSEA 데이터베이스²⁴ (http://biocc.hrbmu.edu.cn/CancerSEA/)를 사용하여 수행되었습니다.
2. 페이지 상단에서 검색 탭을 찾아 클릭합니다.
3. 유전자 입력(Enter Genes)의 질의란에 타겟 유전자 ID(TMEM200A)를 입력합니다. 제출 버튼을 클릭합니다.

12. 종양 면역 단세포 센터(TISCH) 네트워크 도구

1. 종양 면역 단일 세포 센터(TISCH) 네트워크 도구 웹 사이트 인터페이스로 이동합니다.
   참고: TMEM200A 와 암세포의 발현 수준 사이의 상관관계는 또한 종양 면역 단일세포 센터(TISCH) 네트워크 도구(²⁵)를 사용하여 나타내었다.
2. 유전자 입력(Enter Genes)의 질의란에 타겟 유전자 ID(TMEM200A)를 입력합니다. 탐색 버튼을 클릭합니다.
3. 이 페이지의 암 유형 메뉴에서 모든 암 데이터 세트를 선택하고 클릭합니다. 그런 다음 페이지를 아래로 스크롤하고 검색 버튼을 클릭합니다.

13. 진매니아

1. GeneMANIA 웹 사이트 인터페이스로 이동합니다.
   참고: TMEM200A와 기능적으로 관련된 유전자 사이의 상관관계는 유전자-유전자 상호작용(GGI) 네트워크 구축을 위한 유전자 다중 연관 네트워크 웹사이트 GeneMANIA (www.genemania.org)²⁶에 대한 통합 전략을 사용하여 예측되었습니다.
2. 페이지 왼쪽 상단의 검색 상자에 유전자 ID(TMEM200A)를 입력하고 검색 도구를 클릭합니다.
   참고: GeneMANIA 웹 도구를 사용하여 TMEM200A와 관련된 20개의 유전자를 찾았습니다.

14. 기능적 농축 분석

1. 농축을 위해 분석할 유전자의 심볼 ID를 txt 파일 형식으로 저장합니다.
2. R 코드(symbolidR)를 열고 위의 txt 파일이 있는 경로를 복사하여 R 코드에서 setwd 가 있는 줄에 붙여넣습니다.
3. R 소프트웨어를 열고 수정된 R 코드(symbolidR)를 실행합니다. 이러한 유전자의 심볼 ID를 "org. Hs.eg.db" 패키지. id.txt 파일을 가져옵니다.
4. R 코드(GOR 및 KEGGR)를 열고 id.txt 파일이 있는 경로를 복사하여 R 코드에서 setwd 가 있는 줄에 붙여넣습니다.
5. R 소프트웨어를 열고 수정된 R 코드(GOR 및 KEGGR)를 실행합니다. 이 프로토콜을 따르려면 "clusterProfiler", "org. Hs.eg.db", "enrichplot"을 사용하고 "gglot2" 패키지를 사용하여 보강 결과를 플로팅합니다.

15. 유전자 활성의 차이 분석

참고: 각 암 검체의 TMEM200A 점수는 ssGSEA(single-sample gene set enrichment analysis)²⁷를 사용하여 계산하였으며, 다양한 암에 대해 암성 및 건강한 조직에서의 TMEM200A 유전자 활성도의 차등 분석을 수행하였다.

