범암 바이오마커로서의 TMEM200A 의 멀티오믹스 분석

요약

여기에서는 암에서 TMEM200A 의 생물학적 기능을 연구하기 위해 여러 생물 정보학 도구를 결합한 프로토콜을 제시합니다. 또한 생물정보학 예측을 실험적으로 검증합니다.

초록

막관통 단백질인 TMEM200A는 인간의 암 및 면역 침윤과 관련이 있는 것으로 알려져 있습니다. 여기서는 멀티오믹스 분석을 통해 일반 암에서 TMEM200A 의 기능을 평가하고, 그 결과를 확인하기 위해 위세포의 시험관 내 세포 배양을 이용하였다. 여러 인간 암 유형에서 TMEM200A 의 발현은 UCSC Xena 데이터베이스의 RNA-seq 데이터를 사용하여 평가되었습니다. 생물정보학 분석은 진단 및 예후 바이오마커로서 TMEM200A 의 잠재적인 역할을 밝혀냈습니다.

정상 위 및 암 세포주의 배양액을 배양하고 TMEM200A 녹다운했습니다. TMEM200A 의 발현 수준은 정량적 실시간 중합효소 연쇄 반응 및 웨스턴 블로팅을 사용하여 측정되었습니다. 그런 다음 체외 기능 상실 연구를 사용하여 위암(GC) 세포의 악성 행동 및 종양 형성에서 TMEM200A 의 역할을 결정했습니다. 웨스턴 블롯은 GC의 상피-중간엽 전이(EMT) 및 PI3K/AKT 신호 전달 경로에 대한 녹다운의 효과를 평가하는 데 사용되었습니다. 생물정보학 분석은 TMEM200A 가 GC에서 높은 수준으로 발현되었음을 보여주었습니다.

GC 세포의 증식은 TMEM200A 녹다운(knockdown)에 의해 억제되었으며, 이는 또한 비멘틴, N-cadherin 및 Snai 단백질을 감소시키고 AKT 인산화를 억제했습니다. PI3K/AKT 신호전달 경로는 GC 발달의 TMEM200A 매개 조절에도 관여하는 것으로 나타났다. 여기에 제시된 결과는 TMEM200A 가 EMT에 영향을 미쳐 종양 미세환경을 조절한다는 것을 시사합니다. TMEM200A 는 또한 PI3K/AKT 신호전달을 통해 EMT에 영향을 미쳐 종양 미세환경에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 범암, 특히 GC에서 TMEM200A 는 잠재적인 바이오마커 및 종양유전자가 될 수 있습니다.

서문

암은 전 세계적으로 높은 이환율과 사망률^{로 인해 전}세계적으로 인간의 건강을 위협하는 지속적인 공중 보건 문제로 부상하고 있으며1 사회에 막대한 재정적, 의료적 부담을 주고 있다². 암 표지자(cancer marker)³의 발견 덕분에 최근 몇 년 동안 암 치료의 상당한 발전이 이루어졌으며, 연구자들은 암 치료를 위한 새로운 진단 방법과 신약을 개발했습니다. 그러나 일부 암 환자는 약물 내성, 약물 부작용, 화학적 민감성 등의 요인으로 인해 예후가 좋지 않다⁴. 따라서 초기 암의 스크리닝과 치료를 위한 새로운 바이오마커 식별이 시급하다⁵.

막 단백질은 세포와 세포소기관막에 결합하고 통합할 수 있는 단백질이다⁶. 이들은 막에 대한 결합 강도와 그 위치에 따라 지질 고정 단백질, 통합 단백질 및 말초 막 단백질의 세 가지 범주로 그룹화 할 수 있습니다 ^7,8. 막관통(TMEM) 단백질은 적어....

프로토콜

1. 암 게놈 아틀라스(TCGA) 데이터베이스

참고: TCGA(Cancer Genome Atlas) 데이터베이스에는 서로 다른 종양 조직에 있는 유전자의 염기서열 분석 데이터가 포함되어^{있다 14}. TPM(part per million) 형식당 TMEM200A 전사체 연구를 위한 TCGA의 RNA-seq 데이터는 UCSC Xena 웹사이트¹⁵ (https://xenabrowser. net/datapages/)에서 추출하고 샘플 간의 발현을 비교하기 위해 변환된 log2를 추출했습니다.

1. UCSC Xena 웹 사이트 인터페이스로 이동합니다.
2. Launch Xena 탭을 클릭합니다.
3. 화면 상단의 DATA SETS 탭을 클릭합니다.
4. 이 페이지의 129개 코호트와 1,571개의 데이터 세트에서 탭을 클릭하면 GDC TCGA 급성 골수성 백혈병(LAML), GDC TCGA 부신피질암(ACC),....