1. 1.7단계에서 다운로드한 33개 종양 유형의 RNA-seq 데이터를 기반으로 다운로드한 모든 파일의 압축을 풀고 통합 폴더에 넣습니다.
2. 위의 폴더에 merge.txt 파일을 넣습니다.
   참고: BioWolf(www.biowolf.cn)의 merge.txt 파일 데이터에는 TCGA(Cancer Genome Atlas) 데이터베이스의 모든 종양에 있는 모든 환자의 유전자 발현이 포함되어 있습니다.
3. R 코드(ssGSEAR)를 열고 위 폴더가 있는 경로를 복사하여 R 코드에서 setwd 가 있는 줄에 붙여넣습니다.
4. R 코드(ssGSEAR)에서 geneName이 있는 줄을 선택하고 유전자 ID(TMEM200A)를 입력합니다.
5. R 소프트웨어를 열고 수정된 R 코드(ssGSEAR)를 실행합니다. 유전자 활동에 대한 채점 파일 가져오기: scores.txt.
   NOTE: ssGSEA 알고리즘을 사용하여 먼저 merge.txt 파일에 제공된 데이터에 따라 유전자 간 상관 계수를 기반으로 유전자 세트 파일을 구성하고 파일에서 대상 유전자(TMEM200A)와 상관 관계가 더 높은 유전자를 식별합니다. 그런 다음 상관 관계가 높은 유전자를 TMEM200A의 활성 유전자로 통합하고 마지막으로 각 샘플에서 활성 유전자의 점수를 얻습니다.
6. R 코드(scoreDiffR)를 열고 scores.txt 파일이 있는 경로를 복사하여 R 코드에서 setwd 가 있는 줄에 붙여넣습니다.
7. R 소프트웨어를 열고 수정된 R 코드(scoreDiffR)를 실행하고 "plyr", "reshape2" 및 "ggpubr" 패키지를 통해 그림을 그립니다.

16. 임상병리학적 상관관계 및 생존예후 분석

1. UCSC Xena 웹 사이트 인터페이스로 이동합니다.
2. Launch Xena(Xena 실행) 탭을 클릭합니다.
3. 화면 상단의 DATA SETS 탭을 클릭합니다.
4. 페이지 위로 마우스를 가져간 후 아래로 스크롤하여 TCGA Pan-Cancer(PANCAN) 탭을 찾습니다.
5. 이 페이지의 129개 코호트와 1,571개 데이터 세트에서 TCGA Pan-Cancer (PANCAN) 탭을 클릭합니다.
6. 표현형 메뉴에서 큐레이팅된 임상 데이터 탭을 선택하고 클릭합니다.
7. 다운로드 메뉴에서 해당 링크를 클릭하십시오.
   참고: 위 링크의 TCGA 데이터베이스에서 33개 암에 대한 임상 데이터를 다운로드하십시오.
8. 다운로드한 임상 데이터 파일의 압축을 풀고 압축을 푼 파일을 xls 파일 형식으로 엽니다.
9. 필요한 임상 데이터(병기, 나이, 병기, 환자 상태)를 파일에 정리하여 보관하고, 불필요한 나머지 임상 데이터는 삭제하고, 파일 이름을 임상으로 변경한 후 전체 파일을 txt 형식의 파일로 저장합니다.
10. 1.9단계에서 얻은 singleGeneExp.txt 기반으로 이 파일을 구성된 clinical.txt 파일과 동일한 폴더에 넣습니다.
11. 다운로드한 임상 데이터의 압축을 풀고 singleGeneExp.txt 및 clinical.txt 파일을 압축을 푼 임상 파일과 동일한 폴더에 넣습니다.
12. R 코드(clinicalDiffR)를 열고 위의 폴더가 있는 경로를 복사하여 R 코드에서 setwd 가 있는 줄에 붙여넣습니다.
13. R 소프트웨어를 열고, 수정된 R 코드(clinicalDiffR)를 실행하고, "ggpubr" 패키지를 사용하여 그림을 그립니다.
14. UCSC Xena 웹 사이트 인터페이스로 이동합니다.
15. Launch Xena(Xena 실행) 탭을 클릭합니다.
16. 화면 상단의 DATA SETS 탭을 클릭합니다.
17. 이 페이지의 129개 코호트와 1,571개의 데이터 세트에서 탭을 클릭하면 GDC TCGA 급성 골수성 백혈병(LAML), GDC TCGA 부신피질암(ACC), GDC TCGA 담관암(CHOL) 등과 같은 총 33개의 암을 볼 수 있습니다.
18. 표현형 메뉴에서 생존 데이터 탭을 선택하고 클릭합니다.
19. 다운로드 메뉴에서 해당 링크를 클릭하십시오.
20. 33가지 암 유형에 대한 생존 데이터의 zip 아카이브를 컴퓨터의 바탕 화면 폴더에 있는 단일 파일로 압축을 풉니다.
21. 압축을 푼 생존 데이터를 1.9단계에서 얻은 singleGeneExp.txt 파일과 동일한 폴더에 넣습니다.
22. R 코드(preOSR)를 열고 위의 폴더가 있는 경로를 복사하여 R 코드에서 setwd가 있는 줄에 붙여넣습니다.
23. R 소프트웨어를 열고 수정된 R 코드(preOSR)를 실행합니다. "limma" 패키지를 통해 계산하여 범암에서 TMEM200A 의 생존에 대한 데이터 파일을 얻습니다 expTime.txt.
24. R 코드(OSR)를 열고 expTime.txt 파일이 있는 경로를 복사하여 R 코드에서 setwd 가 있는 줄에 붙여넣습니다.
25. R 소프트웨어를 열고 수정된 R 코드(OSR)를 실행합니다. expTime.txt 파일의 데이터를 기반으로 "survival" 및 "survminer" 패키지를 사용하여 KM 분석을 수행하고 범암 TMEM200A에 대한 생존 곡선을 플로팅합니다.

17. 산림 플롯 구성을 사용한 일변량 및 다변량 Cox 회귀 분석

1. R 코드(COXR)를 열고 16.23에서 expTime.txt 파일을 가져온 경로를 복사하여 R 코드에서 setwd가 있는 줄에 붙여넣습니다.
2. R 소프트웨어를 열고 수정된 R 코드(COXR)를 실행합니다. expTime.txt 파일의 데이터를 기반으로 "survival", "survminer" 및 "forestplot" 패키지를 사용하여 일변량 COX 회귀 분석을 수행하여 다양한 암의 TMEM200A 에 대한 일변량 -숲 플롯을 플로팅합니다.
3. 16.23단계의 expTime.txt 파일과 16.10단계의 clinical.txt 파일을 동일한 폴더에 넣습니다.
4. R 코드(multicoxR)를 열고 16.23단계의 expTime.txt 파일과 16.10단계의 clinical.txt 파일이 포함된 폴더가 있는 경로를 복사하여 R 코드에서 setwd 가 있는 줄에 붙여넣습니다.
5. R 소프트웨어를 열고 수정된 R 코드(multicoxR)를 실행합니다. "survival" 및 "survminer" 패키지를 사용하여 다변량 COX 회귀 분석을 수행하여 expTime.txt 및 clinical.txt 파일의 데이터를 기반으로 다양한 암의 TMEM200A에 대한 다변량 포레스트 플롯을 플로팅합니다.

18. TMEM200A 발현 및 임상적 특징에 따른 위암의 예후 모델

1. 16.10단계의 clinical.txt 파일과 16.23단계의 expTime.txt 파일을 같은 폴더에 넣습니다.
2. R 코드(NomoR)를 열고 위의 txt 파일이 있는 경로를 복사하여 R 코드에서 setwd 가 있는 줄에 붙여넣습니다.
3. R 소프트웨어를 열고 수정된 R 코드(NomoR)를 실행합니다. 소프트웨어 패키지 "survival", "regplot" 및 "rms"를 사용하여 GC의 TMEM200A 발현 데이터와 임상 데이터를 사용하여 환자 생존을 예측하기 위한 예후 모델을 구성할 수 있습니다.

19. TMEM200A의 세포 배양 및 siRNA transfection

참고: 인간 STAD HGC-27 세포, SGC-7901 세포 및 인간 위 점막 상피 GES-1 세포 를 상업적으로 수득하고( 재료 표 참조), 부활시키고, Roswell Park Memorial Institute(RPMI) 1640 완전 배지(10% 신생아 태아 소 혈청 및 1% 페니실린 혼합물 포함)에서 접종하고, 37°C에서 5%_CO2 에서 배양하였다 세포 배양 인큐베이터. 배양 배지는 2-3일마다 교체되었습니다. 양호한 성장 상태의 세포를 웰당 10⁵ 세포× (2-3)에 따라 6-웰 플레이트에 접종하였다.