토론

TMEM200A 암세포가 증식하는 데 필수적인 TMEM 계열에 속합니다³⁸. 다양한 악성 종양에서 TMEM200A 의 다양한 발현은 주목을 덜 받았고 범암 조사에 대한 철저한 조사가 부족합니다. 그러나, TMEM 막관통 단백질군이 여러 단백질과의 상호작용을 통해 암세포를 악성으로 유지하는 데 중요할 수 있다는 증거가 계속 축적되고 있는데, 예를 들어, ROCK1/moesin에 의한 TMEM16A Ca²⁺

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-AKT antibody	Proteintech Group, Inc	60203-2-Ig
Anti-E-cadherin antibody	Proteintech Group, Inc	20874-1-AP
anti-glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) antibody	Proteintech Group, Inc	10494-1-AP
Anti-N-cadherin antibody	Proteintech Group, Inc	22018-1-AP
Anti-P-AKT antibody	Proteintech Group, Inc	66444-1-Ig
Anti-snail antibody	Proteintech Group, Inc	13099-1-AP
Anti-Vimentin antibody	Proteintech Group, Inc	10366-1-AP
AxyPrepMultisourceTotalRNAMini- prep Kit	Suzhou Youyi Landi Biotechnology Co., Ltd	UEL-UE-MN-MS-RNA-50G
BCA Protein Assay Kit	Epizyme Biotech	ZJ101L
CCK-8 reagent	MedChemExpress	HY-K0301-500T
Fetal bovine serum (FBS)	CYAGEN BIOSCIENCES (GUANGZHOU) INC	FBSSR-01021
GAPDH primer	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.		Forward primer (5’-3’): TGACATCAAGAAGGTG GTGAAGCAG; Reverse primer (5’-3’): GTGTCGCTGTTGAAG TCAGAGGAG
HighGene plus Transfection reagent	ABclonal	RM09014P
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse lgG (H+L)	Proteintech Group, Inc	SA00001-1
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit lgG (H+L)	Proteintech Group, Inc	SA00001-2
Human gastric mucosal epithelial GES-1 cells	Guangzhou Cellcook Biotech Co.,Ltd.
Human STAD HGC-27 cells	Procell Life Science&Technology Co.,Ltd
Human STAD SGC-7901 cells	Procell Life Science&Technology Co.,Ltd
MonAmp SYBR Green qPCR Mix (None ROX)	Mona (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd	MQ10101S
MonScript RTIII All-in-One Mix with dsDNase	Mona (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd	MR05101M
Omni-ECL Femto Light Chemiluminescence Kit	Epizyme Biotech	SQ201
PAGE Gel Fast Preparationb Kit	Epizyme Biotech	PG111
Penicillin-streptomycin (Pen-Strep)	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd	P1400-100
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane	Merck KGaA	IPVH00010-1
Protein Free Rapid Blocking Buffer	Epizyme Biotech	PS108P
RIPA lysis solution	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd	R0010
RPMI 1640 complete medium	Thermo Fisher Scientific	C11875500BT
Skimmed milk	Campina: Elk
TBST buffer solution	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd	T1082
The protein loading buffer	Epizyme Biotech	LT101S
TMEM200A knockdown plasmid	MiaoLing Plasmid
TMEM200A primer	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.		Forward primer (5’-3’): AAGGCGGTGTGGTGGTTCG; Reverse primer (5’-3’): GATTTTGGTCTCTTTGTCACGGTT
TMEM200A SiRNA1	MiaoLing Plasmid		Forward primer (5’-3’): ACAACTGATGATAAGACCAG; Reverse primer (5’-3’): TGTTGACTACTATTCTGGTC
TMEM200A SiRNA2	MiaoLing Plasmid		Forward primer (5’-3’): CGTGTGAATGTCAATGACTG; Reverse primer (5’-3’): GCACACTTACAGTTACTGAC
TMEM200A SiRNA3	MiaoLing Plasmid		Forward primer (5’-3’): ACAACCACAACATCTGCCCG; Reverse primer (5’-3’): TGTTGGTGTTGTAGACGGGC
Transmembrane protein 200A Antibody	Proteintech Group, Inc	48081-1
Equipment
CO2 cell culture incubator	Haier Group	PYXE-80IR
Electrophoresis instrument	Bio-RAD
Fluorescence quantitative PCR instrument	Bio-RAD
Gel Imaging System (Tanon 5200)	Tanon Science & Technology Co., Ltd	LAB-0002-0007-SHTN
Multifunctional Enzyme Labeler	Berthold