1. 먼저 3개의 마이크로 원심분리기 튜브를 사용하여 8μL의 transfection 시약 (T able of Materials 참조)과 200μL의 기초 배지를 각 튜브에 추가합니다. 그런 다음 각 튜브에 각각 4μg의 SiRNA1, SiRNA2, SiRNA3 를 추가합니다.
   참고: knockdown TMEM200A 위해 siRNA를 설계하고 구매했습니다( 재료 표 참조).
2. 혼합물을 3개의 마이크로 원심분리기 튜브에 완전히 혼합하고 6웰 플레이트의 3개 웰 각각에 추가합니다. 혼합물이 고르게 분포되도록 6웰 플레이트를 부드럽게 흔듭니다. 혼합물이 첨가된 3개의 웰을 SiRNA-1, SiRNA-2 및 SiRNA-3으로 라벨링합니다.
3. 세포가 4-6시간 동안 배양되면 6웰 플레이트에 있는 3개의 서브 웰에 있는 배지의 절반을 교체합니다.
   알림: 전체 배지의 절반을 교체할 때는 원래 전체 배지의 절반을 흡입하고 새 전체 배지의 절반으로 보충하십시오.
4. 24시간 내지 48시간 후, siRNA-transfection된 세포 TMEM200A 실험군으로, transfection되지 않은 세포를 음성 대조군으로 사용합니다. 세포에 대한 transfection의 효과를 평가하기 위해 정량적 실시간 중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR, 섹션 20 참조)을 수행합니다.

20. 정량적 실시간 중합효소 연쇄 반응

1. 각 하위 그룹의 세포 배양 배지를 버리고 1mL의 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 두 번 부드럽게 세척합니다.
2. RNA 분리 키트를 사용하여 전체 RNA를 분리합니다( 재료 표 참조).
3. 제조업체의 지침에 따라 cDNA Synthesis Kit를 사용하여 RNA 농도를 추정하고 1μg의 RNA로 cDNA를 합성합니다.
4. Real-Time PCR Assay System을 사용하여 GAPDH(표준화용), TMEM200A(재료 표 참조) 및 qPCR Master Mix에 대한 인간 특이적 정방향 및 역방향 프라이머를 포함하여 10μL의 반응 혼합물에서 cDNA의 10배 희석액에 대해 정량적 Real-Time PCR(qRT-PCR)을 수행합니다.
   참고: 각 실험을 세 번 수행합니다.
5. 다음 qPCR 반응 조건 사용: 초기화, 3분 동안 95°C; 변성, 10초 동안 95°C; 어닐링, 30초 동안 60°C; 및 확장, 10초 동안 80°C; 변성, 어닐링 및 확장을 40배 반복합니다. ^2-ΔΔCt 기법²⁸을 사용하여 각 유전자의 상대적 발현을 결정한다.
6. 생물학적 삼중을 얻기 위해 실험을 세 번 이상 반복하십시오.

21. 관련된 단백질 발현의 웨스턴 블롯 검출

1. 각 하위 그룹의 세포 배양 배지를 버리고 2 x 1mL의 PBS로 세포를 부드럽게 세척합니다.
2. 얼음 위에서 세포가 들어있는 6-웰 플레이트를 냉각하고 150μL의 사전 냉각된 무선 면역 침전 분석(RIPA) 용해 완충액(150mM NaCl, 0.1% Triton X-100, 0.5% 나트륨 데옥시콜레이트, 0.1% SDS, 50mM Tris-HCl pH 8.0 및 갓 첨가된 프로테아제 억제제 칵테일)을 추가합니다. 얼음 위에서 10분 동안 용해를 진행합니다.
3. 플라스틱 셀 스크레이퍼를 사용하여 접시에서 부착 셀을 제거하고 셀 용액을 사전 냉각된 마이크로 원심분리기 튜브로 섬세하게 옮깁니다.
4. 세포 용해물을 1.5 × 4 °C에서 10⁴ g 에서 10 분 동안 원심 분리합니다. 상층액을 새 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.
5. BCA 단백질 분석 키트를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 단백질 함량을 측정하십시오.
6. 각 샘플에서 30g의 단백질을 10% 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 겔에 로드하고 80V에서 0.5시간 동안 실행한 다음 120V에서 1.5시간 동안 실행합니다.
7. 겔에서 1-1.5시간 동안 300mA의 전압에서 45μm 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 멤브레인으로 단백질을 옮깁니다.
8. PVDF 멤브레인을 셰이커에 놓고 3 x 5분 동안 흔든 후 Tween 20(TBST, 20mM Tris-HCl, pH 7.4, 150mM NaCl 및 0.1% Tween 20)이 포함된 Tris-완충 식염수를 단백질 측(겔 측)이 위를 향하도록 하여 적절한 용기에 추가합니다.
9. 멤브레인을 차단 완충액( 재료 표 참조)에 넣고 실온에서 0.5시간 동안 배양합니다.
10. TBST로 멤브레인을 3 x 10분 동안 세척합니다.
11. 인산염-AKT(p-AKT; 1:1,000), 총 AKT 1:1,000, E-cadherin(E-ca; 1:1,000), N-cadherin(N-ca; 1:1,000), Vimentin 1:1,000, 달팽 이 1:1,000, TMEM200A 1:1,000, 글리세르알데히드 3-포스페이트 탈수소효소(GAPDH; 1:1,000)에 대한 1차 항체로 멤브레인을 4°C에서 밤새 배양합니다.
12. 멤브레인을 3 x 10분 동안 세척하고 토끼 또는 마우스 2차 항체(1:5,000)로 실온에서 1시간 동안 멤브레인을 배양합니다.
13. PVDF 멤브레인을 ECL 기질로 30초 동안 배양하고 이미징 시스템을 사용하여 신호를 검출합니다.

22. CCK-8 분석

1. 인간 STAD HGC-27 세포를 양호한 성장 상태로 96웰 플레이트에 파종합니다.
2. 세포 밀도가 60-70%에 도달하면 세포를 siRNA TMEM200A transfection합니다(단계 19.3에서와 같이).
3. 형질주입된 세포를 세포 밀도 5 × 10 ³/well(세포 카운터를 사용하여 생존 가능한 세포 계수)의 96웰 플레이트에 시드하고, NC 및 TMEM200A siRNA 그룹 (각 그룹에 3개의 복제 웰 포함)으로 나누고, 37°C에서 배양합니다.
4. 0, 24, 48, 72 및 96 시간 후에 CCK-8 시약을 추가하고 37 °C에서 2 시간 동안 배양합니다. 다기능 효소 라벨러를 사용하여 흡광도(450nm)를 측정합니다.

결과

다양한 암에서의 TMEM200A 발현
그림 1에서 볼 수 있듯이 먼저 다양한 데이터베이스를 통해 다양한 암에서 TMEM200A의 차등 발현 수준을 분석했습니다. 담관암(CHOL), 두경부 편평세포암(HNSC), 신투명세포암(KIRC), 신유두세포암(KIRP), 간세포암(LIHC), STAD, 갑상선암(THCA)에서 TMEM200A 발현이 인접 정상 조직과 비교하여 상승하였다. 그러나 ...

토론

TMEM200A 암세포가 증식하는 데 필수적인 TMEM 계열에 속합니다³⁸. 다양한 악성 종양에서 TMEM200A 의 다양한 발현은 주목을 덜 받았고 범암 조사에 대한 철저한 조사가 부족합니다. 그러나, TMEM 막관통 단백질군이 여러 단백질과의 상호작용을 통해 암세포를 악성으로 유지하는 데 중요할 수 있다는 증거가 계속 축적되고 있는데, 예를 들어, ROCK1/moesin에 의한 TMEM16A Ca²⁺

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-AKT antibody	Proteintech Group, Inc	60203-2-Ig
Anti-E-cadherin antibody	Proteintech Group, Inc	20874-1-AP
anti-glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) antibody	Proteintech Group, Inc	10494-1-AP
Anti-N-cadherin antibody	Proteintech Group, Inc	22018-1-AP
Anti-P-AKT antibody	Proteintech Group, Inc	66444-1-Ig
Anti-snail antibody	Proteintech Group, Inc	13099-1-AP
Anti-Vimentin antibody	Proteintech Group, Inc	10366-1-AP
AxyPrepMultisourceTotalRNAMini- prep Kit	Suzhou Youyi Landi Biotechnology Co., Ltd	UEL-UE-MN-MS-RNA-50G
BCA Protein Assay Kit	Epizyme Biotech	ZJ101L
CCK-8 reagent	MedChemExpress	HY-K0301-500T
Fetal bovine serum (FBS)	CYAGEN BIOSCIENCES (GUANGZHOU) INC	FBSSR-01021
GAPDH primer	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.		Forward primer (5’-3’): TGACATCAAGAAGGTG GTGAAGCAG; Reverse primer (5’-3’): GTGTCGCTGTTGAAG TCAGAGGAG
HighGene plus Transfection reagent	ABclonal	RM09014P
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse lgG (H+L)	Proteintech Group, Inc	SA00001-1
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit lgG (H+L)	Proteintech Group, Inc	SA00001-2
Human gastric mucosal epithelial GES-1 cells	Guangzhou Cellcook Biotech Co.,Ltd.
Human STAD HGC-27 cells	Procell Life Science&Technology Co.,Ltd
Human STAD SGC-7901 cells	Procell Life Science&Technology Co.,Ltd
MonAmp SYBR Green qPCR Mix (None ROX)	Mona (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd	MQ10101S
MonScript RTIII All-in-One Mix with dsDNase	Mona (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd	MR05101M
Omni-ECL Femto Light Chemiluminescence Kit	Epizyme Biotech	SQ201
PAGE Gel Fast Preparationb Kit	Epizyme Biotech	PG111
Penicillin-streptomycin (Pen-Strep)	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd	P1400-100
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane	Merck KGaA	IPVH00010-1
Protein Free Rapid Blocking Buffer	Epizyme Biotech	PS108P
RIPA lysis solution	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd	R0010
RPMI 1640 complete medium	Thermo Fisher Scientific	C11875500BT
Skimmed milk	Campina: Elk
TBST buffer solution	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd	T1082
The protein loading buffer	Epizyme Biotech	LT101S
TMEM200A knockdown plasmid	MiaoLing Plasmid
TMEM200A primer	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.		Forward primer (5’-3’): AAGGCGGTGTGGTGGTTCG; Reverse primer (5’-3’): GATTTTGGTCTCTTTGTCACGGTT
TMEM200A SiRNA1	MiaoLing Plasmid		Forward primer (5’-3’): ACAACTGATGATAAGACCAG; Reverse primer (5’-3’): TGTTGACTACTATTCTGGTC
TMEM200A SiRNA2	MiaoLing Plasmid		Forward primer (5’-3’): CGTGTGAATGTCAATGACTG; Reverse primer (5’-3’): GCACACTTACAGTTACTGAC
TMEM200A SiRNA3	MiaoLing Plasmid		Forward primer (5’-3’): ACAACCACAACATCTGCCCG; Reverse primer (5’-3’): TGTTGGTGTTGTAGACGGGC
Transmembrane protein 200A Antibody	Proteintech Group, Inc	48081-1
Equipment
CO2 cell culture incubator	Haier Group	PYXE-80IR
Electrophoresis instrument	Bio-RAD
Fluorescence quantitative PCR instrument	Bio-RAD
Multifunctional Enzyme Labeler	Berthold